材料和试剂
1. 2-ml Eppendorf微量离心管，LoBind用于蛋白质（Fisher Scientific，目录号：13-698-795）
2. 1.5米升的Eppendorf微量离心管中，低吸附的蛋白质（Fisher Scientific公司，目录号：13-698-794）
3. 0.2 µm硝酸纤维素膜（GE Healthcare Life Sciences，目录号：10600004）
4. MULTI-ARRAY 96小点GAM板（中观秤，目录号：L45MA-2）
5. Scn1a tm1Kea 129S6。Scn1a +/-小鼠（杰克逊实验室，目录号：37107-Jax）
6.液氮
7. PageRuller Plus预染蛋白梯（Thermo Fisher Scientific ，目录号：26620）
8.停止蛋白酶抑制剂混合物（100 ×）（Thermo Fisher Scientific ，目录号：78429）

9.捕获抗体，小鼠抗Na V 1.1单克隆抗体（NeuroMab ，目录号：75-023）
10.检测抗体，单克隆抗体抗Na V 1.1多克隆抗体（Alomone ，目录号：ASC-001）
11.抗兔抗体，山羊，磺基-Tag标记（内消旋Scale Discovery公司，目录号：R32AB-1）
12.抗纽蛋白抗体（E1E9V），兔单克隆抗体（Cell Signaling Technology，目录号：13901）
13. pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10010023 ）
14. TGX丙烯酰胺梯度凝胶（Bio-Rad，目录号：5671124）
15. ECL Prime封闭剂（GE Healthcare生命科学，目录号：RPN418V）
16. ECL Plus Western Blotting底物（Thermo Fisher Scientific ，目录号：32132）
17. MSD阻滞剂B，2克（细观秤，目录号：R93BB-2）
18. MSD读取缓冲区T（4 × ）（中尺度发现，目录号：R92TC-2）
19. TBS，10 × （Bio-Rad，目录号：170-6435）
20. 10％吐温- 20（Bio-Rad公司，目录号：1610781）
21. TX-100（西格玛奥德里奇，目录号：T8787-100ML）
22. Nonidet P-40，IGEPAL CA-630（Sigma-Aldrich，目录号：56741-250ML-F）
23.脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：D6750-25G）
24. 0.5 M EDTA pH 8.0（Ambion ，目录号：AM9260G）
25. BCA蛋白测定试剂盒（Pierce，目录号：23227）
26. MSD溶解缓冲液（见配方和Ñ OTE 1）

设备

Meso Quickplex SQ 120 （Meso秤发现，型号：SQ120 ）
微孔板振荡器（康宁，型号：S2020-P4-COR ）
分析天平（梅特勒-托利多，型号：AB54-S ）
低温-cup磨床（Biospec ，型号：206 ）
特氟隆涂层的杵和研钵组织研磨尺寸A.室容积10米升（托马斯科学，型号：3431D76 ）
特氟隆涂层的杵和研钵组织研磨尺寸B.室容积30米升（托马斯科学，型号：3431D88 ）
五速钻床（温，目录号：4208 ）
冷冻离心机（Eppendorf ，型号：5430R ）
干式印迹系统（Thermo Fisher Scientific，型号：iBlot 2）
激光扫描仪（GE Healthcare Life Sciences，型号：Typhoon FLA 9500）

软件

MSD Discovery Workbench 4.0（Meso Scale Diagnostics，LLC。，www.mesoscale.com）
GraphPad Prism 8.0（GraphPad软件，www.graphpad.com）

