材料和试剂
材料
移液器吸头（1,000 μ升，200 μ升，10 μ升）（赛多利斯，目录号：7902020，790012，791002）
STE RILE培养皿（直径= 90 MM）（HIMEDIA实验室，目录号：PW001）
Eppendorf管（Tarsons Products，1.5 ml，2.0 ml）
50 ml锥形管（Sarstedt ，目录号：62.547.205）
Electrocuvettes ，0.1厘米间隙为大肠杆菌（BIO - Rad公司，基因脉冲，目录号：165-2089）和0.2厘米间隙为假单胞菌（BIO - RAD，基因脉冲，目录号：165-2086）
无菌0.2 μ米注射器过滤器（Sigma-Aldrich公司）

试剂种类
1. 3-甲基苯甲酸（同义词米-toluic酸）（3-米的Bz ; Sigma-Aldrich公司，ReagentPlus ，目录号：T36609）
2.蔗糖（Sigma-Aldrich，Milipore ，目录号：84100）
3.溶源性肉汤（LB）（Sigma-Aldrich，目录号：L3522 ）；根据制造商的说明进行准备，在室温下最多可保存三周
4.琼脂LB（Sigma-Aldrich，目录号：L3147 ）；根据制造商的说明进行准备，在4下最多可存放两个月 °C
5. SOC介质（Sigma-Aldrich，目录号：S1797）
6.卡那霉素（TH-Geyer，目录号：T832.3）
7.庆大霉素（Sigma-Aldrich，目录号：G1264）
8.链霉素（西格玛奥德里奇，目录号：S6501）
9.氨苄西林（Mitolab ，目录号：K029）
10.寡核苷酸（整合DNA技术，比利时鲁汶）
11.尿嘧啶特异性切除试剂（NEB Biolabs，用户酶，目录号：M5505）
12. DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific ，Phusion U热启动，目录号：F555）
13.用于菌落PCR中包括DNA聚合酶反应混合物（NEB Biolabs公司，一个的Taq ®热启动快速负载® 2 ×主混合物与标准缓冲液，产品目录号：M0488L）
14.制备化学感受态大肠杆菌细胞的试剂（Zymoresearch ，Mix＆Go ! ；目录号：T3001）
15.大肠杆菌DH5 α λ PIR [ endA1 hsdR17 glnV44 （supE44 ）THI-1 recA1 gyrA96 relA1 φ80d紫胶 （lacZ启动）M15  （lacZYA-ARGF ）U169 ZDG-232 :: Tn的10的uidA :: PIR + ] （普拉特等人，2000 ）

16. P 。putida KT2440 （株ATCC 47054 / DSM 6125 / NCIMB 11950）（Belda等人，2016）
17.测序试剂盒（Eurofins，Mix2Seq Kit OVERNIGHT，目录号：3094-0ONMSK）
18.质粒纯化试剂盒（Macherey -Nagel，NucleoSpin质粒，目录号：740588）
19.凝胶和PCR纯化试剂盒（Macherey -Nagel，NucleoSpin ™凝胶和PCR纯化试剂盒，目录号：740588）
20.可选：Dpn I （Thermo Fisher Scientific ，FastDigest DpnI ，目录号：FD1703）
21.琼脂糖（Bio-Rad，认证分子生物学琼脂糖，目录号：1613102）；在1 × TAE缓冲液中以1％（w / v）的比例制备凝胶电泳（使用微波加热溶解）。可以在60 °C下保存以保持熔融状态，以便立即使用
22.荧光核酸染色溶液（Intronbio ，Red safe，目录号：21141）
23. DNA阶梯（Thermo Fisher Scientific ，GeneRuler 1 kB，目录号：SM0314）
24. 3-甲基苯甲酸（3- m Bz）溶液（500 mM）（请参阅食谱）
25.蔗糖溶液（300 mM）（请参阅食谱）
26.聚合酶链反应（PCR）试剂（请参阅食谱）
27.具有电感受态的假单胞菌细胞（请参阅食谱）
28.抗生素储备溶液（请参阅食谱）

