材料和试剂
1. T-75弹药枪（Corning，目录号：430641U）
2. 0.22 µm或0.45 µm膜（Millipore，目录号：GSWP04700）
3. MCF-7细胞系（ATCC，ATCC ® HTB-22 TM ），存储：液氮在不使用时。冷冻保存：遵循ATCC的建议
4. 1毫升注射器
5. 14毫升，敞口薄壁超透明管，14 × 95毫米，50Pk（Beckman Coulter Life Sciences，目录号：344060），存储：室温
6. Vivaspin 20离心浓缩器，MWCO 10 kDa ，PES膜（Sartorius，目录号：VS2001），存储：室温
7. 96孔标准测定块，2毫升，不含认证的RNase / DNase，用于收集色谱部分（Costar，Corning Incorporated，目录号：3961），存储：室温
8.的Superdex ® 200 10/300 GL（GE生命科学，西格玛/ Merck的，目录号：GE17-5175-01，停产产物;备选：的Superdex ® 200增加10/300 GL，目录号：GE28-9909-44），储藏：常温
9. DMEM，高葡萄糖，GlutaMAX TM Supplement （Gibco，Thermo Scientific，目录号：10569010），存储：4°C
10.胎牛血清（FBS），合格，原产地：巴西（Gibco，Thermo Scientific，目录号：12657029），储存：在-20°C下等分（无菌）
11. MEGM TM乳腺上皮细胞生长培养基BulletKit TM （Lonza，目录号：CC-3150），保存：基础MEBM培养基保存在4°C
注意：MEGM SingleQuots TM补充剂储存在-20°C下。混合后，将完整的MEGM培养基储存在4°C直至到期。我们不添加牛垂体提取物或试剂盒中包含的抗生素。

12. DPBS，无钙，镁无（GIBCO，热科学，目录号：14190144），存储：4℃ 。使用这种无菌溶液进行细胞培养
13. DPBS（10 ×），无钙，镁无（GIBCO，热科学，目录号：14200075）。用超纯水或DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的水制成1 ×溶液，过滤，并在尺寸排阻色谱法中用作流动相
14.胰蛋白酶-EDTA（0.05％），酚红（Gibco，Thermo Scientific，目录号：25300062），保存：-20°C
15. RNase抑制剂，鼠类（New England Biolabs，目录号：M0314S），存储：-20°C
16. TRIzol TM试剂（Invitrogen，Thermo Scientific，目录号：15596018），存储：4°C
17. TRIzol TM LS试剂（Invitrogen，ThermoScientific ，目录号：10296028），存储：4°C
18. 2-丙醇，用于分子生物学（Sigma-Aldrich，目录号：I9516-500ML），储存：室温。基于TRIzol方法进行RNA纯化所需的试剂
19.纯净的乙醇，用于分子生物学，存储：室温。基于TRIzol方法进行RNA纯化所需的试剂
20.糖原，RNA级（Thermo Scientific，目录号：R0551），储存：-20°C 。基于TRIzol方法进行RNA纯化所需的试剂
21. UltraPure TM不含DNase / RNase的蒸馏水（Invitrogen，ThermoScientific ，目录号：10977035），存储：室温，无菌
注意：我们不要将这种水用于大量的缓冲液中，例如用于体积排阻色谱的缓冲液。对于这些目的，我们使用军用升的iQ W¯¯亚特我们验证为无RNase的房子。可以使用经DEPC处理的高压灭菌水。在这种情况下，添加DEPC（焦碳酸二乙酯，Sigma，目录号：D5758）至终浓度为0.1％v / v，在室温下孵育过夜，然后高压灭菌以灭活DEPC。

22. 10 × Tris-Borate-EDTA电泳缓冲液（ThermoScientific ，目录号：B52），储存：室温
23.丙烯酰胺/双丙烯酰胺30％溶液，生物试剂，适用于电泳，29：1（Sigma-Aldrich，目录号：A3574），储存：4°C 。危险（阅读MSDS）
24. SYBR TM Gold核酸凝胶染料（10,000 × DMSO浓缩液）（Invitrogen，ThermoScientific ，目录号：S11494），存储：-20°C
25. RNA加载染料，2 × （New England Biolabs，目录号：B0363S），存储：-20°C
26. Qubit TM RNA HS检测试剂盒（Invitrogen，ThermoScientific ，目录号：Q32852），存储：4°C
27. NEBNext ®复用小RNA库准备集的Illumina公司® （新英格兰生物实验室，目录号：E7300S），存储： - 20℃
28. MiSeq试剂盒v2（300个循环）（Ilumina ，目录号：MS-102-2002），存储：-20°C （方框1）和4°C （方框2）