程序

组织裂解液的制备
准备小鼠肝脏裂解液作为MSD校准曲线标准品的稀释剂
灌注用PBS，pH 7.4中的成年小鼠肝脏（见Ñ OTE 2）通过门静脉直到肝的颜色变成黄色或白色（卡布拉尔等人，2018）。切下肝脏组织并称重分析天平（Mettler Toledo）。
冷冻在液氮中肝组织，并使用液氮冷却的研钵和杵粉碎它的Cryo -cup粉碎机（Biospec ）。
添加冰冷的MSD LY SIS缓冲器到2 M的量的粉碎的肝组织升每100mg组织的缓冲液中。用马达驱动的涂有特氟龙涂层的研钵和杵组织研磨器（B型，Thomas Scientific）在冰上均质化，速度为740 rpm，持续30冲程。
转移匀浆2-m的升的Eppendorf管中并在离心机16 ，000 × RCF ，4 °C，用冷冻离心机（Eppendorf ）放置15分钟。
将上清液（肝脏裂解液）转移到新的试管中，而不会干扰沉淀（含有细胞核和细胞碎片），并避免吸收浮在裂解液表面的任何油脂滴。将上清液置于冰上。
测量肝裂解物之后使用的协议中的蛋白质浓度二喹啉甲酸（BCA）法（Pierce，见Ñ OTE 3）。蛋白质浓度通常为5至7毫克/米升用于从该方法获得肝裂解物。调整蛋白质浓度至4毫克/米升与MSD溶解缓冲液中。
准备用于MSD校准曲线标准品和测试样品的小鼠大脑裂解液
使用成人老鼠的大脑准备脑裂解液以达到标准，因为Na V 1.1的表达受到发育调节，并在成年后一直保持较高水平（Han等，2020）。制备脑裂解物在类似的方式，肝裂解物，不同之处在于脑组织中未液氮在均化之前粉碎，1.5 -米升MSD的裂解缓冲液加入到每100毫克脑组织。较小尺寸的涂有特氟龙的研钵和杵组织研磨机（A型（Thomas Scientific）可用于均质测试样品。蛋白质浓度通常为5至7毫克/米升用于从该方法获得的脑裂解物。在制备结束，调节脑裂解物的浓度，以4毫克/米升与MSD溶解缓冲液中。

MSD-ECL分析的鉴定和表征
瓦尔IDATE与抗体的特异性SCN1A - / -小鼠脑组织（见Ñ OTE 4）。
准备从Scn1a -/-小鼠和野生型（WT）同窝仔的大脑裂解液。我们繁殖了Scn1a tm1Kea 129S6。Scn1a +/-小鼠（杰克逊实验室）以创建Scn1a -/-小鼠。或者，可以从CRISPR工程Scn1a敲除细胞培养物中获得Na V 1.1无效组织。
在预制的TGX丙烯酰胺梯度凝胶（Bio-Rad）的每个泳道上，用50μg脑溶解产物进行SDS - PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺钠凝胶电泳）。在120 V下运行SDS - PAGE约90分钟。
使用干式印迹系统（Thermo Fisher Scientific ）将总蛋白转移到0.2 µm硝酸纤维素膜上（GE Healthcare Life Sciences ）。使用下面的传输程序用于蛋白质转移：小号TEP 1：20 V 1分钟; s tep 2：23 V持续4分钟；步骤3：25 V，持续5分钟。
用测试抗体进行免疫印迹。用2％ECL Prime封闭剂（GE Healthcare Life Sciences）封闭膜30分钟。使用含0.1％Tween-20（TBS-T）的Tris缓冲盐水制备封闭缓冲液。使用封闭缓冲液作为一抗和二抗孵育的稀释剂。抗体孵育之间用TBS-T洗涤硝酸纤维素膜。使用ECL Plus Western印迹底物（Thermo Fisher Scientific）开发免疫印迹信号，并使用激光扫描仪（GE Healthcare Life Sciences）捕获免疫印迹图像。Na V 1.1特异的抗体应在野生型小鼠脑裂解物中检测到约223 kDa的蛋白条带，而在Scn1a -/-小鼠脑裂解物中则不能检测到。Na V 1.1特异性抗体验证的示例在图2中给出。

图2. Na V 1.1抗体验证的示例。免疫印迹是用来自Scn1a -/-小鼠的脑裂解液（中泳道）和两个野生型（WT）同窝仔（侧翼泳道）进行的。供应商A的Na V 1.1抗体（左图）不是特异性的，可能与其他VGSC同源物发生交叉反应。中的Na V从供应商B（右图）1.1抗体是特异性的，因为钠V 1.1蛋白条带没有在车道看到SCN1A - / - BR AIN裂解物。因此，发现来自供应商B的Na V 1.1抗体适用于MSD-ECL分析开发。（蛋白质阶梯：PageRuller Plus）