设备
电穿孔仪（BIO - Rad公司，MicroPulser ，目录号：1 652100）
透照仪（Thermo Fisher Scientific，Safe Imager 2.0 Blue Li ght，目录号：G6600）
台式离心机，用于1.5和2毫升ř反应的影响管（VWR，型号：MICROSTAR 17R，目录号：521-1647）
台式离心机，用于带有转子（Thermo Fisher Scientific ，型号：TX-400，目录号：75003181 ）和水桶（Thermo Fisher Scientific ）的50 ml反应管（Thermo Fisher Scientific ，型号：Heraeus Multifuge X1R，目录号：75004250 ），目录号：75003655 ）和适配器（Thermo Fisher Scientific ，目录号：75003683）
Termoblock （Eppendorf，型号：Thermo Mixer C ，目录号：5382000015）
pH计（Thermo Fisher Scientific，型号：FE150pH，目录号：S35924）
琼脂糖腔，凝胶浇铸机，梳子和电源（Bio - Rad，Mini-sub Cell GT系统和电源组，目录号：1645050）
凝胶可视化（Bio - Rad，Gel Doc XR +凝胶文献系统，目录号：1708195EDU）
PCR热循环仪（Eppendorf，Mastercycler Nexus X2热循环仪，货号：6336000015）

软件
AMUSER [ http://www.cbs.dtu.dk/services/AMUSER（Genee等人，2015）]
DNA序列设计工具，例如Benching或Geneious （Biomatter Ltd.）

程序

图1.设计用于基因组操作的整合载体。在这个例子中，我们说明了用于删除恶臭假单胞菌染色体上的基因xyz的质粒的构建。首先，用Phusion U DNA聚合酶扩增pSNW质粒主链以及xyz侧翼的两个同源臂（HA1和HA2），从而引入包含单个脱氧尿苷核苷（dU ）的互补同源突出端。将扩增子合并，并用尿嘧啶切除试剂（USER ）消化，从而去除dU ，形成单链突出端。片段的随后的退火后，质粒被输送到化学感受态大肠杆菌DH5 α λ PIR细胞。

整合载体的克隆
用于特定基因组操作的自杀质粒由通用pSNW质粒主链（请参见表1 ），上游同源臂（HA1）（如果适用）组成：要插入目标位点的DNA序列和下游同源臂（HA2））（图1 ）。这些片段中的每一个都是PCR扩增的。因此，每个构建体需要三到四对引物。

表1。用于共整合的自杀质粒

确定恶性疟原虫染色体上目标基因或基因座两侧的两个区域的序列。
上游同源臂（HA1，参见图1 ）跨度从染色体靶标的上游500-700bp到要删除或编辑的序列的第一碱基或整合位点。相反，下游同源臂（HA2，参见图1 ）在染色体靶标的最后一个碱基之后开始，并在下游进一步终止500-700 bp。

提示：我们建议保留目标基因的START和STOP密码子完整无缺，并仅删除中间序列，以最大程度地减少由于基因缺失而产生极性效应的机会，并避免潜在地产生有毒的截短的多肽。

设计用于构建特定应用pSNW质粒的引物
可以将pSNW系列的质粒线性化以用于USER克隆，每个步骤使用相同的引物对（pSNW -USER_F：5'- AGT CGA CC U GCA GGC ATG CAA GCT TCT -3'，而pSNW -USER_R：5'- AGG ATC U AG AGG ATC CCC GGG TAC CG -3'；dU残基在引物序列中以红色突出显示），因此对于每种基因组操作，只需设计插入特异性引物。

打开AMUSER在线软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/AMUSER/），然后输入每个片段的序列，这些片段包含在步骤1中识别的pSNW质粒插入片段（HA1，HA2，如果适用：整合）片段）以FASTA格式显示（包括带有“>”和DNA序列的标头）。在步骤2：输出构造中，选择线性，然后单击提交查询。AMUSER报告中的引物序列可直接用于片段扩增。将基序5'-AGA TCC U -3'作为引物突出到HA1的正向引物上，将5'- AGG TCG AC U -3'作为引物突出到HR2的反向引物。这两个突出端与用于线性化向量pSNW的突出端匹配。

提示：还可以为Gibson Assembly或Golden Gate克隆建立标准的克隆程序，以简化流程。

一组标准的引物可用于在菌落PCR中构建pSNW衍生物后检查正确的插入片段大小，以及对插入片段进行测序。两条引物在紧接插入区上游（pSNW_seq_F ：5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT -3'）和下游（pSNW_seq_R ：5'- CTT TAC ACT TTA TGC TTC CGG -3'）的pSNW主链内结合，分别。