设备

Novex TM TBE-尿素凝胶（ThermoFisher ，目录号：EC6875BOX）
XCell SureLock微型电池（ThermoFisher ，目录号：EI0001）
ÄKTA纯FPLC系统（Cytiva ，前GE Life Sciences ），具有多个波长检测器（至少能够同时在280和260 nm进行检测）和自动馏分收集器，可容纳96孔测定模块（Costar，2 mL，RNase-免费，货号：3961）
Qubit TM荧光计2.0（Thermo Scientific，目录号：Q32866，停产的产品。由目录号Q33216代替）
MiSeq下一代音序器（Illumina）

软件

注：一个用于测序数据分析软件LL使用银河欧洲Web界面（运行https://usegalaxy.eu）。

fastx_clipper（fastx_toolkit）
Fastqc
RNA之星
BAM过滤器
bamCoverage
featureCounts

程序

注意：即使没有特别说明，在整个实验过程中也应将RNase污染的可能性降到最低。尽可能使用一次性不含RNase的塑料和经认证的不含RNase的溶液。即使在处理非危险试剂时，也应在所有步骤中都戴手套，并在被RNase污染的材料上被RNase污染的表面上工作。

细胞培养
注意：要成功完成此程序，必须在无血清培养基（SFM）中培养细胞，以避免存在血清RNase。在该协议中，我们将使用乳腺上皮生长培养基（MEGM，Lonza）和MCF-7细胞，但是可以将其适应于其他细胞系。但是，为每个细胞系找到合适的SFM并非易事。血清剥夺可引起细胞应激，这会影响细胞内和细胞外RNA谱。如Tosar等人所述。（2020），我们通过蛋白质印迹法检测eIF2亚基α（Ser 51）磷酸化水平，并通过非放射性Northern印迹法监测应激诱导的tRNA衍生片段的水平（Yamasaki et al。，2009）。对于某些细胞类型，可以使用商业SFM制剂。我们已经观察到MCF-7细胞可以在MEGM中短时间生长，MEGM是ATCC推荐用于其他乳腺上皮细胞系（例如MCF-10A）的生长培养基。但是，我们不添加在MEGM试剂盒中获得的牛垂体提取物以将其保留为化学成分确定的培养基。除非需要，否则我们也不会在细胞培养物中添加抗生素。从理论上讲，该协议可以稍加修改即可应用于悬浮细胞，3D培养和类器官，尽管我们尚未尝试过这些应用。

种子近轴。ø NE百万个细胞在每两个T-75烧瓶中的。生长细胞达60 -在完全培养基中70％融合（例如，DMEM + 10％FBS）中在37 ℃下和5％CO 2 。融合应根据每种细胞系的生长速率进行调整。目标是48小时后达到80-90％的汇合度。
洗涤细胞简要3 - 5毫升预热的DMEM或PBS。
加入10毫升预热的MEGM。生长细胞24小时。
再次用预热的MEGM清洗细胞。向其中一个烧瓶中加入10毫升预热的MEGM（以下称对照）。向第二个烧瓶中加入10 ml预热的MEGM + 80U（2 µl ）鼠RNase抑制剂（此后：经RI处理），再孵育24小时。
从两个烧瓶中吸出细胞条件培养基，并在15 ml无核酸酶的Falcon锥形管中排出。向RI处理的烧瓶中添加1 µl鼠类RNase抑制剂（仅）。在室温下以800 × g的速度离心细胞5分钟。
虽然离心细胞条件培养基，移动包含细胞单层到通风橱和裂解细胞的空烧瓶2 ml的的Trizol试剂。轻轻倾斜烧瓶以溶解所有细胞，在室温下孵育5分钟，然后移开盖子，将烧瓶储存在-20°C。以后将用于获取细胞内RNA谱。
将来自步骤A 5的上清液放入新的15 ml无核酸酶的Falcon锥形管中，并在4°C下以2,000 × g离心20分钟。我们通常将这次旋转的上清液（保存在新管中）保存在-20 °C供以后使用。