评估小鼠肝脏裂解液作为MSD校准曲线标准品的稀释剂
在每个泳道上用50 µg小鼠肝裂解液或脑裂解液进行SDS - PA GE。将总蛋白转移到0.2 µm硝化纤维素膜上，并使用经过验证的Na V 1.1抗体进行免疫印迹。Na V 1.1特异的抗体应在脑溶解液中检测到约223 kDa的蛋白带，但在稀释液中（在这种情况下为肝溶解液）不能检测到。确认小鼠肝裂解液为脑裂解液合适稀释剂的结果如图3所示。

图3.评估小鼠肝裂解液作为脑裂解液的稀释剂。用经过验证的Na V 1.1抗体（来自供应商B，与图2中相同的抗体）的小鼠肝裂解液和脑裂解液进行免疫印迹。已显示长春花蛋白免疫印迹可用于负荷控制。（蛋白质阶梯：PageRuller Plus）

制备MSD校准曲线标准品
通过以各种比例混合WT小鼠脑裂解液（4 mg / ml ）和WT小鼠肝裂解液（4 mg / ml ）制备MSD校准曲线标准品（表1）。店以小等分试样MSD校准曲线的标准，在-80 ℃，以避免多次冷冻-解冻循环（见Ñ OTE 5 ）。

MSD-ECL分析的表征和接受标准
准确度和精度
使用标准品和质控品（QC），在一式两份孔中进行MSD-ECL分析。我们通常准备最大非零校准器（在这种情况下为STD12 ）的70-75％水平的高浓度质量控制（HQC）和45-55％水平的中等浓度质量控制（MQC ）。我们准备的低浓度质量控制（LQC）约为最小非零校准器（在这种情况下为STD2 ）的3倍。准备使用小鼠肝裂解物作为稀释剂的的QC（见Ñ OTE 5 ）。
作为测定准确性（A）的度量，所有标准品的平均反算浓度应为其标称值的±15％。75％的非零标准应满足上述标准。QC的平均反算浓度应为标称值的±20％。
作为测定精度（P）的量度，重复样品之间的CV％应≤20％。
定量下限（LLOQ）和定量上限（ULOQ）
LLOQ由最小的非零校准器定义，该校准器的MSD信号至少比空白值（STD1）大3倍或大于空白值再加上空白值的标准偏差（SD）10倍。LLOQ应该符合准确性和精度标准。
ULOQ由满足精度和精度标准的最大非零校准器（在本例中为STD12）定义。
特异性
按照过程C中的步骤，用来自Scn1a -/-小鼠的脑溶解液进行MSD- ECL分析。来自Scn1a -/-脑裂解物的MSD信号应低于定量下限（BLQ）。

稀释线性
三个QC样品（HQC，MQC和LQC）用于评估测定的稀释线性。如果需要更严格的测试，则可以对QC样品进行4种或更多稀释水平的MSD-ECL分析。QC的平均反算浓度应为标称值的±20％。

稀释线性的建立有助于将标准曲线的动态范围扩展到野生型小鼠大脑中Na V 1.1表达的100％以上。可以使用已建立的稀释因子稀释预期Na V 1.1表达高于野生型小鼠脑组织或显示高于ULOQ水平的测试样品。

储存稳定性
将标准品和QC储存在-80 °C，并在1周，1个月和3个月（或更长的研究时间）内进行MSD-ECL分析。所有标准品和质控品的平均反算浓度应分别为标称值的±15％和±20％，同时均通过精密度标准。

