材料和试剂
1. P1000，P200，P20，P10无菌吸头
2. 1.5毫升l Eppendorf管

3. FISHERBRAND TM 9毫米短螺纹塑料小瓶中，将宽开口（˚F isher小号系统求解，FISHERBRAND TM ，目录号：11707597）

4. FISHERBRAND TM 9毫米PP短螺纹密封，蓝色，中心孔，组装隔垫（˚F isher小号系统求解，FISHERBRAND TM ，目录号：11797567）

5. Aeris TM 3.6 µm WIDEPORE C4 200Å，LC色谱柱250 x 4.6 mm（Phenomenex，目录号：00G-4486-E0），存储：4 °C，可长期使用
6. HPLC用的乙腈，梯度等级，≥99.9％（Sigma-Aldrich，目录号：34851），存储：室温（RT）
7.三氟乙酸试剂> 99％（Sigma-Aldrich，目录号：76508），储存：RT
8. MilliQ去离子水，存储：RT
9. Lyphochek血红蛋白A2对照（Bio-Rad，目录号：553），储存：短期使用4°C或长期使用-80°C
10.流动相（请参见食谱）

设备

层流罩
化学通风柜
NexeraX2色谱仪（岛津制作所）
HPLC UV-Vis检测器SPD-20AV（Shimadzu）
HPLC脱气装置DGU-20A3R（Shimadzu）
溶剂输送装置LC-30AD（岛津）
自动进样器SIL-30AC（Shimadzu）
柱式烤箱CTO-20A（Shimadzu）
系统控制器CBM-20A（Shimadzu）
冷冻微量离心机（Eppendorf 5424 R）

软件

LabSolutions WS-Single LC（版本5.51）（Shimadzu）

程序

样品制备
样品的制备可以在BSL-1（生物安全等级1）实验室中进行。但是，我们建议在BSL2实验室的层流罩下准备可能具有传染性的样品。色谱仪的质量取决于样品的制备和存储。我们建议尽可能使用新鲜制备的样品。

Lyphochek血红蛋白A2对照（Bio - Rad）
该产品是从人类全血中制备的，并且包含不同形式的血红蛋白（A，A2，F和S）。它用于生成每个球蛋白链的质量和洗脱控制曲线。

重构lyop于500μl的hilized产物的MilliQ去离子水，静置10分钟，漩每3分钟。
轻轻翻转样品瓶几次，以获得均匀的溶液。
制备5微升的等分试样与575混合溶液微升的MilliQ的在去离子水一个1.5米升Eppendorf管中。
将等分试样保存在-80°C以便长期使用。
每次运行HPLC时，在室温下解冻新的等分试样。约10分钟后，涡旋并等分试样置于冰上。
用冰冷的MilliQ去离子水稀释1:10 。
把50微升稀释的控制在一个HPLC装弹管。
储存：该溶液可在-80 °C稳定，可长期使用，在4 °C稳定7 d。

全血
在1.5 ml Eppendorf管中以300 xg离心100μl血液5分钟。
丢弃上清液。
添加900微升冰冷的MilliQ去离子水到RBC沉淀。
涡旋样品以利于RBC裂解。
离心10分钟，9 ，500 ×g下4℃。
收集上清液，并在HPLC加载管中的冰冷MilliQ去离子水中稀释1：100 。
储存：RBC颗粒可在4°C下短期使用7 d ，或在-80°C下长期使用。

体外分化的RBC（从250,000到1,000,000个细胞）和BFU-E（从20到50个菌落）。该方案需要最少250,000个体外分化的RBC或20 BFU-E才能获得可评估的HPLC峰。
在1.5 ml Eppendorf管中的50μl冰冷的MilliQ去离子水中重悬沉淀。
涡旋样品是为了促进RBC裂解。
离心机10分钟，9 ，500 ×g下4℃。
把40微升溶胞产物中的HPLC装弹管。
储存：裂解的分化红细胞或BFU-E可以短期使用在4°C下保存7 d，长期使用可以在-80°C下保存。

流动相准备
流动相的制备必须在化学通风橱中进行。流动相由HPLC级乙腈（ACN）组成，形成疏水环境，三氟乙酸（TFA）破坏Hb四聚体中的血红素基团，释放出每个球蛋白链：

解决方案A：MilliQ去离子水中的5％ACN，0.1％TFA

溶液B：在MilliQ去离子水中的95％ACN，0.1％TFA

注意：百分比表示体积百分比（v / v％）。在“配方”段落中报告了用于制备流动相的方案。

HPLC：清洁程序
每次运行前，请按照以下步骤冲洗LC色谱柱：

将两个溶液分别放入100％MilliQ去离子水和100％ACN。
使用从5％到95％ACN的缓慢梯度（1-2％/ min）冲洗色谱柱，然后再回到5％ACN。

HPLC：采集程序
将溶液A和溶液B放入两个溶剂容器中。
将HPLC管样品放入子单元SIL-30AC的托盘中。
检查HPLC机器的四个组件（LC-30AD； SIL-30AC，CTO-20A，SPD-20AV）是否已正确打开。
打开Labsolutions软件，从菜单栏中选择“ Instruments” ，然后双击Instrument徽标（图1A ）。
单击左侧的主助手菜单栏，然后选择“实时批处理”以打开“实时批处理”窗口（图1B ）。
通过为每个样本填充一行来完成实时批处理表（图1C ）：
样品瓶编号：S选择与样品在HPLC子单元SIL30AC托盘中的位置相对应的编号。要注入的前两个样品将是“空白”（包含没有目标分析物的溶液的样品）以放置色谱基线。对于空白样品，无需准备仅包含流动相的HPLC管：通过选择-1作为Vial＃，仅将流动相直接从溶液容器中注入。
纸盒名称：S选择0表示空白，选择1表示其他样品。
样品名称：w ^ RITE每个样品的名称。
样品类型：为所有样品选择“ 0：未知”。
方法File：小号选出包含珠蛋白链检测的方法中的.lcm文件。遵循表1中列出的参数，以1.0 ml / min的流速施加溶液A和溶液B的梯度（随着时间的流逝，疏水性逐渐增加）。

