材料和试剂
1.成像室8孔，玻璃底部（Nunc，Lab-Tek，目录号：155411PK）
2.玻璃盖玻片d = 5毫米，厚度为0.13-0.16毫米（Fisher Scientific ，目录号：11888372）
3. 10厘米P etri盘（Fisher Scientific，Nunc，目录号：150350）
4.培养瓶T25（Greiner Bio One ，目录号：690160）
5.透析用玻璃烧杯
6.透析管，用于小体积透析；MWDa 8,000 Da的透析膜（GE Healthcare，目录号： 11520694）

7. DMEM –高葡萄糖，4500 mg / L葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D5796）
8.胎牛血清，FCS（Fisher Scientific，Gibco，目录号：26140079）
9. L-谷氨酰胺（Sigma，目录号：G7513）
10.青霉素-链霉素（西格玛，目录号：P4333）
11.胰蛋白酶-EDTA（Sigma，目录号：59427C）
12.大鼠尾部胶原I，在0.02N乙酸中，浓。大约 10 mg / ml（Corning，目录号：354249），在4°C下储存
13. HEPES溶液（Sigma，目录号：H3662）
14.纤连蛋白（Merck Millipore，目录号：FC010）
15.碳酸氢钠（NaHCO 3 ），粉末（Sigma，目录号：S5761）
16.用于细胞培养的7.5％碳酸氢钠溶液（Fisher Scientific，Gibco，目录号：25080094
17. 1 M氢氧化钠（NaOH）溶液（Sigma，目录号：S2770）
18.冰醋酸（西格玛，目录号：A6283）
19. 1x PBS；缺乏CaCl 2和MgCl 2 （Gibco，目录号：14190-094）
20. D（-）-核糖（AppliChem，Biochemica，目录号：A2219.0050）
21. Cy5单活性染料（Amersham，GE Healthcare，目录号：PA25001）
22.完全中等（请参阅食谱）
23. 0.5 M核糖储备溶液（请参阅食谱）
24. 0.1 M碳酸氢钠（请参阅食谱）
25. 0.1％乙酸（请参阅食谱）
26. Cy5标记的胶原蛋白（请参阅食谱）
27.柔软而僵硬的胶原蛋白基质（请参见食谱）

设备

高架管旋转器（Fisher Scientific ，目录号：11496548）
磁力搅拌器（Fisher Scientific ，目录号：11936558）
离心机（Starlab ，目录号：SLN2631-0007）
冰桶
倒置共焦显微镜（例如，Ti Eclipse上的Nikon A1R），带有适当波长的激光（488 nm，561 nm）
浸水物镜（例如40倍尼康Apochromat LWD WI，1.15 NA）
格子光片显微镜（我们在珍妮莉亚研究园区高级成像中心AIC内使用了该仪器）

软件

尼康NIS Elements Software可在Ti Eclipse上运行尼康A1R
LabView将在AIC上操作莱迪思光片显微镜原型

程序

另请参阅图1，了解步骤A至F的时间表。

时间线

该过程的主要步骤在图1所示的时间轴中进行了概述。

图1.主要协议步骤的时间表。该时间表概述了该协议的主要步骤。突出显示了可选步骤。LLSM，点阵光片显微镜。

用于成像的胶原蛋白标记（图2 ，另见“配方”部分，表1）
准备0.1 M碳酸氢钠（pH = 9.3）并冷却至4°C。
将900 µl的0.1 M碳酸氢钠加到一个Cy5管中（包含足够的染料以标记1 mg的蛋白质），然后添加100 µl的胶原蛋白储备液。
罗塔岛TE用于在开销转子在4℃下30分钟（冷室，4℃）。
将胶原染料溶液转移到预冷的透析管中，然后将其放入装有500 ml预冷0.1％乙酸（用ddH 2 O制备）的烧杯中。
使用磁力跳蚤和磁力搅拌器在低速下于4°C透析标记的胶原蛋白24小时。在24 h透析期间，将乙酸溶液交换4-5次至新鲜的0.1％乙酸（24 h最少更换4次）。保持黑暗。
将标记的胶原转移到1.5 ml Eppendorf管中，并在4°C的黑暗环境中存储。该溶液最多可保存一周，而不会影响聚合反应和标记效率。
在制备3D基质之前，将2.5％的未染色胶原蛋白（干重，请参见表1的计算示例）替换为Cy5染色的胶原蛋白（原液的1:10稀释），然后计算新的浓度（表1）。图1显示了使用40倍尼康Apochromat LWD WI物镜（1.15 NA）进行共焦反射显微镜（488激光激发和482/35滤光镜用于反射光;左）和Cy5标记的胶原蛋白（640nm激光激发和成像）对聚合的胶原成像一个Cy5的过滤器来测量发射670之间的光的荧光- 700;右侧）。