进行MSD-ECL分析
阻断MSD GAM（山羊抗小鼠抗体），用5％的板MSD阻断剂B（参见Ñ OTE 6 ）中的Tris缓冲盐水，0.1％吐温- 20（TBS-T），100μ升/孔。密封板，并在微板振荡器（康宁）上以室温700 rpm的速度摇动1 h。
从一叠纸巾上的板中轻拍阻滞剂B。用捕获抗体（NeuroMab ，0.95 mg / ml ，在5％Block B / TBS-T中稀释至1：200）包被，每孔25 µl 。密封板并在室温下以700 rpm的速度摇动4 h。
从纸巾上的板中轻拍捕获抗体。在室温下，以700 rpm的速度摇动平板时，用TBS-T（150 µl /孔）清洗孔3次。每次清洗五分钟。
将25 µl MSD校准曲线标准液（4 mg / ml ）或测试样品裂解液（4 mg / ml ）加到各个孔中。在同一平板上包括高，中和低浓度质量控制（分别为HQC，MQC和LQC）。重复运行每个标准品和测试样品。MSD板布局的示例在图4中给出。密封板，在4 °C下以700 rpm的速度摇动过夜。
从纸巾上的盘子中轻敲内容。洗井小号用TBS-T（150μ升/孔），进行3次，同时摇动板，在室温下，速度700转。每次清洗五分钟。
向每个孔中加入25 µl检测抗体（Alomone ，0.6 mg / ml ，在5％Block B / TBS-T中稀释至1：250）。密封板并在室温下以700 rpm的速度摇动2 h。
从纸巾上方的板中敲出检测抗体。洗孔用TBS-T（150 μ升/孔），进行3次，同时摇动板，在室温下，速度700转。五分钟UTES每次洗涤。
添加25μ升的磺基-标记的抗-兔抗体（MSD，0.5毫克/平方米升，稀释至1：250）到每个孔中。密封板并在室温下以700 rpm的速度摇动1 h。
从纸巾上的盘子中轻敲内容。洗孔用TBS-T（150 μ升/孔），进行3次，同时摇动板，在室温下，速度700转。每次清洗五分钟。
向每个孔中加入150 µl 1 × MSD读缓冲液T（在dH 2 O中稀释）。分配读取缓冲液时，请确保未产生气泡。立即在配有MSD Discovery Workbench 4.0软件（Meso Scale Diagnostics，LLC）的Meso Quickplex SQ 120机器上读取板。

图4. 96孔MSD-ECL分析的板布局示例。每个标准品（STD）和测试样品（SPL）均重复运行。板中包括高，中和低浓度质量控制（分别为HQC，MQC和LQC）。一个人还可以在测试样品之前运行一条标准曲线和一组质量控制，在测试样品结束时运行另一组标准曲线和质量控制。

数据分析

进口MSD校准曲线标准和测试SAMP信号LES到的GraphPad棱镜8软件（的GraphPad软件）。检查标准品和测试样品是否符合准确性和精密度标准。请参阅表2中的MSD-ECL数据集示例。

配合标准的非线性回归曲线（2次阶多项式或四参数逻辑）。请参见图5中的MSD标准曲线拟合示例。

图5. MSD标准曲线拟合示例。从校准曲线的标准MSD信号（表2）拟合到四参数逻辑曲线（红色）或2次多项式曲线（蓝色）。STD12定义了定量上限（ULOQ）。STD2定义了定量下限（LLOQ）。

根据标准曲线对每个测试样品中的Na V 1.1浓度进行插值。MSD信号高于ULOQ的任何样品都应用小鼠肝溶解液稀释，并使用新的MSD-ECL测定法重新运行。
使用适当的统计检验比较不同组之间的Na V 1.1表达。最常用的测试是学生'小号牛逼-检验，Mann惠特尼Wilcoxon检验和两因素方差分析。请参见图6中的MSD-ECL数据表示和统计分析示例。

图6. MSD-ECL数据表示和统计分析的示例。绘制了两组断奶前小鼠（A和B）的脑组织中Na V 1.1表达的内插结果（平均值±SD和个体值，也列于表2），并将平均值与未配对的两尾学生进行比较“小号吨-试验（**** ，P < 0.0001）。内插使用2次多项式（左）和四参数逻辑（4PL）的标准曲线（右）产生类似的结果。

