材料和试剂
1. SunGro Sunshine LC1种植者土壤混合料（SUN52128CFLP）
2.精美的任务湿巾（Kimberly-Clark，目录号：06-666）
3. 100K MWCO Amicon旋转过滤器（MilliporeSigma ，目录号：UFC510024）
4. PVDF膜，预切割，7 × 8.4 cm（Bio-Rad，目录号：1620174）
5.无菌注射器式滤器（0.45 μ米; VWR，目录号：28145-481）
6.微量离心管（1.5 ml； VWR，目录号：89000-028）
7.锥形管（50毫升； Olympus，目录号：28-106）
8.移液管头（低保留10 μ升，200 μ升，1000个μ升过滤嘴;美国科学，产品目录号：1181-3710，1180-8710，1182年至1730年）
9.扩展长度吸管头（1000 μ升;的Eppendorf，目录号：0030073614）
10. ＃1显微镜盖玻片（Fisher Scientific，目录号：12-542B）
11.显微镜载玻片（VWR，目录号：16004-422）
12.注射器（1 ml； BD，目录号：14-823-434）
13. Mini Trans-Blot滤纸（Bio-Rad，目录号：1703932）
14. EasyStrip ，Plus PCR试管（Thermo Scientific，目录号：AB2005）
15.植物种子（mGFP5本氏烟草是从加州大学伯克利分校的Staskawicz实验室获得的，mGFP5植物在花椰菜花叶病毒35S启动子的控制下组成型表达靶向ER的GFP）
16.山羊抗兔辣根过氧化物酶结合抗体（Abcam，目录号：ab205718）
17.抗GFP抗体，ChIP级（Abcam，目录号：ab290）
18. HiPCO SWNT（NanoIntegris ，超纯，目录号：HS28-037）
19. MilliQ水
20.无核酸酶的水（Qiagen，目录号：129114）
21.氯化钠NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9888-500G）
22.盐酸HCl（37％[ vol / vol ] ； Sigma，目录号：320331）
23.单链RNA寡核苷酸，包括有义和反义siRNA链– 21个核苷酸（Integrated DNA Technologies，IDT）
24.十二烷基硫酸钠，分子生物学等级（Sigma-Aldrich，目录号：436143-100G）
25. Tris / HCl（Sigma-Aldrich，目录号：10812846001）
26. EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E9884-100G）
27. NP-40（Sigma-Aldrich，目录号：492016-100ML）
28.甘油（西格玛奥德里奇，目录号：G5516-500ML）
29. Pierce 660 nm蛋白测定（Thermo，目录号：22660）
30. iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，目录号：1708891）
31. PowerUp SYBR绿色预混料（Applied Biosystems，目录号：A25742）
32. Qubit蛋白测定（ThermoFisher Scientific，目录号：Q33211）
33. RNeasy植物迷你套件（QIAGEN，目录号：74904）
34. BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A4737-25G）
35. TWEEN20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416-100ML）
36.过硫酸铵，APS（Sigma，目录号：248614-100G）
37.低范围超琼脂糖（Bio- R ad，目录号：1613107）
38. ECL Prime Western印迹系统（MilliporeSigma ，目录号：GERPN2232）
39. TEMED（N，N，N，N'-四甲基乙二胺; Sigma，目录号：T9281）
40.甘氨酸（西格玛，目录号：G8898）
41.甲醇（西格玛，目录号：179957）
42. 4 × Laemmli样品缓冲液（Bio- R ad，10 ml，目录号：1610747）
43.液氮
44. SYBR金核酸凝胶染色剂（Invitrogen，目录号：S11494）
45. 30％丙烯酰胺/双酚19：1（Bio- R ad，目录号：1610154）
46.蛋白酶抑制剂混合物（Sigma，目录号：P9599-1ML ）
47. 0.1 M NaCl（请参阅食谱）
48. 10％（wt / vol）过硫酸铵溶液（APS）（请参阅食谱）
49. 10 ×传输缓冲区（请参阅食谱）
50. 1 ×传输缓冲区（请参阅食谱）
51. 10 × Tris缓冲盐（TBS）缓冲液（1 M Tris，1.5 M NaCl，pH 7.4）（请参见食谱）
52. 1 × TBS T缓冲区（请参阅食谱）
53.裂解缓冲液（请参见食谱）

