材料和试剂
无菌细胞培养皿，100 × 20 mm（Sarstedt，产品目录号：83.3902）
血清移液管：5毫升（Sarstedt，目录号：86.1253.001），10毫升（Sarstedt，目录号：86.1254.001），50毫升（Sarstedt，目录号：86.1256.001）
管15 ml（Sarstedt，产品目录号：62.554.502）
试管50 ml（Sarstedt，产品目录号：62.547.254）
1.5 ml微管（Sarstedt，产品目录号：72.690.301）
培养室：Lumox 8孔试样滑动可拆卸（Sarstedt的，Ç atalog号：94.6150.801）
注意：该程序也可用于8孔的Falcon TM腔室细胞培养玻片（Corning，目录号：354118）。

实验室瓶，硼硅酸盐3.3杯，50毫升（VWR，目录号：215-3261 ）
实验室瓶，硼硅酸盐3.3杯，1,000毫升（VWR，目录号：215-1595 ）
铝箔
ART TM Barrier专业吸管提示：10 µl（Thermo Scientific，目录号：2140），200 µl（Thermo Scientific，目录号：2770），1,000 µl（Thermo Scientific，目录号：2279）
显微镜载玻片架
盖玻片门泽尔格拉塞24 × 60毫米（赛默飞世科学，Ç atalog号：E-4137）
封口膜
MDCK II细胞系（Merck / Sigma-Aldrich，目录号：ECACC 00062107）
鹰牌最低必需培养基（EMEM），500毫升（ATCC，目录号：30-2003）
胎牛血清（FBS），500毫升（Gibco，货号：10270-106）
注意：FBS不需要热灭活。

Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）1 × ，无钙，无镁，500 ml（Gibco，目录号：14190-094）
胰蛋白酶-EDTA（0.25％），酚红，100 ml（Gibco，产品目录号：25200056）
重组人HGF（衍生自HEK293），25μg（Peprotech，产品目录号：100-39H）
山羊正常血清，10 ml（Agrisera，目录号：AS10 1548）
皂苷，10克（Sigma-Aldrich，产品目录号：S4521）
1 kg多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，产品目录号：16005）
氯化钠（NaCl），1千克（VWR C hemicals，产品目录号：27810.295 ）
氯化钾（KCl），试剂级，Reag。欧元（Ph Eur），1千克（沙劳，目录号：PO02001000）
磷酸氢二钠二水合物（Na 2 HPO 4 · 2H 2 O），1千克（Scharlau，目录号：SO03391000 ）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ），1千克（Merck，产品目录号：1048731000）
VECTASHIELD ®抗荧光淬灭封固介质用DAPI，将10毫升（Vector Laboratories公司，C atalog号：H-1200）
指甲油
氢氧化钠（NaOH），1千克（默克（Merck），目录号：1064691000）
一抗（表1）

表1.一抗

二抗（表2）

表2.二抗

MDCK II细胞的完整培养基（请参阅食谱）
PBS 10 × （请参阅食谱）
PBS 1 × （请参阅食谱）
阻塞缓冲区（请参见食谱）
洗涤缓冲液（请参见配方）
PFA为3％（请参阅食谱）
5％皂苷（请参阅食谱）

设备

1. Burker型计数室（Hirschmann，目录号：8100201 ）
2.通风柜
3.的Eppendorf ®研究®加吸管，3包：0.5-10微升，10-100微升，100-1,000微升（Sigma-Aldrich公司，C atalog号：Z683884 ）
4.集成Pipetboy 2（VWR，目录号：612-0927）
5.加热和电磁搅拌器RH basic 2（Dulova，目录号：QSA337）
6.离心机VWR Compact Star CS4
7. 37 °C ，5％CO 2细胞培养培养箱
8.标准相衬显微镜
9.共焦显微镜Zeiss 710

软件

1. ImageJ（https://imagej.nih.gov/ij/download.html）

程序

A.开始MDCK II细胞培养
1.准备用于MDCK II细胞的完整培养基（请参见食谱）。
2.用冷冻的MDCK II细胞解冻小瓶。
3.将细胞转移到装有完整培养基的15 ml Falcon管中。
4.离心1细胞5分钟，500转（214 ×克）。
5.丢弃上清液。
6.加入10 ml完全培养基。上下移液。
7.将细胞转移到细胞培养皿中。
8. 37℃培养细胞 °C，细胞培养箱中的5％CO 2 。

B. MDCK II细胞传代
1.预热完全培养基和胰蛋白酶。
2.从细胞中除去培养基。
3.用10毫升的DPBS洗涤。
4.加入2 ml胰蛋白酶。
5.在37 °C下孵育细胞5分钟。
6.在显微镜下检查细胞是否脱落。
注意：如果细胞未分离，则继续在37 °C下孵育2-5分钟。

7.加入10 ml完全培养基。
8.上下移液。
9.将细胞悬浮液转移到15ml管中。
10.将细胞以1,500 rpm（214 × g ）离心5分钟。
11.丢弃上清液。
12.将细胞接种到新的细胞培养皿中。使用1：5的分割比例。
13.在37 ℃下培养细胞。