FIGUR ê 2 。倒置凸面显微镜上成像的含Cy5标记胶原蛋白的3D矩阵的图像示例。将Cy5标记的胶原蛋白与未标记的胶原蛋白混合，制备2 mg / ml 3D胶原蛋白基质。将凝胶浇铸在8孔成像室中，以使用倒置显微镜进行成像。Cy5通道（红色）显示在右侧，使用共聚焦反射显微镜（左）显示总胶原蛋白。

通过非酶糖基化修饰胶原蛋白
在这里，葡萄糖代谢产物核糖用于通过糖化作用在胶原纤维之间产生分子间的交联，从而改变基质的硬度（图3 ）。

通过将核糖溶解在PBS或无血清的无酚红DMEM中来制备0.5 M核糖原液，并置于冰上。
确定您想要在3D矩阵中获得的刚度变化。作为指导，200 mM核糖会将刚度从未修饰的凝胶中的〜200 Pa更改为在核糖修饰的凝胶中的〜800 Pa。已显示核糖浓度的增加导致刚度线性增加（Roy等，2010；Mason等，2013）。
混合胶原原液与核糖溶液中以获得终浓度核糖例如，在冰上的200mM孵育最少30分钟（重新计算在稀释的胶原浓度）。
将胶原蛋白储备液放在冰上，直到进行基质制备。

图3.通过共焦反射显微镜观察的3D胶原蛋白基质。使用核糖诱导的糖基化作用使胶原纤维交联，并在共聚焦显微镜上成像。图像突出显示了通过糖基化诱导的胶原纤维交联增加的基质修饰。比例尺= 10 µm。

底部玻璃腔载玻片或玻璃盖玻片的涂层可防止3D矩阵分离
在涂上胶原蛋白之前，请使用清洁的玻璃盖玻片或玻璃底腔室载玻片。
放置在10cm盖玻片P ETRI培养皿并孵育以1：在4℃下在乙酸100稀释的胶原蛋白（0.1毫克/毫升的胶原蛋白在0.1％乙酸）处理过夜。
去除胶原蛋白涂层溶液，并用1x PBS洗涤2-3次。
商店盖玻片（于10cm P ETRI皿）在4℃下（用PBS覆盖或室载玻片长达一周），使用作为碱的三维基质制剂之前。

细胞培养和成像准备
在37°C下快速融化癌细胞的等分试样（我们使用用GFP-fascin重构的fascin敲低HeLa细胞，在培养基中加10％DMSO冷冻），并将1 ml细胞加入6 ml预热的无酚红的高葡萄糖中DMEM补充有10％FCS，1％谷氨酰胺和1％Pen / Strep。
在标准条件下（37°C，5％CO 2和95％湿度）过夜培养细胞，第二天更换培养基。
每2-3天（约70-80％汇合）对细胞进行传代培养，并将HeLa细胞的密度范围保持在每个T25烧瓶1 x 10 6 -3 x 10 6个细胞之间，直到它们从冻融过程中恢复。
要用胰蛋白酶消化细胞，请除去培养基，用1x PBS短暂洗涤，然后在1-2 ml的0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液中于37°C孵育细胞（直到约80-90％的细胞从培养瓶中分离出来）。
加入新鲜的，完全补充的DMEM（>胰蛋白酶-EDTA溶液体积的5倍），取等分试样进行成像，然后将其他细胞1：4继代培养。
旋转细胞等分试样，以2000 rpm（500 x g ）成像4分钟，然后将细胞沉淀重悬于完全培养基中。
计数细胞，将细胞密度调整至1 x 10 6 -2 x 10 6细胞/ ml，并置于冰上，直到制备3D基质。