设备

分析天平（Radwag ，型号：AS 60 / 220.R2）
超声波浴（Branson，型号：15-336-100）
超声波均化器以6毫米尖端（Cole-Parmer公司，米Odel等小号：UX-04711-70，UX-04712-14）
涡旋混合器（Fisher Scientific，型号：02-215-365）
pH计（Spectrum，型号：242-97839）
轨道振动筛（Waverly，型号：S1CE）
NanoVue Plus分光光度计（GE生命科学，型号：28-9569-61）
可见分光光度计（Thermo Scientific，型号：14-385-445）
近红外光谱仪（Princeton Instruments IsoPlane 320与液氮冷却的InGaAs像素的PyLoN -IR 1D阵列进行液氮冷却）
紫外可见近红外分光光度计（Shimadzu ，型号：UV-3600 Plus）
台式离心机（Eppendorf，目录号：5418000017）
离心机（Eppendorf，型号：5424R）
镊子（VWR，目录号：63042-518）
剪刀（VWR，货号：82027-582）
研钵和杵（Cole-Parmer，目录号：EW-63100-54）
裤子生长室（HiPoint ，型号：740 FHLED）
凝胶图像分析系统（台风FLA 9500，GE Healthcare Services）
电泳电源（PowerPac基本电源； Bio-Rad，目录号：1645050）
Mini Trans-Blot Cell（Bio- R ad，货号：1703811）
迷你蛋白TGX凝胶（Bio- R ad ，目录号：456-1094）
ChemiDoc XRS +系统（Bio- R ad，目录号：1708265）
共焦显微镜（Zeiss ，型号：LSM 710）
Thermal Cycler CFX96触摸实时PCR检测系统（Bio- R ad，目录号：1855195）
热循环PCR（Applied Biosystems Veriti 96-Well，目录号：4375786）

软件

GraphPad Prism 7.0a（https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/）
斐济ImageJ 2.0.0（https://imagej.net/Fiji/Downloads）
Zen Blue 2.6（https://www.zeiss.com/microscopy/us/downloads.html）

程序

植物生长
发芽转基因mGFP5烟草本塞姆氏种子（见注1），并生长在种子SunGro阳光LC1种植者土壤结构实验之前，在生长室4至6周。对于生长中的植物，在24 °C下使用12 h光照，在18 °C下使用12 h黑暗。

注意：不同的植物物种可能需要不同的发芽和生长条件。

siRNA设计和生成
当前，有许多软件可以设计出具有最小脱靶效应的基因特异性siRNA序列。可以在植物中使用最近开发的称为“ siRNA-Finder（si -Fi）软件”的软件（Lück等，2019）。
在设计siRNA序列后，可以从Integrated DNA Technologies（IDT）购买有义和反义RNA链，作为单链寡核苷酸。

RNA-SWNT制备
将有义和反义siRNA链溶于浓度为100 mg / ml的0.1 M NaCl中。
添加1毫克干燥的HiPCO单壁碳纳米管以20微升溶解义RNA，并完成溶液体积为1 ml的用0.1M的NaCl（见注2）。
在室温下在超声浴（布兰森）中将混合物浴超声处理10分钟。
探针尖端在冰浴中以3 ％尖端以50％振幅（〜7W）超声处理混合物30分钟。如果在超声处理期间冰浴开始融化，请对其进行更新以防止加热。
将溶液在室温下静置30分钟。
离心该溶液在16，100 ×克为1个小时在室温下除去捆绑的SWNT。上清液包含单独悬浮的正义RNA-SWNT。保留上清液并将SWNT沉淀物丢弃到有害的纳米材料废物中。
对反义RNA链重复相同的方案（请参见注释3）。将RNA-SWNT解决方案存储在4 ° C。