设计基因组操作后进行基因分型的引物
设计一对分别在基因组中HA1上游50 bp和HA2下游50 bp范围内结合的引物。这些引物用于重组步骤后通过整合载体pSNW来测试细胞的基因型。对于不改变包含两个HA的序列的总长度的小插入或修饰，在插入/修饰内特异性结合的另外的引物有助于鉴定工程基因型。

通过PCR扩增区域
我们建议使用“T ouchdown”温度协议（唐等人对每个PCR扩增，1991）（见表2 ），因为它绕过了退火温度和引线优化以更高的产率和特异性（需求Korbie和Mattick ， 2008）。使用5 ng质粒扩增载体pSNW，进行小量制备以提高模板浓度和纯度，并使用Phusion U热启动DNA聚合酶引物pSNW -USER_F和pSNW -USER_R （请参见食谱3 ）。使用表2中所示的温度规程，延长时间为3分钟。采用相同的温度方案扩增构成pSNW插入片段的每个片段，仅根据扩增子的长度调整延伸步骤的持续时间。利用纯化的基因组假单胞菌DNA与适当的引物对生成HR1和HR2片段。如果需要，执行其他PCR，以生成插入所需的DNA片段。

提示：我们建议根据制造商的说明，使用凝胶和PCR纯化试剂盒对线性化的pSNW片段进行凝胶纯化。通过将纯化的产物用作未来PCR的模板，可以省略DpnI的消化以去除环状质粒（即模板）。我们进一步建议在多个并行PCR中生成大量线性化的pSNW载体，以便在USER克隆中重复使用。

表2 。Phusion U PCR的着陆温度协议

检查琼脂糖凝胶上的PCR
分析3- μ通过琼脂糖凝胶电泳每个PCR的等分试样升[1％（W / V）琼脂糖和1 ×荧光核酸凝胶染料在1 × TAE缓冲液]，以确认所述片段的正确放大。相对扩增子浓度s可以根据其条带的强度进行半定量估计。如果琼脂糖凝胶电泳显示存在非特异性副产物，则必须按照生产商的说明，使用凝胶和PCR纯化试剂盒从凝胶上切下所需的条带并纯化，然后再进行克隆。如果产物看起来干净，则PCR反应可直接用于组装反应。

用户反应
在PCR管中，将等摩尔量的所有片段（HR区域，插入片段和骨架）混合在10 µl中，总量约为50 ng。加入1 µl 1 U µl –1 USER酶。设置一个热循环仪并运行以下反应程序：脱氧尿嘧啶切除：在37°C下30分钟；退火1 ：从28℃至18℃下用降低- 2℃每的每3分钟步骤; 退火2：10分钟，并保持在10°C。

!!! 如果使用质粒作为模板扩增包含与所用pSNW载体相同的抗生素抗性的片段之一，请在反应混合物中加入0.5 µl FastDigest DpnI ，然后在37° C下孵育！

转化大肠杆菌DH5 α λ PIR细胞
变换50微升（或100微升）化学感受的等分试样大肠杆菌DH5 α λ PIR细胞与来自前一步骤的装配反应的5微升（或10微升）。要准备感受态细胞并用组装的质粒转化它们，我们建议使用Mix＆Go！大肠杆菌转化缓冲液集（Zymo研究）和相关协议。将质粒递送到细胞中后（通过热休克或温育，请参见Mix＆Go！说明手册），添加1 ml SOC培养基，并在37°C下温育200到300 rpm并孵育1 h。将细胞以10,000 × g的速度沉淀1分钟，重悬于50-100 µl SOC培养基中，并将悬浮液铺在补充有pSNW质粒相应抗生素的LB琼脂平板上。

!!! 关键：必须使用带有λ噬菌体衍生的pir基因的大肠杆菌菌株复制ori （RK6）！

提示：如果环状质粒是在PCR作为模板用于向量的线性化pGNW并且如果将反应混合物直接用于装配反应（而不是使用凝胶纯化的质粒），传播转化大肠杆菌我DH5 α λ琼脂平板上的pir细胞含有40 µg ml –1的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-吡喃半乳糖苷（X-Gal）。的破坏的pSNW -borne的lacZ α序列然后允许的大肠杆菌菌落的鉴定窝藏经由他们的蓝色“空”的模板质粒颜色对比的白色菌落，背着pSNW与插入件。