超速离心制备细胞外非囊性样品
注意：超速离心需要在原位进行专门的培训。本协议不能替代此培训。超速离心机使用不当会引起样品丢失，对昂贵设备的永久损坏，并使实验室人员的安全受到威胁。
通过将试管放入室温下装有水的烧杯中，将其从步骤A7解冻。交换几次水，因为水会迅速冷却。
在装有RI处理样品的试管中加入1 µl鼠RNA酶抑制剂。由于重组RNase抑制剂含有许多半胱氨酸并且易于氧化，因此我们通常添加这种增强剂以确保RNase活性不足。
在4°C下以2,000 × g的转速再次旋转样品20分钟，以去除可能在冷冻/融化过程中形成的沉淀物。
将样品放在两个相同的超透明超速离心管中。如果需要，调整样品的用冰冷的不含核酸酶的PBS的体积，使得所述管均达到满负荷减2 -从所述管的顶部为3mm。管路中所有相对的管子必须用相同密度的液体填充到相同的高度。
将试管放在水桶中。我们还检查包含填充的管那水桶显示重量等于或小于2毫克如果它们的差被放置在转子的相对的位置。将铲斗放在已经冷却的转子中（存放在冷藏室中过夜）。将转子放入超速离心机中，设置所有相关参数并开始真空。
注：˚F orgetting冷却转子在这个协议的发展隔夜发挥了重要作用。一位科学记者撰写了有关该情节的故事，提供了一些历史背景（Khamsi ，2020年）。

在4°C下以100,000 × g的速度运行2.5小时，最大加速度和断裂。
将步骤B 6中的上清液转移至新管中。将试管放在冰上。
使用Vivaspin 20单位（分子量截断值为10 kDa）在4 °C下通过超滤浓缩至500 µl 。在上样之前，请使用不含核酸酶的PBS或水运行超滤装置，以清洁膜。将浓缩液转移至新的无核酸酶的1.5 ml管中。

体积排阻色谱
注意：此过程需要进行两次，使用RI处理的样品和对照样品。使用FPLC系统还需要在现场进行特定的培训，因为将使用高压。避免在所有阶段将空气引入色谱柱，并避免注入含有灰尘或其他微粒的样品或溶剂。

使用真空过滤装置，通过0.22 µm或0.45 µm膜过滤500 ml超纯水和500 ml 1 × PBS（在超纯水中制备）。用电磁搅拌器在减压下对溶液脱气。
在FPLC系统中将警报设置为低于或等于色谱柱允许的最大压力（在这种情况下为1.5 MPa）。将Superdex 200 10/300色谱柱连接到FPLC系统。通过至少1.5体积的过滤和脱气水，从色谱柱上除去乙醇。用1 × PBS平衡色谱柱。
将500 µl定量环连接至系统。用水清洗回路，然后用过滤的PBS清洗。避免引入气泡。
将样品以10,000 × g的转速（从步骤B8开始）旋转4分钟10分钟 ℃。将上清液转移到新管中。
用1M升注射器，注射从样品步骤Ç 4（5在00微升）的列。
通过同时监测280 nm和260 nm的吸光度，以1 ml / min的流速运行。
的0.25收集馏分毫升使用新的，无RNase 96 -孔平板中。开始洗脱至少2 ml，然后洗脱与空隙体积相对应的馏分。
在两个样品中鉴定出的馏分均为ABS 260 > ABS 280 。与蛋白质相比，核酸在260 nm处吸收的紫外线比在280 nm处吸收的紫外线更多。因此，这些级分对应于核酸或核糖核蛋白复合物的洗脱。至少在MCF-7细胞中，对照样品应在Ve = 15 ml处显示一个260 nm的主峰（我们称其为“ P1”：调整后的Ve '= 7.5 ml），在Ve = 16.5 ml处显示一个较低的峰（即我们称为“ P2”：调整后的Ve '= 9.0 ml）。相反，在RI处理过的样品中不应看到P2峰，并且在空隙体积中应出现一个新峰（我们称其为“ P0”：Ve = 7.5 ml；调整后的Ve '= 0 ml）（图1 ）。

图1 。RI处理（上图）和对照（下图）样品的代表性色谱图。260 nm和280 nm处的吸光度分别以红色和蓝色显示。280/260> 1的峰对应于蛋白质的洗脱，而280/260 <1的峰对应于核酸和/或核糖核蛋白复合物的洗脱。V e ：洗脱体积。改编自Tosar等。（2020年）。

