材料和试剂
15 ml锥形离心管（任何品牌）
10 ml，开顶厚壁聚碳酸酯管，16 x 76 mm （Beckman Coulter，目录号：355630 ）
2.2毫升，敞口薄壁超清管，11 x 34毫米（贝克曼库尔特（Beckman Coulter），目录号：347356 ）
移液器技巧
60 mm细胞培养皿（EMD密理博，目录号：CLS430589）
硝酸纤维素膜（Bio- R ad，目录号：1620112）
一只8至12周大的老鼠
异氟烷，美国药典（Piramidal重症护理，目录号：66794-013-25）
Restore PLUS Western Blot剥离缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：46430）
蛋白酶抑制剂，完整片剂，不含EDTA EASYpack （Roche，目录号：04693132001）
磷酸酶抑制剂PhosSTOP EASYpack （Roche，目录号：04906837001）
兔抗Syntaxin 1抗体（1：1,000; EMD Millipore，目录号：AB5820-50UL）
小鼠抗PSD-95抗体6G6-1C9（1：1,000; Novus Biologicals，目录号：NB300-556）
小鼠抗β-Actin抗体（1：100,000; Sigma-Aldrich，目录号：A1978）
小鼠抗突触素抗体（1：1,000; EMD Millipore，目录号：MAB5258）
兔抗组蛋白H3抗体（1：1,000;细胞信号传导，目录号：4499）
IRDye 800CW驴抗兔IgG二抗（1：10,000; LI-COR，目录号：926-32213）
IRDye 680RD驴抗小鼠IgG二抗（1：10,000; LI-COR，目录号：926-68072）
拦截（TBS）阻塞缓冲区（LI-COR，目录号：927-60001）
Mini-PROTEAN TGX无污染凝胶（Bio- R ad，目录号：4568123）
鼠标手术套件（Kent Scientific，INSMOUSEKIT）
蔗糖（Fisher Chemical，目录号：S612）
Trizma底座（Sigma-Aldrich，目录号：T6066-5KG）
RIPA缓冲器（TEKnova ，目录号：R3792）
磷酸盐缓冲盐水10x（Growcells ，目录号：RGF-6235）
常规冰
Ficoll （GE Healthcare，目录号：17-0300-10）
100 mM EGTA（请参阅食谱）
10 mM Tris pH 8.1（请参阅食谱）
均质缓冲液（HB）（请参见配方）
Ficoll解决方案（请参阅食谱）
非连续Ficoll梯度（请参见食谱）
Tris-Buffer Saline（TBS）20 x （请参阅食谱）
TBS补间（TBS-T）（请参阅食谱）

设备

微量移液器套装
-80°C冷冻室
摇摆式临床离心机（Beckman Coulter）或任何温度控制与15 ml管兼容的离心机
Optima Max-XP超速离心机（贝克曼库尔特）
TLS-55摆桶式转子（贝克曼库尔特）
MLS-50旋斗式转子（贝克曼库尔特）
通用实验室搅拌器IKA EuroStar 60 Digital（Sigma - A ldrich，目录号：Z766976）
Potter- Elvehjem组织匀浆器5毫升（欧姆尼国际公司，目录号：07-358034）
用于预制凝胶预制凝胶的Mini-PROTEAN Tetra Cell（Bio- R ad，目录号：1658005EDU）
Trans-Blot SD半干电泳转移池（Bio- R ad，目录号：1703940）
奥德赛Fc成像系统（Li-COR）

软件

ImageStudio v5.2 （Li-COR）

程序

来自脑组织的SN（始终在冰上工作）
使用异氟烷在小鼠中诱导麻醉。
心内灌注小鼠冷PBS 1x。
打开头骨，取出脑膜，然后在60毫米细胞培养皿中解剖大脑皮层（或感兴趣的解剖区域）。40-100毫克的脑组织足以完成一项实验。
保存另一个半球（请参阅步骤A8）。
用小剪刀在1毫升HB中切碎组织。
匀浆组织在4ml HB的使用Potter-（匀浆1，H1）Elvehjem玻璃/特氟隆均化器。
在冰上以800 rpm的速度冲击8次。
用1 ml含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液匀浆另一个半球，在4°C下以18,000 xg离心，并用移液管回收上清液并保存在-80°C下。这将被用于制备全脑提取物（WBE），其将构成的SN富集的内部对照（见d ATA分析）。

离心分离
在摇摆式临床离心机中于4°C以2,000 xg的速度将H1匀浆5分钟。
将上清液（S1）转移到10 ml开顶厚壁聚碳酸酯管（16 x 76 mm）中，将卡片沉淀（P1），然后将S1在MLA-55固定角转子中以30,000 xg的速度离心4分钟10分钟°C以获得沉淀2（P2；该沉淀不容易破裂，因为它稠密且稠密），用移液管弃去上清液2（S2）（在冰上工作）。
通过移液几次（在冰上工作）将P2重悬于400 µl HB（匀浆2； H2）中。