检查正确的插入尺寸
执行菌落PCR（使用一个的Taq ® 2 ×上八至十个菌落，显示下蓝光曝光（与转化的检查板的绿色荧光主混合物）大肠杆菌DH5 α λ PIR上的蓝色光透用引物）pSNW_seq_F和pSNW_seq_R 。为此，制备50微升1 ×通过混合25微升主混合物之一的Taq ® 2 ×主混合物与23微升DNA酶-free水和1μl的每种引物（必要时扩展）。将6 µl 1 ×预混液转移到PCR管中，并从培养板上生长的大肠杆菌菌落中添加少量生物质。使用以下温度规程运行PCR（表3 ，根据预期的插入片段大小调整延长时间）。

!!! 对于大肠杆菌，恶臭假单胞菌和许多其他细菌，可使用移液器吸头或接种环将菌落中的少量生物质直接转移至反应混合物中（避免将琼脂从平板转移至反应混合物中，因为这会抑制琼脂放大）。对于某些细菌，为了获得良好的扩增结果，可能有必要先将水中的生物质煮沸并稀释后再进行菌落PCR。

表3. OneTaq菌落PCR的着陆温度协议

检查琼脂糖凝胶上的菌落PCR
分析3- μ通过琼脂糖凝胶电泳每个PCR的等分试样升[1％（W / V）琼脂糖中1 × TAE缓冲液]，以确认正确的插入物大小。

通过测序验证插入序列的完整性
如果在琼脂糖凝胶上看不到除预期大小以外的其他条带，则可将反应样品直接送出进行测序。为此，混合0.5 μ升的PCR反应物与14.5 μ升DNA酶自由水和2的μ升引物pSNW_seq_F或pSNW_seq_R （对于每个引物和每一个样品测序的大肠杆菌克隆）在从一个条形码管Mix2Seq试剂盒，然后将试管发送进行测序。如果琼脂糖凝胶中出现非特异性条带，则在50 ml离心管中接种3-5 ml LB培养基（添加相应的抗生素），并用三个单独的克隆进行测试，以检测插入片段的正确大小。将培养物在37°C下于180-250 rpm的振荡培养箱中孵育12-18 h（取决于培养箱的类型）。从大肠杆菌培养物中纯化质粒DNA，然后将纯化的质粒DNA发送进行测序。在恶臭假单胞菌的后续步骤中使用经过序列验证的质粒。

自杀质粒整合到所需的基因组座位
恶臭假单胞菌的转化
遵循制备电感受态假单胞菌细胞的配方（配方4 ）。用300-500 ng先前构建的pSNW质粒电穿孔细胞（请参阅步骤A ）。图2概述了本节中描述的过程。

提示：如果菌株的能力低或质粒的整合效率低，则可以使用三亲结合来代替电穿孔。参见Martínez-García和de Lorenzo（2011），Sánchez-Pascuala等人的协议。（2017）和Durante-Rodríguez等人。（2018）了解更多详情。

图2.基因组编辑程序概述。1a）用来自pSNW系列的自杀质粒转化恶臭假单胞菌。1b）通过在选择性培养基上铺板来加强载体的基因组整合。1c）通过抗生素抗性菌落的绿色荧光确认基因组整合。2a）确认的共整合物在选择培养基中繁殖，并用来自pQURE系列的辅助质粒进行电穿孔。2b）通过来自pQURE的I- SceI的表达来解决共整合。2c）通过稀释划线获得来自悬浮液的单个菌落，并且2d）通过不存在GFP荧光来证实共整合的分辨率。2e）通过菌落PCR确认所选菌落的基因型；菌落可以是回复体，也可以携带所需的基因组改变。3a）修饰的克隆在非选择性培养基中繁殖。3b）通过稀释划线获得单个菌落，并通过不存在红色荧光来鉴定丢失pQURE的克隆。

电镀
用卡那霉素将pSNW2涂在LB琼脂上; 庆大霉素用于pSNW6或链霉素用于pSNW4，并在30 °C下孵育平板约16小时。根据要编辑的菌株，可能必须调整生长条件。生长的菌落应足够大，以识别蓝光透射照明器上的荧光，并易于通过接种环进行拾取。

透照仪的荧光检查
整合了自杀质粒的菌落应显示绿色荧光（图3A ）。在后续步骤中标记几个荧光菌落。

提示：电镀后，由于荧光团的成熟，荧光会随时间显着增加。因此，可将板在室温或在较低温度（4°C）下延长孵育时间，以增强信号强度。通常，所有抗生素抗性菌落都应显示绿色荧光。（不太可能）没有荧光可能表明存在污染物。