从两个样品中将对应于峰P0，P1和P2的馏分转移至新的1.5 ml无RNase试管中。即使没有明显的峰（例如，对照中的P0或经RI处理的P2），也要确保成对的馏分对应于相同的洗脱体积。
在通风橱中，加入750微升的Trizol试剂LS到每个收集的级分（250微升）。按照制造商的说明进行RNA提取。

RNA分析和下一代测序
将RNA沉淀重悬于9 µl无RNA酶的水中。使用每个样品1微升和Qubit荧光计（按照供应商的说明）检查RNA浓度。如果使用生物分析仪检查RNA完整性，请记住这些不是细胞内样品，因此RNA完整性编号（RIN）的概念在此不适用。然而，经RI处理的样品中的P0峰应包含完整的核糖体RNA。我们不使用Bioanalyzer，而是通过使用0.5 × Tris-硼酸盐-EDTA缓冲液。拌1微升各样品的1微升2的×适于变性polyacrylami样染料德凝胶电泳（图2 ）。预制凝胶可以被用作时间效益的替代定制凝胶（例如，的Novex TBE尿素，赛默飞，目录号：EC6875BOX;在所述运行XCELL型Surelock微小区，赛默飞，目录号：EI0001）。

图2.在变性聚丙烯酰胺凝胶中使用（+）或不使用（-）RI处理（左凝胶）或P0峰（右凝胶）的P1峰的分析。细胞：从MCF-7细胞提取的细胞内RNA。显示了对应于tRNA，5S rRNA，5.8S rRNA，7SL RNA，18S rRNA和28S rRNA的条带。左侧的数字（100、200、300）对应于RNA阶梯的迁移（未显示）。凝胶显示P1峰中的RNA从全长tRNA（+ RI）变为大约30 nt的小RNA （-RI）。相反，P0中的RNA较大，并且明显可见28S，18S和5.8S rRNA大小的条带。改编自Tosar等。（2020年）。

使用剩余的7 µl每个样品，使用小型RNA试剂盒（例如用于Illumina的NebNext小型RNA测序试剂盒）进行测序文库制备。在Illumina平台中执行单端测序。在我们的研究中（Tosar等人，2020年），我们进行了200个循环的测序，以便能够基于凝胶电泳结果检测一些全长RNA（例如5.8S rRNA），而不仅是它们的片段（图2 ）。。但是，这样做有一个主要缺点。由于芯片中的大多数簇都包含较小的插入片段，因此测序时间超过150个周期会引发整个适配器的测序，聚合酶的流失以及测序反应的中止终止，然后再进行多路分离，至少在MiSeq台式测序仪中是如此。我们使用的那个。数据分析仍然可以执行，因为索引将包含在每次读取序列的一部分中。然而，从一个被中止运行中提取数据并不简单，我们建议不进行长于100 - 150次，除非理解正在做什么。

清单数据分析小号

如Tosar等人所述分析数据。（2020年）。简要地说，鉴定并剪切3'衔接子序列，将剪切的读段映射到人类基因组，并计数与microRNA，tRNA，rRNA，snRNA，snoRNA，YRNA和Vault RNA对应的特征。可以消除低质量的读数，但不要在读数末尾修剪低质量的碱基，因为这样做会产生使解释复杂化的人工3'变体。RI处理样品与对照样品之间的P1峰比较如图3所示。请注意，在RI处理的样品中28S rRNA的内部片段与全长U49 snoRNA之间鉴定出假定的二聚体，而在对照中则完全不存在。这是RI-SEC-seq如何识别由于细胞外稳定性低而在常规exRNA分析中丢失的细胞外非囊泡RNA复合物的例子（与由30-31个核苷酸的甘氨酸5'tRNA半部分形成的高度稳定的二聚体相比））（Tosar等人，2018和2020）。

图3 。RI-SEC-seq结果概述。一。小RNA测序的大小分布读取映射到RI处理（上图）或对照样品（下图）的P1峰中的不同ncRNA（参见图例）。RPM：每百万映射读取的读取。数字表示5'tRNA来源的读段的长度。乙。相同，但仅显示与rRNA对齐的读段（红色为28S rRNA，橙色为5.8S rRNA，黑色为5S）。在这种情况下，数字表示大多数读取的起始位置。Ç 。预测SNORD49A的表示（U49A;黑色）/ 28S rRNA的（红色）的相互作用，如在所描绘snoRNABase （www-snorna.biotoul.fr）。以下是读取次数最多的序列。它的相对丰度表示为每百万映射读（RPM）的读。还显示了其在“ P1 + RI”数据集中的排名。改编自Tosar等。（2020年）。