表1 。用于球蛋白链分析的RP-HPLC梯度方案。设计梯度时，在开始和结束时均以溶液A的较高浓度为基准，以1.0 ml / min的流速以100％的溶液B百分比（74-82分钟）结束。每个样品的采集持续95分钟。每个样品使用57.5 ml溶液A和37 ml溶液B，因此与溶液B相比，应制备更多的溶液A。

时间（分钟）

％RP-HPLC溶液A

％RP-HPLC溶液B

10

60.8

39.2

27

59.9

40.1

34

59

41

42

58.5

41.5

51

58.1

41.9

55

57.2

42.8

59

57

43

65岁

56.8

43.2

67

55.4

44.6

69

55.4

44.6

74

0

100

79

0

100

82

60.8

39.2

95

停

停

数据文件：小号选（自动文件名），包含数据的文件将被自动保存。
级别＃：为所有样本选择0。
注射体积：w ^仪式的体积（微升），该被注入的需要。分别为空白和空白样品注入5μl和35μl。对于Lyphochek血红蛋白A2对照以及如上所述从全血，500,000体外分化的RBC和25 BFU-E中制备的提取物，注射35μl是最佳的。如果使用不同体积的全血或不同数量的RBC或BFU-E，则减少或增加注射量（从1 µl到45 µl）。
报告输出：勾选框以自动打印出分析报告。如果您手动导出数据（如下所述），则无需勾选该框。

从菜单栏“将批处理文件另存为”中选择以将文件保存在计算机的专用文件夹中，然后输入.lcb文件名（图1D ）。
通过从主助手菜单栏中选择“开始实时批处理”来开始采集（图1E ）。每个样品的采集持续95分钟。

图1 。使用LabSolutions软件描述RP-HPLC采集过程步骤的流程图

数据分析

打开LabSolutions软件，选择“ Postrun session ”，然后双击“ Postrun” （图2A）。
从菜单栏中选择文件，以打开包含色谱洗脱曲线的窗口（图2B）。
右键单击色谱洗脱图，然后选择“显示设置”以设置y轴的强度范围和x轴的时间范围（图2C）。
右键单击色谱洗脱图，然后选择“手动积分栏”。使用不同的工具定义每个峰的基线（图2D）。
在“方法视图”窗口中单击“编辑”，完成将每个峰关联到特定球蛋白链的表格，然后单击“视图” （图2E ）。该曲线下的面积（AUC，面积），高度，和面积％的值将被报告为下表中的层析洗脱曲线的每个峰（图2E ）。

图2.使用LabSolutions软件描述RP-HPLC数据分析步骤的流程图

将色谱洗脱配置文件及其下面的表复制并粘贴到Excel文件中。
使用AUC（面积）值计算每个β样球蛋白链在总β样球蛋白链上或在α球蛋白上的相对表达，以及α/非α球蛋白链之比（图3）。

图3 。Lyphochek血红蛋白A2控制的RP-HPLC分析（A），全血（B），BFU-E（C），并在体外分化的红细胞（d）。全血是由输注了健康供体红细胞的SCD患者获得的。BFU-E是从得到的SCD患者和在体外分化的红细胞从健康供体。珠蛋白链洗脱从亲水性按以下顺序与疏水性珠蛋白：β甲，β小号，δ，α，甲γ，G ^ γ（A）。珠蛋白链的鉴定基于Lyphochek血红蛋白A2对照的洗脱曲线。保留时间，AUC（区），高度，和面积百分比报告每个峰。

笔记

由于不同的原因（例如，流动相的制备精度，机器的压力稳定性），不同的运行可能会导致保留时间不同。因此，我们强烈建议您在每次运行中使用Lyphochek血红蛋白A2对照。
色谱仪的质量取决于样品的裂解/制备及其存储（如果不是新鲜制备的）。我们建议使用新鲜制备的样品和流动相。
如果峰的定义不明确（例如，由于背景较高），执行额外的清洁程序可能会很有用。

菜谱

流动相
解决方案A：MilliQ去离子水中的5％ACN，0.1％TFA

溶液B：在MilliQ去离子水中的95％ACN，0.1％TFA

注意：每个样品需要57.5 ml的溶液A和37 ml的溶液B。根据样品数量确定所需的流动相量。我们建议使用新鲜制备的流动相。

致谢

这项工作得到了法国国家研究基金会（Agence Nationale de la Recherche）在“投资研究”计划（ANR-10-IAHU-01）下和法国巴黎大区在“ DIMThérapiegénique”倡议下的资助，并获得了资助。欧洲研究理事会（865797 DITSB）和AFM-Telethon（22399和22206）的资助。该协议源自Weber等。（202 0）。

利益争夺

该作者宣称没有利益冲突。

伦理

所有实验均根据赫尔辛基宣言进行。该研究得到区域研究审查委员会的批准（参考文献：DC 2014-2272，CPP法兰西岛第二次“HôpitalNecker-Enfants恶性疟疾”）。从所有成年受试者获得书面知情同意书。

参考文献

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