去除未结合的siRNA
加入500微升有义RNA-SWNT和500微升反义RNA-SWNT成两个单独的100K的Amicon旋转过滤器被放置在2个毫升收集管中。离心机在8 4分钟，000 ×克在室温。
将有义RNA-SWNT和反义RNA-SWNT的流通物收集在单独的试管中，然后将自旋过滤器放入同一收集管中。
添加0.1M NaCl的入旋转过滤器，直到体积达到500微升。重复洗涤步骤。
总共执行8次洗涤以去除所有未结合的RNA分子。合并并累积所有流通液（对于有义RNA-SWNT和反义RNA-SWNT分别使用），以便以后测量去除的RNA量。
计算SWNT concent配给通过测量碳纳米管的吸光度在632nm处用分光光度计（使用2微升用于NanoVue加分光光度计或稀到1ml为Thermo Scientific）进行。用吸光度值除以0.036的SWNT消光系数，得出以μg / ml为单位的SWNT浓度（如果将样品稀释，则将吸光度值e也乘以稀释倍数）。
计算浓度的RNA上的SWNT装载通过测量收集的吸光度流通在260nm（使用2种溶液微升为NanoVue加分光光度计），并减去RNA的总量从RNA的总量除去加入（2毫克在这个案例）。
（可选）为进一步表征，请使用Shimadzu UV-3600 Plus记录有义RNA-SWNT和反义RNA-SWNT吸收光谱，并使用近红外光谱仪（Princeton Instruments IsoPlane 320与液氮冷却的Princeton耦合，记录荧光光谱）仪器InGaAs像素的PyLoN -IR 1D数组）。参见Demirer等。，2020年为SWNT吸光度和荧光光谱的代表性示例。

RNA-SWNTs浸润叶片
选择健康和充分发展的叶mGFP5烟草本塞姆氏（4-6周龄）植物的实验。
合并100微升的200 nM的有义RNA的单壁碳纳米管具有100微升的200 nM的反义RNA的单壁碳纳米管在1.5 ml的Eppendorf管中（见注4）。拌匀
在混合后立即使用移液管尖端的叶，并浸润〜100-200的远轴（下）表面上的小穿刺微升从与1空穴所述siRNA-SWNT的混合物毫升无针注射器小心不损坏叶子（请参阅注释5）。
用Kimwipe纸巾去除叶面上多余的siRNA-SWNT溶液。用沙皮笔标记渗透区域，不要损坏叶子。
渗入阴性对照溶液，例如不含SWNT的游离siRNA或未靶向目标基因的加扰的RNA悬浮SWNT。如果可能，还应浸入阳性对照溶液，例如病毒siRNA输送样品（请参见注释6）。
将已渗入的植物放回生长室，直到测量基因沉默为止。

通过定量PCR（qPCR）确定基因沉默
1.渗透后24小时，切开渗透的叶区域（每个样品最大叶组织为100 mg），并使用n RNeasy plant mini试剂盒提取总RNA 。切割叶后，立即与RNA提取协议的第一步骤中继续进行（即，使用研钵和研杵研磨该组织在液氮中），以确保基因表达水平切割后不改变。遵循RNeasy工厂迷你套件的规程（请参见注释7）。
2. RNA提取后，用分光光度计测量RNA浓度和纯度。反转录1 μ克使用的总RNA为互补DNA（cDNA）的iScript cDNA合成试剂盒。遵循iScript cDNA合成试剂盒的协议。
3.使用的上电SYBR绿色主混合物用于qPCR的步骤用2 μ升的cDNA从第2步和特异性引物对靶和管家基因。遵循PowerUp SYBR绿色试剂盒的规程，与没有SWNT或加扰的RNA-SWNT的游离siRNA阴性对照相比，对siRNA-SWNT浸润的叶子中靶mRNA的相对定量。
示例：我们qPCR的目标基因是mGFP5 （将GFP转基因插入Nb中），以及EF1 （延伸因子1）作为我们的管家（参考）基因。