解决整合问题
证实的共整合体的繁殖和pQURE质粒的转化
拾取六个共整合菌落，通过荧光验证，然后将其生物量一起转移到装有适当抗生素的50 ml离心管中的10 ml LB培养基中。于30 °C振荡孵育约16 h。准备用于电穿孔的培养物，并使用约10 ng的pQURE质粒（表4 ）。将2 mM的3- m Bz直接添加到回收介质中。

!!! 选择一个pQURE变体，其抗生素抗性与所使用的自杀质粒和生物相容（即，没有天然抗性，并且与用于pSNW的抗生素抗性标记不同）！

!!! 关键：从现在开始，省略用于选择pSNW共整合的抗生素，否则将选择pSNW内的突变，排除其成功解决的可能性！

表4.用于共整合的质粒

引起双链断裂和同源重组事件
继续培养细胞2小时，然后添加适当的抗生素以选择pQURE 。1-3小时后，无论是（我）板70的体积μ升到LB琼脂补充有2mM 3-米BZ和合适的抗生素以选择用于pQURE并在30过夜孵育所述板℃下，和/或（ii）将悬浮液转移至10 ml具有2 mM 3- m Bz的选择性LB培养基中，并在30 °C振荡下继续温育约16小时。

提示：在选择性液体培养基中生长的时间越长，分离效率越高，获得包含具有所需遗传改变的回复子和细胞的遗传异质菌落的机会就越少。分辨效率在不同位点之间可能有很大差异。

分离单个突变体
如果在上一步中选择了（ii），请在具有2 mM 3- m Bz的选择性（对于pQURE ）固体培养基上进行培养物稀释。

提示：您需要数十个孤立的殖民地。您可以在单个平板上一次培养一次进行多次稀释，以增加分离菌落的数量。

检查蓝光透射灯上的荧光
分离出的菌落不显示绿色荧光，在蓝光照射下应显示为红色（来自pQURE编码的RFP ，图3B和3C ）。通常，大多数殖民地都会得到解决。标记几个没有绿色荧光的菌落，以供进一步分析。

!!! 关键：平板中的3-mBz被某些微生物（例如恶臭假单胞菌）缓慢降解，导致菌落和周围培养基呈棕色。长时间存放（数天至数周）后，产生的棕色颜料会掩盖菌落的荧光，因此，应立即标记菌落！！！

图3.基因组工程过程不同步骤的示例板。A.自杀质粒共整合后，在孵育约24小时后，恶臭假单胞菌的菌落显示绿色荧光（标有绿色圆圈）。B.孵育约18小时后分辨培养。大多数菌落显示淡红色（带有绿色圆圈）。只有少数显示绿色荧光（带有红色圆圈标记）。后者仍包含共整合质粒。C.孵育约24小时后，培养带有固化菌落的培养板。保留几个没有红色荧光的分辨菌落（以绿色圆圈突出显示）以进行进一步分析。

检查已解析菌落中的基因组编辑
使用A3中设计的基因分型引物，通过菌落PCR（请参阅A8和表3 ）检查至少八个菌落的目的基因座。对于基因组缺失或插入，两种基因型的扩增子大小不同，因此可以对其进行鉴定。对于小的插入或序列替换，对修饰的序列特异的引物与结合在相反链上的外部引物将产生仅对于修饰的基因型的产物。的比例回复体，即，未修饰的基因型，和修饰的基因型可以变化很大，这取决于无论是对两种基因型的一个健身优点或修饰的基因座的序列背景。

提示：扩增区域的等分试样可直接用于测序。为此，添加0.5微升的PCR产物，以14.5微升的DNA酶-free水和2微升用于其扩增相应的引物。对于对细菌的生长造成严重损害的基因组操作，使用CRISPR / Cas9反向选择可以促进获得所需的突变基因型[请参见Wirth等。（2020）和Volke等。（2020年）]。

辅助质粒的固化
繁殖具有所需基因型的菌落
用来自单个菌落的生物量接种10 ml不含任何添加剂（既无抗生素，又不含3- m Bz）的LB培养基。将培养物在30 °C下孵育，直至达到固定相（通常过夜）。

提示：使用尽可能少的生物质以在液体LB培养基中最大程度地复制细胞是有利的。

固化菌株的选择
在没有抗生素或3- m Bz的LB平板上稀释培养液的条纹，以获得分离的菌落。在30 °C下孵育平板约16小时。通过不存在红色荧光，可以在蓝光透射照明器上鉴定质粒固化的菌株。