笔记

蛋白酶抑制剂不包括在该方案中使用的MSD裂解缓冲液中。据报道，用于许多蛋白酶抑制剂的二甲基亚砜（DMSO）可以改变溶液中蛋白质的特性，导致蛋白质变性，聚集或降解。DMSO还可以改变蛋白质的表观结合特性（Chan等人，2017）。为避免DMSO对该方法的可能的不利影响（该方法需要目标蛋白的完整性及其与抗体的结合），我们探索了不使用蛋白酶抑制剂的方案并将其与使用蛋白酶抑制剂的类似方案进行比较（rmo Fisher Scientific ，Halt Protease Inhibitor鸡尾酒）。只要所有标准品，质控品和测试样品均在冰上或在4 °C下加工，并以等分试样在-80 °C下储存，我们在两种方法之间在分析结果和储存稳定性方面都没有发现任何区别。。
在组织溶解之前先用PBS灌注小鼠肝脏，可大大降低肝脏溶解产物的背景。
用MSD裂解缓冲液准备BCA分析标准液。
我们强烈建议验证MSD-ECL分析中使用的任何新的多克隆抗体，因为它们可能来自不同的免疫动物，并且抗体的特异性可能不同。
将校准曲线标准品，质控品和测试样品裂解物等分储存在-80 °C下，以避免多次冻融循环（尽管建议建立冻融稳定性）。
用于MSD-ECL分析的阻断剂A（R93BA-4）基于牛血清白蛋白（BSA），在我们的手中会导致高背景。MSD-ECL的阻断剂B（R93BB-2）基于牛奶蛋白，导致MSD-ECL组件的背景低。

菜谱

MSD裂解缓冲液
组件

量

最终浓度

10 × TBS，pH 7.4

5百万升

1 ×

10％TX-100

5百万升

1％

10％Nonidet P-40

250万升

0.5％

娜脱氧胆酸

125毫克

0.25％

50万EDTA

100微升

1毫米

用dH 2 O将体积调至50 m l

致谢

该方案最初用于研究论文“在Dravet综合征小鼠模型中，反义寡核苷酸可提高Scn1a表达并减少癫痫发作和SUDEP发生率”（Han等人，2020年）。

利益争夺

ZH，AC，M和GL是Stoke Therapeutics，Inc.的雇员。ZH是Stoke Therapeutics，Inc.提交的专利/专利申请（PCT / US2018 / 48031; WO / 2019/040923）的发明人之一，涵盖了以下用途：促进将NMD外显子从编码Na V 1.1的NMD外显子mRNA中排除的治疗剂。

伦理

涉及小鼠的程序是根据Stoke Therapeutics，Inc.的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的规程进行的。批准ID：STK2019-03-CNS。有效期：04/11/2019至04/11/2022。所有体内实验程序均符合《 NIH实验动物的护理和使用指南》。没有人类受试者参与这项研究。

参考文献

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Dravet ，C.，Bureau，M.，Oguni ，H.，Fukuyama，Y.和Cokar ，O.（2005）婴儿期严重的肌阵挛性癫痫：Dravet综合征。Adv Neurol 95：71-102。
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Cabral，F.，Miller，CM，Kudrna ，KM，Hass，BE，Daubendiek ，JG，Kellar ，BM和Harris，EN（2018）。从小鼠肝灌注中纯化肝细胞和正弦内皮细胞。可视化实验杂志。Ĵ显示精通（132）：56993。
Chan ，DS，Kavanagh ，ME，McLean ，KJ，Munro ，AW，Matak-Vinković ，D.，Coyne ，AG和Abell ，C.（2017年）。DMSO对蛋白质结构和相互作用的影响（通过碰撞诱导的解离和展开）。Anal Chem 89（18）：9976-9983 。
Han，Z.，Chen，C.，Christiansen，A.，Ji ，S.，Lin Q.，Anumonwo ，C.，Liu，C.，Leiser ，SC，Meena ，Aznarez ，I.，Liau ，G.和Isom ，LL（2020）。在Dravet综合征的小鼠模型中，反义寡核苷酸可增加Scn1a表达并减少癫痫发作和SUDEP发生率。Sci Transl Med 12（558）：eaaz6100。