4.使用ddCt方法分析qPCR数据（Rao等人，2013）。代表性的qPCR结果参见图2B。

通过共聚焦荧光显微镜成像确定基因沉默
如果使荧光蛋白（如GFP）沉默，则可使用共聚焦荧光显微镜检测近似的沉默效率。
渗透后，将完整叶浸润的植物留在生长室中72小时。
渗透后72 h，在渗透点附近切一小片（0.5-1 cm × 0.5-1 cm）的渗透叶，并准备一个带盖玻片的玻片（厚度＃1）。添加50-100 μ升水在玻璃载玻片和盖玻片用于成像之间。叶片变干之前的图像样本（最佳在15到30分钟内）。
用GFP滤光片在488 nm激光激发下对植物组织成像（在GFP沉默的情况下），如果可用，还可以用透射光捕获明场（请参见注释8）。
每个样品（包括未处理的叶片以及任何阴性和阳性对照样品）使用相同的光学设置捕获至少10至15个视野。
对于每个样品，将平均荧光强度值与未处理叶片的平均GFP荧光强度进行比较，这可用于确定siRNA-SWNT的沉默效率。注意对不同日期成像的样品使用相同的成像参数和定量分析。有关共焦成像的代表性结果，请参见图2A。

图2.代表性的基因沉默结果。A.未处理和游离-siRNA处理的对照叶片和烟草本氏烟草的siRNA-SWNT浸润样品叶片的共聚焦显微镜图像。渗透后3天成像，比例尺为50μm 。B.定量PCR分析结果在GFP基因沉默烟草本塞姆氏叶用siRNA-单壁碳纳米管。

基因沉默DET通过ermination W¯¯西部时代印迹
渗透72小时后，收获渗透的叶片，并用研钵和研杵在液氮中研磨，以回收干燥的冷冻叶片粉末。
转移冷冻叶粉末成管400微升预冷的溶解缓冲液（见ř ecipes）。
在冰上溶解组织1小时。将试管在10,000 × g下于4 °C离心20分钟。离心后，将含有完整蛋白质的上清液轻轻转移至新的干净试管中。使用Pierce 660 nm蛋白分析定量提取的总蛋白。
将样品与适当的上样缓冲液混合以进行凝胶电泳，然后使用加热块或热循环仪在95-100°C下将混合物煮沸5分钟。从每个样品中加载0.5 µg标准化总蛋白，并用SDS-PAGE凝胶（Bio- R和预制的tris /甘氨酸凝胶，4-20％梯度）进行分析。在120 V下运行凝胶60分钟。
转移凝胶至PVDF膜在冷转移缓冲液（见ř ecipes）和以400mA在1个运行×用甲醇转移缓冲液用于在冷室中在用冰块不超过60分钟。
使用在1 × TBST缓冲液中的7.5％BSA封闭膜1小时（参见R ecipes），然后在4 °C下与一抗GFP一起孵育过夜。彻底洗涤后，用山羊抗兔辣根过氧化物酶结合的抗体探测相应的蛋白条带30分钟。洗涤后，通过在不到2分钟的时间内用化学发光（Amersham ECL试剂盒）孵育并用ChemiDoc XRS +系统成像来扩增条带。
使用ImageJ软件量化GFP谱带的强度。

数据分析

对于所有实验，至少要进行3次生物学重复。生物学重复定义为由RNA-SWNTs独立浸润到不同植物中的实验。
对于共聚焦成像的定量分析，每个样品和每个生物重复至少捕获10-15个不重叠的视野，这被定义为技术重复。对这些技术复制品的荧光强度取平均值，以获得给定生物学复制品的平均荧光强度。共焦图像可以使用ImageJ或Zen Blue软件进行分析。
对于qPCR分析，至少要进行3次技术重复，这被定义为来自相同渗透的相同分离RNA批次的反应。为了分析qPCR结果的基因沉默效率，使用了以前开发的ddCt方法。该方法的细节可以在Rao等人的文章中找到。（2013）。
当针对单个自变量（例如，沉默效率）在统计学上比较两个以上样本时，请使用单向方差分析与Tukey的多重比较测试。报告P值和F。在统计上比较两个以上样本的多个独立变量（例如，多个时间点的沉默效率）时，请使用双向ANOVA和Sidak的多重比较测试。报告P值和F。仅比较两个样本时，可以使用Student t检验。报告P值。GraphPad Prism可用于绘制数据并执行统计显着性分析。