具有嵌入式细胞的3D胶原纤连蛋白基质的制备（图4 ，另见配方部分，表2）
选择所需的最终体积和基质/细胞溶液的特性（染色，未染色，刚度）。
通常，将胶原蛋白工作溶液制成两倍浓度，然后与细胞悬液1：1混合。
准备2x胶原蛋白工作溶液，其中包含40 mM HEPES （与细胞悬液混合后最终浓度为20 mM），40 µg / ml纤连蛋白（最终浓度为20 µg / ml），用于TC的0.6 ％碳酸氢钠（最终百分比为0.3％），无血清，无酚红的DMEM和NaOH中和溶液的pH值。使用20 mM NaOH在0.02 N乙酸中中和胶原蛋白储备溶液（以将要添加的胶原蛋白储备溶液的体积来计算，以制备胶原蛋白工作溶液），并始终根据实际乙酸体积进行计算。请注意，胶原蛋白溶液中的最终浓度将减半（如括号中所示）。
充分混合并小心地将未染色或染色的胶原蛋白或核糖修饰的胶原蛋白添加到混合物中。尽量避免气泡！气泡会影响3D胶原蛋白基质结构的均质性并影响嵌入式细胞。这可能会因折射率的变化而对图像质量产生不利影响。
小心缓慢地上下移液，将最终的胶原蛋白工作溶液1：1与制备并冷却的细胞溶液混合。
保持5之间的最终细胞密度X 10 5 - 1 X 10 6个细胞/ ml凝胶图像的单个细胞在三维矩阵（图3以聚合的胶原基质的单个癌细胞）。
立即将胶原细胞混合物转移到预涂的成像皿中（每8孔腔室150-200 µl），或将10 µl移液到置于12孔板中的预涂的5 mm玻璃盖玻片上（每孔一张盖玻片）。。由于表面张力，胶原细胞混合物的液滴在5毫米的玻璃盖玻片上形成圆顶。
将混合物在培养箱中于37°C孵育30-60分钟，并使胶原蛋白聚合。请注意，胶原蛋白完全固化后会变浑浊。为避免胶原细胞混合物最终变干，可以将8孔成像皿放入加湿盒中，例如10厘米的皿中，该皿中装有浸水的组织（使用无菌水）。盖玻片与10 µl胶原细胞混合物的孵育时间可以限制为20-30分钟。
用预热的完全培养基轻轻覆盖胶原细胞基质。
在成像前将胶原蛋白凝胶基质在37°C下孵育12 h，以进行有效的糖基化反应（仅适用于基质降解活性较低的细胞）。
或者，在准备基质之前，在0.1％乙酸中制备核糖，并在4 °C下与胶原蛋白孵育2-3天（Roy等，2010）。在这种情况下，需要将用于中和乙酸的NaOH的量调整至胶原-核糖溶液的体积。

Figu重4 。再在未染色的3D胶原基质上的癌细胞的表象图像。将表达GFP-fascin（使用橙色热LUT伪彩色）的HeLa细胞嵌入3D胶原-纤连蛋白基质中，并在Nikon Eclipse共聚焦显微镜上用水浸入40倍物镜成像。使用共聚焦反射显微镜观察胶原纤维，并以蓝色伪色。比例尺= 5 µm 。