笔记

RI-SEC-seq在exRNA分析中纳入了细胞外稳定性差异的概念。但是，它受到所应用的测序方法的限制。例如，我们知道，在RI处理的样品中P1峰主要包含全长tRNA，这在图2中显而易见。但是，在RI处理的样品中P1的测序未显示出与全酶切相对应的大量读数。长度的tRNA。相反，大多数tRNA衍生的读段对应于5'tRNA一半（图3 ）。因此，应将RI-SEC-seq与正交技术（例如Northern blot和密度梯度离心法）结合使用，以获得更具有代表性的细胞外RNAome图片。备选地，本文所述的小RNA测序技术可以替代能够对全长tRNA及其片段进行测序的替代方法，例如TIGRT-seq （Qin等人，2016； Shurtleff等人，2017）。
在P1 + RI和P1 – RI之间，tRNA衍生片段的长度有所变化。的33片段- 34 NT被RI处理的样品中观察到，但它们在对照（丢失图3A ）。通过Northern印迹观察到类似的模式（Tosar等，2020）。原因是包含全长tRNA（如PI + RI）的样品的主要切割产物是33' - 35 nt的5'tRNA一半（及其同源的3'一半，通常较难测序）。然而，较短的30 5'半部分- 31趋于稳定得多。这可能是由于二聚体的形成（Tosar et al。，2018）或与细胞外RNA结合蛋白的相互作用，具有大小依赖性。因此，5'的半部30 - 31 NT （主要衍生自的tRNA甘氨酸）往往当RNA酶活动更高积累。因此，RI-SEC-seq可以识别单个RNA类（例如，较短和较长的5'tRNA一半之间）以及不同RNA类之间的不同RNA稳定性的差异（图3A ）。
P0（经RI处理的样品）中的小RNA测序显示了多种rRNA衍生片段，主要来自28S rRNA。但是，图2清楚地表明，在P0中洗脱的RNA具有高分子量。应该注意的是，当对主要包含全长长的非编码RNA（例如28S和18S rRNA）的样品进行小RNA测序时，将仅检索其片段。这可能会导致误解，认为exRNA在明显没有的情况下主要是片段化的。我们发现对应于全长5.8S rRNA的大量读物进一步证明了这一点，该读物足够短以适合我们的测序窗口。通过将RI-SEQ-seq与质谱，Western印迹和速度梯度相结合，我们发现P0峰包含由rRNA和核糖体蛋白组成的核糖核蛋白复合物。因此，RI-SEQ-seq方法的发展是导致发现细胞外核糖体的关键步骤（Khamsi，2020； Tosar等，2020）。
该协议的应用扩展到任何情况下，捕获捕获到细胞外空间的整套RNA而不是仅最稳定的RNA（即，甘氨酸或谷氨酸的5'tRNA一半和与EV相关的RNA）都很重要。例如，测试细胞外空间如何在感染细胞和非感染细胞之间，或应激细胞和非应激细胞之间反映细胞内基因表达的变化。此外，RI-SEC-seq是分析细胞外RNA加工机制和exRNA生物发生的有价值的工具。

菜谱

商业试剂并浓缩缓冲液中使用throught这个协议中，上面所指示的。然而，大多数这些缓冲液通常在分子和细胞生物学实验室中使用，并且可以很容易地由普通固体原料制成。在这种特殊情况下，我们选择购买商业解决方案，以在整个方案中将RNase污染降至最低。

致谢

接收到该工作从以下来源资金：AGENCIA国立Investigación ë INNOVACIÓN （ANII，乌拉圭）[FCE_3_2018_1_148745]; Comisión扇形德Investigación Científica （CSIC- UdelaR ，乌拉圭）健康，美国的[MIA_PAS2019_2_99]和国家机构[UG3CA241694，由美国国立卫生研究院共同基金的支持下，通过NIH院长的战略协调/办事处的办公室。JPT和AC是来自PEDECIBA（乌拉圭），国家研究人员系统（ANII）和UdelaR的全心投入计划的研究人员。