笔记

提供该协议用于沉默转基因烟草（Nicotiana benthamiana ）叶片中的GFP基因，但可以适用于沉默其他基因和其他植物物种，包括其他转基因或内源基因。
RNA和SWNT的数量可以根据实验需要扩大或缩小。在缩放过程中，将RNA：SWNT的质量比保持在2。对于不同的基因靶标，或在不同的植物物种或组织中，可能需要不同的最终siRNA浓度。
通常，如果一条RNA链很好地悬浮SWNT，则其互补链的悬浮效率会降低。考虑到有义和反义链的互补碱基对，这可能导致RNA碱基对SWNT表面的吸附能力变化。我们通常获得20-50微克/米升后离心和纯化步骤RNA-SWNT悬浮液。
注意200 nM是SWNT上的RNA浓度，而不是SWNT浓度。根据悬浮液效率，这相当于〜2μg / ml SWNT。
100-200微升浸润建议共聚焦成像研究，而较大的体积或多个渗透应用于qPCR来执行，并且w ^西部时代印迹，以覆盖全叶面积。
优选在同一叶片上渗入SWNT和对照样品，以避免基因表达和成像中叶片间的差异。
必须在干净的工作台（最好专门用于基于RNA的实验）上小心进行RNA工作，以防止RNA降解。擦拭表面和设备RN一个本质的解决方案和变化频繁的手套。在方案操作期间将RNA置于冰上，并在方案完成后转移至-20 ° C或-80 ° C。
如果叶子太厚或波浪状以至于无法获得整个视野，请使用z-stack成像，然后对堆叠的图像进行沉默分析。将要相互比较的样本之间的成像参数保持相同。

菜谱

0.1 M氯化钠
称取0.5844 g NaCl，溶于100 ml无核酸酶的水中

带0.22微米针头过滤器的无菌过滤器

10％（wt / vol）过硫酸铵溶液（APS）
将5克APS加到50毫升密尔中稀释水，混合溶解

解决方案可以存储在 4°C长达3个月

10 ×传输缓冲区
制作1公升的 10倍转移缓冲液，将30.3 g Tris碱，144 g甘氨酸添加到800 ml MilliQ水中，混合溶解

然后加 MilliQ水的最终体积为1 L

1 ×传输缓冲区
要制成1升1 ×转移缓冲液，请添加100 ml 10 ×转移缓冲液，200 ml甲醇至700 ml MilliQ水并混合溶液

缓冲液需要保存在4°C，最好在每次实验前准备好缓冲液

10 × Tris缓冲盐（TBS）缓冲液（1 M Tris，1.5 M NaCl，pH 7.4）
要制成250毫升10 × TBS缓冲液，请在200毫升MilliQ水中加入30.3克Tris碱，21.9克NaCl并混合以溶解

使用HCl将溶液的pH值调节至7.4，然后添加MilliQ水至250 ml的最终体积

该溶液可在4°C下保存长达6个月

1 × TBS T缓冲器
加入50毫升10 × TBS缓冲液，和500 μ升吐温20（0.1％）至500ml的米尔LIQ水并混合溶液

缓冲液可在4°C下储存至少1个月

裂解缓冲液
10毫米Tris / HCl

150毫米氯化钠

1毫米EDTA

0.1％NP-40

5％甘油

1％蛋白酶抑制剂混合物

pH值7.5

要制备100 ml裂解缓冲液，请在80 ml无核酸酶水中加入1.21 g Tris碱，0.877 g NaCl，29.24 mg EDTA，0.1 g NP-40和5 ml甘油，混合溶解，用HCl调节pH值至7.5 ，加入1 ml蛋白酶抑制剂混合物，并使用无核酸酶的水将最终体积填充至100 ml 。

注意：Ť他裂解缓冲液可以储存在-20℃下至少6个月。

致谢

该协议源自Demirer等。（2020）。

GSD得到了斯伦贝谢基金会未来计划学院和Caltech Resnick Sustainability Institute的支持。我们感谢科学接口（CASI）获得的Burroughs Wellcome基金职业奖，斯坦福·法恩PDF初级教师奖，PF-JFA-1760奖，贝克曼基金会青年研究者奖，USDA AFRI奖，USDA NIFA奖，摩尔基金会和FFAR新创新奖（MP L）。MPL是Chan-Zuckerberg Biohub的调查员。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

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