影像学
如果没有CO 2成像，则将成像介质预热并交换为包括20 mM HEPES的完整介质。
预热成像室，让基质和细胞平衡到新的环境。
使用共聚焦显微镜对3D胶原细胞基质进行成像：
成像室中聚合的胶原细胞基质可以在带有加热室（37°C）的常规倒置共聚焦显微镜下成像。
使用40倍或60倍水浸物镜可在z轴上获得更大的成像深度（可能的成像深度≤250 µm，另请参见“有关成像的更多说明”部分）。
首先，将焦点放在玻璃盖玻片上，然后沿z向上移动50-100 µm（远离盖玻片）。这样可以将坚硬的盖玻片对细胞的潜在影响降至最低。
未染色的胶原纤维可以使用共聚焦反射进行可视化，染色的胶原纤维可以使用相应的激光和检测设置进行可视化。
使用Lattice Light Sheet microscop e（LLSM，图5 ）对3D胶原细胞基质进行成像：
使用5 mm盖玻片上的胶原细胞基质在LLSM上成像。
在37°C和5％CO 2的完全培养基中成像之前，必须将具有基质的盖玻片固定在支架上。

图URE 5 。拉ttice光片显微镜成像。对于我们的实验，我们使用了位于Janelia Research校园高级成像中心的Lattice Light Sheet显微镜。显微镜设置显示在左侧，3D细胞的典型图像显示在右侧。

有关成像的更多评论

几种显微镜，例如共聚焦显微镜，结构照明显微镜（SIM）和光片显微镜，可用于在3D胶原蛋白基质中对细胞进行成像，所有技术都有其自身的局限性和优势。我们已成功地将共聚焦显微镜用于短时电影（长达20分钟）中以3D模式表达荧光标记蛋白的细胞。但是，由于光致漂白和光毒性，无法进行更长的成像。同样，荧光标记蛋白的低表达水平以及高帧频和激光功率可能进一步对成像长度产生不利影响。晶格光片显微镜克服了其中的一些问题，因为激光照度低且光更聚焦。这样可以对细胞进行长期成像（长达数小时），并且光漂白和光毒性低。此外，当使用LLSM代替共聚焦显微镜时，可以提高分辨率。两种成像技术的主要缺点是解析3D结构的速度，特别是当必须在3D的高动态细胞中检测到多个荧光团时。作为替代方案，可以使用3D-SIM，因为与其他两种方法相比，它可以实现快速3D成像和高分辨率。

应特别注意用于3D矩阵中的细胞成像的物镜和浸没介质。为了优化分辨率，该分辨率受光的衍射限制，样品（在我们的情况下是胶原细胞水溶液）和浸入介质的折射率应匹配。由于浸没介质和水性3D矩阵之间的折射率变化，不匹配会导致球差，最终会显着降低分辨率。可以使用几种浸入介质，并且所有浸入介质都具有特定的折射率n，例如硅油（n = 1.4），甘油（n = 1.47），油（n = 1.52），水（n = 1.33）和空气（n = 1 ）。由于3D胶原蛋白基质是水性的，因此与其他产品相比，水浸物镜可在z方向（轴向）上提供更高的分辨率，并在有限的球差下实现高穿透深度。当随着z成像深度的增加，光的畸变增加时，当对距离盖玻片较远的细胞或胶原纤维进行成像时，这一点尤其重要。

数据分析

为了对延时图像序列进行可视化，电影生成（请参见视频1，例如胶原蛋白中3D渲染的细胞），3D渲染和跟踪，我们建议您探索以下在我们自己的分析中发现非常有用的软件平台：

开源软件：

ImageJ / FiJi（https://imagej.net/Fiji）（Schindelin等人，2012年）
ICY（http://icy.bioimageanalysis.org/）（de Chaumont等人，2012年）
ZeroCostDL4Mic（https://github.com/HenriquesLab/ZeroCostDL4Mic/wiki）（von Chamier等，2020）
CellProfiler（Broad Institute，https: //cellprofiler.org/ ）
u-shape3D（https://github.com/DanuserLab/u-shape3D）（Driscoll等，2019）

商业软件：

Imaris软件（Oxford Instruments，https: //imaris.oxinst.com ）
Arivis Vision 4D（Arivis AG，https：//www.arivis.com/de/imaging-science/arivis-vision4d ）
Volocity软件（Quorum Technologies，https: //quorumtechnologies.com/volocity ）
Matlab（MathWorks，https：//de.mathworks.com/products/matlab.html ）