提示小号：

蓝光透射灯创建的波长对于RFP可视化不是最佳的。因此，需要大量的成熟RFP。由于RFP的成熟时间较长，因此将板在4-8°C下孵育几个小时有助于增加荧光强度。该信号在几天内会逐渐成熟，甚至可以在4°C下孵育2天后用肉眼看到。
使用的光源的波长更靠近最大激发RFP的（即，558纳米）显著增加荧光信号，使菌落的选择具有相对低的RFP的水平。
储存固化的工程菌株
用治愈的菌落接种10 ml LB培养基。在30 °C下孵育约16小时后，您可以存储菌株或继续对其进行处理。

菜谱

3-甲基苯甲酸（3- m Bz）溶液（500 mM）
每250毫升成分
3-甲基苯甲酸17克
将3- m Bz加入200 ml蒸馏水中
用磁力搅拌器剧烈搅拌并插入pH探针
逐滴添加5 M NaOH溶液，直到所有3- m Bz溶解并且pH达到7.0
充满蒸馏水至250毫升
无菌过滤器具有0.2的溶液μ微米的过滤器
注：小号olution可在室温下保存数月。在使用前，将3-mBz以1：500的比例添加到培养基中。让熔化的琼脂冷却至〜50 °C，然后添加3-mBz并立即浇铸板。

蔗糖溶液（300 mM）
每500毫升成分
蔗糖52.3克
将蔗糖加到400毫升蒸馏水中
用磁力搅拌器剧烈搅拌直至溶解
加满蒸馏水至500毫升
无菌过滤器具有0.2 μ微米的过滤器
注意：溶液可以在室温下保存几个月。建议分装（50 ml）以防止污染。

聚合酶链反应（PCR）
每50μl [ μl ]中的成分
Phusion U 0.5
NTP 1
缓冲液HF 10
DMSO 1.5
寡核苷酸各2.5
模板10 ng质粒（或生物质）
H 2 O填充至50μl
电感受态假单胞菌细胞
在50 ml管中用单个菌落接种10 ml LB培养基。
在30 °C的振荡培养箱（200-250 rpm）中将培养物培养约16小时。
注意：除非另有说明，以下所有步骤均在室温下执行。

通过离心（4,000 × g ； 10分钟，室温）收集细胞，重悬于1 ml 300 mM蔗糖中，并转移至微反应管（1.5 ml或2 ml）中。
通过离心（10,000 × g ，1分钟，室温）沉淀细胞，并重悬于1 ml蔗糖溶液中。
重复洗涤步骤（重悬和离心）两次。最后，重悬在400颗粒μ升300 mM的蔗糖。细胞悬浮液可以在使用前在冰上保存数小时，也可以直接转化。
混合100 μ升的细胞悬浮液用10纳克或> 200分别纳克DNA为复制或自杀质粒，。电穿孔（2.5千伏，25 μ ˚F电容，200Ω电阻），立即加入1毫升的LB培养基，将悬浮液转移到一个试管（推荐：14毫升圆底试管）。将细胞在30 °C下以200-250 rpm摇动恢复2小时。
注意：在以下步骤中，如果不需要分离的克隆，则可以将培养物铺板以获得单个转化体，或将悬浮液转移到选择性液体培养基中。

抗生素原液
卡那霉素：将0.5 g卡那霉素溶解在10 ml M illiQ水中。

庆大霉素：将0.1克庆大霉素溶于10毫升M illiQ水中。

链霉素：将0.5 g链霉素溶解在10 ml M illiQ水中。

注意：无菌过滤溶液并等分1 ml。解决方案可以存放在- 20 ℃，数月。立即以1：1,000的比例将抗生素储备溶液添加到液体和固体介质中。在加入抗生素并立即浇铸板之前，让融化的琼脂冷却至〜50 °C 。

致谢

作者感谢实验室的所有成员对协议进行测试并提供了有益的改进建议，特别是对参与开发该协议所基于的原型的Laura Friis表示感谢。这项工作得到了诺和诺德基金会（NNF10CC1016517和NNF18CC0033664），丹麦独立研究理事会（SWEET ，DFF研究项目8021-00039B）和欧盟的Horizon2020研究与创新计划（资助协议号为814418（SinFonia ）。该协议已改编自Volke等人。（2020）。

利益争夺

作者宣称没有潜在的利益冲突。

参考

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