该协议的基本原理首先在Tosar等人中提出。（2018），但RI-SEC-seq在Tosar等人中正式开发。（2020年）。该协议中显示的所有数字均摘自后者的出版物。

利益争夺

没有声明

参考

阿罗约（JD），切维尔（Chevillet），JR，克鲁（Kroh），EM，Ruf ，IK，普里查德（Pritchard），CC，吉布森（Gibson），DF，米切尔（Mitchell），聚苯乙烯（PS），贝内特（Bennett），CF，波戈索娃-阿加德扬扬（Pogosova-Agadjanyan），EL，施泰洛特（Stirewalt），DL，泰特，JF和特瓦里（M. （2011）。Argonaute2复合物携带着一群循环的microRNA，与人血浆中的小泡无关。美国科学学会Proc Natl Acad ，108（12）：5003-5008。
Chevillet ，JR，Kang，Q.，Ruf ，IK，Briggs，HA，Vojtech ，LN，Hughes，SM，Cheng，HH，Arroyo，JD，Meredith，EK，Gallichotte ，EN，Pogosova-Agadjanyan ，EL，Morrissey，C ，Stirewalt ，DL，Hladik ，F.，Yu，EY，Higano ，CS和Tewari，M.（2014）。外泌体microRNA含量的定量和化学计量分析。PROC国家科科学院科学USA 111（41）：14888-14893。
Dhahbi ，JM，Spindler，SR，Atamna ，H.，Yamakawa ，A.，Boffelli ，D.，Mote，P.和Martin，DI（2013）。5'tRNA一半以丰富的复合物形式存在于血清中，在血细胞中富集，并受到衰老和卡路里限制的调节。BMC基因组学14：298。
Hoshino，A.，Costa-Silva，B.，Shen，TL，Rodrigues，G.，Hashimoto，A.，Tesic Mark，M.，Molina，H.，Kohsaka ，S.，Di Giannatale ，A.，Ceder ， S.，辛格，S.，威廉斯，C.，Soplop ，N.，雨龙，K.，Pharmer，L.，特大，T.，Bojmar ，L.，戴维斯，AE，Ararso ，Y.，章，T 。，Zhang，H.，Hernandez，J.，Weiss，JM，Dumont-Cole，VD，Kramer，K.，Wexler，LH，Narendran ，A.，Schwartz，GK，Healey，JH，Sandstrom，P.，Labori ，KJ，Kure，EH，Grandgenett ，PM，Hollingsworth，MA，de Sousa，M.，Kaur，S.，Jain，M.，Mallya ，K.，Batra，SK，Jarnagin ，WR，Brady，MS，Fodstad ， O.，Muller，V.，Pantel ，K.，Minn ，AJ，Bissell，MJ，Garcia，BA，Kang，Y.，Rajasekhar，VK，Ghajar ，CM，Matei ，I.，Peinado ，H.，Bromberg， J.和Lyden ，D.（2015年）。肿瘤外泌体整合素决定嗜有机性转移。自然527（7578）：329-335。
卡鲁，R。和LeBleu ，VS（2020）。外泌体的生物学，功能和生物医学应用。科学367（6478）。
Kamerkar ，S.，LeBleu ，VS，Sugimoto，H.，Yang，S.，Ruivo ，CF，Melo，SA，Lee，JJ和Kalluri ，R.（2017）。外泌体促进胰腺癌中致癌性KRAS的治疗靶向。自然546（7659）：498-503。
Khamsi，R.（2020年）。寻找细胞外核糖体的生物学家。自然582 ：S6 - S8。
R.Kojima，R.，Bojar，D.，Rizzi，G.，Hamri，GC-E。，El-Baba，MD，Saxena，P.，Ausländer，S.，Tan，KR和Fussenegger，M.（2018）。由植入细胞产生的设计外泌体在脑内为帕金森氏病的治疗提供了治疗依据。自然公报9（1）：1305。
Li，K.，Rodosthenous ，RS，Kashanchi ，F.，Gingeras ，T.，Gould，SJ，Kuo ，LS，Kurre ，P.，Lee，H.，Leonard，JN，Liu，H.，Lombo ，TB，妈妈，S.，诺兰，JP Ochocinska ，MJ，Pegtel ，DM，Sadovsky ，Y.，桑切斯-马德里，F.，巴尔德斯，KM，维克斯，KC，韦弗，AM，Witwer，KW，曾，Y.， Das，S.，Raffai ，RL和Howcroft ，TK（2018）。细胞外RNA生物学的进步，挑战和机遇：NIH exRNA战略研讨会的见解。JCI Insight 3（7）：e98942。