C.EMT的归纳
第0天

在8孔室玻片中播种16,000个细胞/孔。
注意：为了在MDCK II细胞中诱导EMT，将细胞传代少于10次。

孵育细胞过夜。

第一天

1.准备HGF库存100 μg / ml并分装：

用冻干的HGF旋转小瓶。
加入250 μ的无菌BSA的1mg / ml（在PBS中）的升与HGF的小瓶中。
通过移液混合。
快下来
等分。使用无菌的1.5 ml管。
将等分试样储存在-80 °C下。
2.用完全培养基稀释HGF储备液至终浓度20 ng / ml。涡旋混合。
3.从接种在8孔室玻片上的细胞中除去培养基。
4.每孔加入0.5ml的DPBS。
5.除去DPBS。
6.加入完全含有HGF的培养基，每孔使用0.5 ml培养基。
注意：作为对照，用不含HGF的完全培养基处理细胞。

7.将细胞在37 °C下孵育24小时。

D.免疫荧光染色和成像
第二天

1.解冻：
PFA为3％（请参阅食谱）

山羊血清

5％皂苷（请参阅食谱）

2.准备：
洗涤缓冲液（请参见配方）

阻塞缓冲区（请参见配方）

3.除去培养基。
4.将培养物在3％PFA中固定10-15分钟。每孔使用0.5 ml PFA。
注意：所有免疫染色步骤均在室温下进行，除非另有说明。

5.用PBS 1 ×洗涤培养物（请参阅“食谱”）。使用0.5 ml PBS 1 × /孔。
6.每孔加入0.5 ml封闭缓冲液。在室温下孵育1小时。
7.孵育与一抗培养物（表1），过夜，在4 ℃下。用封口膜覆盖文化。
一种。以1：200的比例稀释抗ZO-1抗体。
b。以1：500的比例稀释抗波形蛋白抗体。
C。使用洗涤缓冲液稀释抗体。
d。每孔最少使用200μl抗体溶液。

第三天

8.去除抗体溶液。
9.用PBS 1 ×洗涤。使用0.5 ml PBS 1 × /孔。
10.用荧光二抗（表2）孵育培养物1小时。
以1：500的比例稀释第二抗体。
使用洗涤缓冲液稀释抗体。
每孔最少使用200μl抗体溶液。
用铝箔纸覆盖培养物，以防止光照。
11.用PBS 1 ×洗涤。使用0.5 ml PBS 1x /孔。
12.丢弃PBS 1 × 。
13.拆下介质腔。使用拆卸装置。
14.安装
将几滴安装介质滴在盖玻片上。
将盖玻片幻灯片放在包含培养物的幻灯片顶部。避免气泡。
15.用指甲油密封已安装的幻灯片。
16.将载玻片存储在4 °C的显微镜载玻片文件夹中。避光。

第四天

用共聚焦显微镜拍摄染色细胞的图像（图1）。

数据分析

共聚焦显微镜图像ANA裂解与ImageJ软件。除了通过免疫荧光进行表型鉴定外，EMR诱导的MDCK细胞还可以通过Western印迹，细胞圆度评估以及到第一个和第二个相邻细胞的细胞距离进行分析，如Farrell等人所述。（2014）。

图1. MDCK II细胞中EMT的表型表征。A.实验方案：用肝细胞生长因子（HGF）处理MDCK II细胞24小时，固定，然后对EMT标志物染色。B.免疫染色对波形蛋白和紧密连接PROT ein- 1 （紧密连接- 1，ZO - 1 ）。DAPI用于核反染。物镜20 × 。比例尺，50μm。

笔记

为了获得成功且可重复的结果，我们建议：

要严格遵守制造商关于HGF储存的准则，并避免重复进行HGF冻融循环。
应该每周在显微镜下观察MDCK II细胞，以监测表型的稳定性。
MDCK II培养物绝对不能生长过度（避免> 80％融合）。
应当定期更换细胞培养基（避免使用酸性培养基，因为酸性培养基可以诱导EMT，因此可以通过从粉红色变为黄色的颜色来识别）。

菜谱

MDCK II细胞的完全培养基
450毫升鹰牌最低必需培养基（EMEM）

50毫升胎牛血清（FBS）

PBS 10 ×
80克氯化钠
2.2克氯化钾
14.2克Na 2 HPO4 · 2H 2 O

2克KH 2 PO 4

用蒸馏水将最终体积调至1 L

PBS 1 ×
100毫升PBS 10 ×

900毫升蒸馏水

阻塞缓冲区
500μl山羊血清

100μl5％皂苷

用PBS将最终体积调整为10 ml 1 ×

短期存放于4 °C

洗涤缓冲液
500μl山羊血清

500μl5％皂苷

用PBS将最终体积调整为50 ml 1 ×

短期存放于4 °C

3％PFA
1.5克PFA

12.5μlNaOH 6 M

用PBS将最终体积调整为50 ml 1 ×

在通风橱中将所有组件合并到一个玻璃瓶中
加磁力搅拌棒
通过在通风橱中于56 °C的磁力搅拌器上搅拌溶液来溶解PFA
将等分试样储存在-20 °C
避免冻融循环
5％皂苷
2.5克皂苷

用蒸馏水将最终体积调至50 ml

分装并储存在-20 °C

致谢

该协议改编自Farrell等。（2014）。这项工作得到了瑞典癌症协会（Cancerfonden，CAN2017 / 735）的支持。我们感谢于默奥大学的生化成像中心。感谢丘伟乐对手稿的认真阅读。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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