最近总结了用于分析和量化细胞形状，高维形态计量数据和深度学习工具的综合工具清单（Bodor等人，2020年）。

笔记

我们在研究中使用了Telocollagen（酸提取）。使用Atelocollagen（提取酶）可能会延长胶原蛋白基质完全聚合的时间，也可能会改变结构。
所有与胶原蛋白有关的工作（尤其是在使用Telocollagen时）都必须在冰上，使用预冷的溶液，试管和培养皿进行。处理时间应保持最短。
移液胶原蛋白溶液时要非常小心，以免产生气泡！
实验之间的制备时间保持恒定，以确保可重复性。未经胃蛋白酶处理的中和胶原蛋白溶液可以在4°C时开始聚合。
将3D胶原蛋白基质运输到显微镜时要小心，因为它们非常脆弱！
将介质和成像室预热至37°C，并在成像前让细胞适应新环境30分钟。
对于共聚焦反射显微镜，要检测样品中物体的反射光。在我们的协议中，胶原纤维用488 nm激光照射，并测量反射光。应当设置滤镜设置，以滤除465-500 nm范围内的反射光（我们使用515 LP滤镜，然后是482/35滤镜）。

菜谱

全中等
500毫升DMEM

50 ml热灭活的FCS

5毫升L-谷氨酰胺（100x）

5毫升Pen Strep （100x）

0.5 M核糖储备溶液（MW = 150.13 g / mol）
10 ml PBS或DMEM（不含FCS，不含酚红）

0.75克D-核糖

0.1 M碳酸氢钠（MW = 84.007 g / mol）
4.2克碳酸氢钠粉

甲DD至500ml的DDH 2 ö

甲djust pH至9.3

0.1％乙酸
999毫升ddH 2 O

1毫升乙酸

Cy5标记的胶原蛋白（表1）：
制备Cy5标记的胶原蛋白和未标记的胶原蛋白的掺入混合物的计算示例。将2.5％（干重）的未标记胶原蛋白与等量的标记胶原蛋白交换。

表1.混合染色的胶原蛋白。示出了用于制备用于3D基质制备的染色胶原蛋白的计算方案示例。

胶原蛋白染色计算

卷

胶原干重（毫克）

最终浓度

未标记的胶原蛋白储备液

975微升

9.75毫克

10毫克/毫升

2.5％Cy5标记的胶原蛋白

250微升

0.25毫克

1毫克/毫升

Cy5-胶原蛋白溶液

1225微升

10毫克

8.16毫克/毫升

固定和坚硬的胶原蛋白基质（表2）：
用于制备具有嵌入细胞的标准2 mg / ml 3D胶原蛋白基质的计算示例。显示了软和硬矩阵的计算。稀释后重新计算新的胶原蛋白浓度（例如，用于制备坚硬的胶原蛋白或标记的胶原蛋白，此处未显示）。

表2.具有不同机械性能的3D矩阵的制备。显示了用于制备具有嵌入式细胞的胶原-纤连蛋白基质的移液方案。显示了产生1ml的软和硬基质（200mM）的体积。

胶原蛋白矩阵计算方案

柔软的

僵硬

胶原蛋白原液

200微升

200微升

0.5M核糖溶液（在培养基中）

--

133.3微升

在冰上静置30分钟

HEPES （库存= 1 M）

20微升

20微升

纤连蛋白（原液= 1mg / ml）

20微升

20微升

1 M氢氧化钠

4微升

4微升

碳酸氢钠（7.5％溶液）

40微升

40微升

不含酚红的培养基（不含血清）

216微升

82.7微升

混合胶原蛋白工作液

1：1细胞悬浮

培养基中的细胞

500微升

500微升

胶原细胞混合物的最终体积

1000微升

致谢

这项工作的资金由医学研究理事会（MR / K015664 / 1）提供。K. Pfisterer由生物学家公司和生物化学协会进一步资助，用于旅行访问Janelia研究园区和FFG奥地利。LLSM成像实验是在霍华德·休斯医学研究所Janelia研究园区的高级成像中心进行的。先进影像中心是由戈登和贝蒂·摩尔基金会和霍华德·休斯医学研究所共同投资的合资企业。我们要感谢Henrietta Lacks用于HeLa细胞。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争性的经济利益。

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