非连续Ficoll梯度
层中的H 2在一个5的顶部- 10.3％的不连续的Ficoll梯度（配方4）和离心机中以45000 ×g下在用Beckman的Optima最大-XP桌面超速离心机一个TLS-55转子20分钟在4℃下。
收集400 μ升在5-10.3％白色层的聚蔗糖包含的SN接口。
（图1；该部分也可用于其他操作或分析，例如分离突触前末端，突触小泡和突触后末端，以及流式细胞仪，组学和电子显微镜检查）。

图1.步骤C1结束时的2.2 ml开顶薄壁超透明管。请注意，包含SN的白色5％/ 10.3％白色界面带将在步骤C2中收集。沉淀物主要包含线粒体和细胞碎片。

1,400个完整卷 μ升HB的。
离心30,0所述SNS层00 ×g离心10分钟，在TLS-55转子用Beckman的Optima最大-XP桌面超速离心机在4℃下。然后，使用一个200 μ升连接到真空吸管尖端除去上清液（颗粒不容易破坏，因为是致密的和厚的SNS）。
重悬使用150所述SNS沉淀μ升RIPA缓冲液含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂存储在-80℃。

数据分析

运行SDS-PAGE
使用实验室常规规程定量蛋白质。
安装预制凝胶和负载10 μ克SNS，WBE（内部对照）的，和分子量标记。
运行凝胶。

免疫印迹和解释
将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。
用封闭缓冲液封闭膜。
在55至72 kDa分子量标记之间切膜。
用抗PSD-95抗体孵育上半部分。
用抗语法1和突触素的抗体孵育下半部分。
在4°C轻轻搅拌下孵育过夜。
使用TBS-T，并与特定的孵育他们洗膜LI-COR的第二抗体混合对于在室温下1个小时。
用TBS-T清洗膜并使用Odyssey Fc成像系统检测信号。
突触素是突触前囊泡的标志物（Kwon和Chapman ，2011 ）；Syntaxin 1检测突触前膜（Bennett等，1992 ），而PSD-95是突触后区室的支架蛋白（Hunt等，1996 ）。与WBE相比，成功的手术应在SNs分数中丰富突触前和突触后标记（图2）。

图2 。代表性的蛋白质印迹分析。全脑提取物（WBE）和synaptoneurosomes从C57小鼠的大脑皮层制得并用抗抗体进行免疫印迹（SNS）突触1，突触素，PSD-95 ，和组蛋白H3。

在室温下使用Restore PLUS Western Blot Stripping Buffer 20分钟，从膜上去除抗体信号。
用TBS-T清洗膜。
将膜下半部分在4°C下孵育过夜，并用抗H3和β-肌动蛋白的抗体轻轻搅动。
使用TBS-T，并与特定的孵育他们洗膜LI-COR的第二抗体混合对于在室温下1小时。
使用Odyssey Fc成像系统检测信号。
H3是核标记；β-肌动蛋白是一个加载控件。SN应该对β-Actin具有免疫反应性，但对H3不具有免疫反应性（图2）。

笔记

该协议需要实验室和动物手术程序的基础知识。
我们建议每一步在冰和/或4°C下工作。
对于此协议，我们使用了8周大的C57bl / 6J雄性小鼠。但是，我们还用它来分离了3天和12个月大的雄性和雌性小鼠的突触神经小体。据我们所知，菌株和遗传背景不是该方法的限制。
对于一个实验点，40-100 mg的组织就足够了，但是，可以通过使用较小的试管和/或更改Ficoll梯度的体积和/或浓度来进一步减少该量。
根据我们的经验，WBE和SNS可以被存储为在-80℃下至少1年。我们建议使用小等分试样以避免冻融循环。
根据我们的经验，在准备好以下解决方案后，它们可以保存至少一年。

菜谱

100毫米EGTA
将3.8 g EGTA溶于100 ml 10 mM Tris pH 8.1中
将溶液储存在室温下
10 mM Tris，pH 8.1
溶解2.42克的的Trizma碱在1.8升的的MilliQ等级H 2 ö
根据需要用HCl / NaOH调节pH值8.1
加水获得2升最终体积
室温保存
HB（0.25 m蔗糖/0.5 mM EGTA缓冲液，溶于10 mM Tris中，pH 8.1）
对于1 L：85.57 g蔗糖，10 ml Tris pH 8.1中的5 ml 100 mM EGTA，储存在4°C
将蛋白酶和磷酸酶抑制剂添加到50 ml HB中
Ficoll解决方案
5％菲科尔
D将5 g Ficoll溶于100 ml HB