Nechooshtan ，G.，Yunusov ，D.，Chang，K. and Gingeras ，TR（2020）。RNase 1的加工在细胞外环境中形成tRNA一半和独特的Y RNA片段。核酸研究48（14）：8035-8049。
O'Brien，K.，Breyne ，K.，Ughetto ，S.，Laurent，LC和Breakefield ，XO（2020）。哺乳动物细胞中细胞外小泡的RNA输送及其应用。Nat Rev Mol Cell Biol 21（10）：585-606。
秦，Y.，瑶，J.，吴，DC，诺丁汉，RM，莫尔，S.，Hunicke -史密斯，S.和Lambowitz ，AM（2016）。通过使用热稳定的II组内含子逆转录酶对人血浆RNA进行高通量测序。RNA 22（1）：111-128。
Shurtleff，MJ，Yao，J.，Qin，Y.，RM诺丁汉，Temoche-Diaz，MM，Schekman，R.和Lambowitz，AM（2017）。YBX1在定义外泌体的小非编码RNA组成中起着广泛的作用。美国国家科学院院刊114 ：E8987 - E8995。
Srinivasan，S.，Yeri ，A.，Cheah，PS，Chung，A.，Danielson，K.，De Hoff，P.，Filant ，J.，Laurent，CD，Laurent，LD，Magee，R.，Moeller， C.，Murthy，VL，Nejad ，P.，Paul，A.，Rigoutsos ，I.，Rodosthenous ，R.，Shah，RV，Simonson，B.，To，C.，Wong，D.，Yan，IK，张，X.，巴拉伊，L.，Breakefield ，XO，Daaboul ，G.，甘地，R.，拉皮迪，J.，Londin ，E.，帕特尔，T.，Raffai ，RL，索德，AK，亚历山大，RP ，Das，S.和Laurent，LC（2019）。跨多种生物流体的小RNA测序确定了exRNA分离的最佳方法。细胞177（2）：446-462 e416。
Thomou ，T.，Mori，MA，Dreyfuss，JM，Konishi ，M.，Sakaguchi ，M.，Wolfrum ，C.，Rao，TN，Winnay ，JN，Garcia-Martin，R.，Grinspoon，SK，Gorden ，P 。and Kahn，CR（2017）。脂肪循环的miRNA调节其他组织中的基因表达。自然542（7642）：450-455。
TOSAR ，JP，ģ á mbaro ，F.，桑吉内蒂，J.，博尼利亚，B.，Witwer，KW和Cayota ，A。（2015）。通过对乳腺癌细胞系进行高通量测序，揭示了将小RNA分为不同的细胞外部分的评估。Nucleic Acids Res 43（11）：5601-5616。
TOSAR ，JP，ģ á mbaro ，F.，来说有点，L.，潘塔诺，S.，Westhof ，E。和Cayota ，A。（2018）。二聚化使来自甘氨酸和谷氨酸tRNA的5'半部分对核酸酶的稳定性提高。Nucleic Acids Res 46（17）：9081-9093。
Tosar，JP，塞哥维亚，M.，Castellano，M.，Gambaro，F.，Akiyama，Y.，Fagundez，P.，Olivera，A.，Costa，B.，Possi，T.，Hill，M.，Ivanov ，P。和Cayota，A。（2020）。细胞外核糖体和tRNA的断裂形成细胞外RNAome。核酸研究48（22）：12874-12888。
Tosar ，JP，Witwer，KW和Cayota ，A.（2021）。回顾细胞外RNA的释放，加工和功能。Trends Biochem Sci ，在线印刷。Doi：10.1016 / j.tibs.2020.12.008 。
Turchinovich ，A.，Weiz ，L.，Langheinz ，A.和Burwinkel ，B.（2011）。细胞外循环微RNA的表征。Nucleic Acids Res 39（16）：7223-7233。
Yamasaki，S.，Ivanov，P.，Hu，GF和Anderson，P.（2009）。血管生成素可切割tRNA并促进应激诱导的翻译抑制。细胞生物学杂志185（1）：35-42。