使用过滤器0.22 μ米孔径，储存在4℃下

14.5％菲科尔
D将14.5 g Ficoll溶于100 ml HB

使用0.22滤波器μ米孔径，储存在4℃下

10.3％菲科尔
中号IX 865 μ升的聚蔗糖14.5％和345 μ升HB的（对于两个样品），准备在同一天

非连续Ficoll梯度
Ñ OTE ：P repare梯度之前开始实验或在小号TEP B2 。

加入500 μ升10.3％聚蔗糖溶液成开顶薄壁超清晰管（11 x 34英寸MM）
使用最平滑的1 ，000 μ升可用吸管或200 μ升移液管，缓慢加入1300 μ升的5％聚蔗糖溶液（5％/ 10.3％接口应该是可见的，如果不是，则丢弃该梯度，并使用一个重新开始清洁管）
TBS 20x 2升
将96 g Trizma碱和352 g NaCl溶于1 L的Ficoll 5％：溶解5 g的M illi Q级H 2 O
根据需要用HCl / NaOH调节pH 7.6
加水获得2升最终体积
Tris缓冲盐水吐温1 x
稀TBS 20X 1倍与中号ILLI Q等级H 2 ö
加入吐温20以获得0.1％的最终浓度

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院补助金NS-NS091201，退伍军人管理局优秀奖IO1BX003441（补助金）和美国心脏协会博士后奖学金19POST34380009（补助金）的部分支持。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争性的经济利益。

伦理

实验得到美国佐治亚州亚特兰大市埃默里大学的机构动物护理和使用委员会（协议编号PROTO201700559，日期为1/28/2020至1/27/2023）批准。

参考文献

Bennett，MK，Calakos ，N。和Scheller ，RH（1992）。Syntaxin：一种突触蛋白，与突触小泡对接在突触前活性区有关。科学257（5067）：255-259。
Chasin ，M.，Mamrak ，F.和Samaniego，SG（1974）。豚鼠脑中无细胞激素响应腺苷酸环化酶的制备及其性质。Ĵ神经化学杂志22（6）：1031至1038年。
Diaz，A.，Merino，P.，Manrique，LG，Ospina，JP，Cheng，L.，Wu，F.，Jeanneret ，V.和Yepes ，M.（2017）。神经元尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）与星形胶质uPA受体（uPAR）之间的相互促进在缺血性脑中促进星形胶质细胞活化和突触恢复。Ĵ神经科学37（43）：10310-10322。
Diaz，A.，Merino，P.，Manrique，LG，Cheng，L.和Yepes ，M.（2019）。尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）通过ezrin介导的外周星形细胞过程的形成，保护了缺血性脑中的三联突触。Ĵ Cereb血流代谢39（11）：2157至2171年。
Diaz，A.，Merino，P.，Guo，JD，Yepes ，MA，McCann，P.，Katta，T.，Tong，EM，Torre，E.，Rangaraju ，S.和Yepes ，M.（2020）。尿激酶型纤溶酶原激活物从保护可溶性大脑皮层神经甲β诱导的突触损害。Ĵ神经科学40（21）：4251-4263。
Halassa ，MM，Fellin ，T。和Haydon，PG（2007）。三方突触：神经胶质传递在健康和疾病中的作用。趋势医学杂志13（2）：54-63。
霍林斯沃思（EB），麦克尼尔（McNeal），美国东部（ET），伯顿（Burton），JL，威廉姆斯（RJ），戴利（Daly），JW和克里夫林（Creveling ）C.R.（1985）。豚鼠大脑皮层中过滤的突触神经质体制剂的生化特征：环腺苷3'：5'-一磷酸生成系统，受体和酶。Ĵ神经科学5（8）：2240至2253年。
AS的Horn和OT的Phillipson（1976）。大鼠边缘前脑中的一种去甲肾上腺素敏感的腺苷酸环化酶：激动剂，肾上腺皮质激素和抗精神病药的制备，性质和作用。Eur J Pharmacol 37（1）：1-11。
亨特，加州，申克，LJ和肯尼迪，MB（1996）。PSD-95与前脑突触中的突触后密度相关，而不与突触前膜相关。Ĵ神经科学16（4）：1380至1388年。
Kwon，SE和Chapman，ER（2011）。突触素调节中枢神经元中突触小泡内吞的动力学。神经元70（5）：847-854。
Rao，A。和Steward，O。（1991）。突触后膜特化的蛋白质成分是局部合成的证据：分析突触体内合成的蛋白质。Ĵ神经科学11（9）：2881至2895年。
Villasana ，LE，Klann ，E。和Tejada-Simon，MV（2006）。从成年小鼠海马中快速分离突触神经小体和突触后密度。Ĵ神经科学方法158（1）：30-36。