材料和试剂
1.5 ml微量离心管（Fisher Scientific，目录号：05-408-130）
2 mm电穿孔比色皿（Fisher Scientific，目录号：FB102）
硝酸纤维素膜（Bio- R ad，目录号：1620112）
Nalgene TM Rapid- Flow TM带有尼龙膜的一次性过滤器灭菌装置（Thermo Scientific，目录号：09-740-24A）
Fisherbrand TM散装HDPE 7 ml闪烁瓶（Fisher Scientific，目录号：03-337-20）
Whatman TM无粘结剂玻璃微纤维过滤器，GF / C级（Cytiva ，目录号：09-874-32A）
DWK Life Sciences Kimble TM固体硼硅酸盐玻璃珠（Fisher S cientific，目录号：10-310-3）
清教徒TM医院标准棉签（费舍尔小号系统求解，目录号：22-029-684）
Sartoris TM Vivaspin TM 20离心浓缩器（Sartorius，目录号：14-558-501）
热科学TM的Nalgene TM速效流TM灭菌一次性过滤单元与尼龙膜（Fisher Scientific公司，目录号：0974024A）
滑动-A- Lyzer TM MINI透析装置，3.5K MWCO，0.5毫升（费舍尔小号系统求解，目录号：88400）
14 ml圆底管（Fisher Scientific，目录号：12-565-971）
250 ml的的Nalgene ®离心瓶（Sigma-Aldrich公司，目录号：Z353736）
巴斯德毕赤酵母SMD 1163菌株（Invitrogen）
pPIC9K载体（Invitrogen）
pPIC9K_ADORA2A（由pPIC9K设计）
XL-10- Gold TM超能感受态大肠杆菌细胞（安捷伦，目录号：200314）
BCA蛋白测定试剂盒（Pierce，目录号：PI23227）
咪唑（Fisher Chemical edge，产品目录号：03196-500）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
冰醋酸（Fisher Scientific，目录号：A385-500）
甲醇（Fisher Scientific，目录号：412-500或A412P4）
甘油（Fisher Scientific，目录号：G33-500）
d山梨糖醇（费希尔小号系统求解，目录号：S459）
G418硫酸盐（费舍尔小号系统求解，目录号：BP6735或野牛之公司，目录号：400-130-XG）
氨苄西林钠盐（Wisent Inc.，目录号：400-110-EG或Fisher Fisher，目录号：BP176025）
LB米勒汤（Wisent Inc，目录号：800-061-1K）
LB琼脂米勒粉末（费舍尔小号系统求解，目录号：BP14252）
酵母提取物（Wisent Inc.，目录号：800-150-IK）
细菌学第一肽（Wisent Inc.，目录号：800-157-IK）
酵母氮源W / O阿明ø酸（野牛之公司，目录号：800152018WG）
右旋糖（d葡萄糖）（费希尔小号系统求解，目录号：D16-500）
琼脂（费希尔小号系统求解，目录号：BP1423-500）
D-生物素（Sigma-Aldrich，目录号：2031）
L-组氨酸（Sigma-Aldrich公司，目录号：H8000-5G或Fisher小号系统求解，目录号：BP382100）
DMSO（Fisher Scientific，目录号：D1391）
茶碱（西格玛奥德里奇，目录号：T1633）
的NaCl（费希尔小号系统求解，目录号：S271-500）
双- Ť RIS（费舍尔小号系统求解，目录号：BP301-500）
十二烷基麦芽糖新戊二醇（MNG-3）（Anatrace ，目录号MG310）
胆固醇半琥珀酸酯（CHS）（Sigma-Aldrich，目录号：C6512）
Talon金属亲和树脂（TaKaRa ，目录号：635503）
（可选）液氮
Bam HI -HF（New England BioLabs ，目录号：R3136S）
无TI -HF（新英格兰生物实验室，目录号：R3189S）
PM EI （新英格兰生物实验室，目录号：R0560S）
T4 DNA连接酶（新英格兰生物实验室，目录号：M0202S）
快速CIP（新英格兰生物实验室，目录号：M0525S）
GenElute TM质粒微量制备试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：PLD35-1KT）
100％乙醇（Fisher Scientific，目录号：A4094）
HRP缀合的6 *他，His-标签单克隆抗体（Proteintech ，目录号：HRP-66005）
DDDDK TAG多克隆抗体（相当于FLAG ®抗体）（Proteintech ，目录号：HRP-20543-1-AP）
Zymolyase -20T（Amsbio ，目录号：120493-1）
黄嘌呤胺同类物（Sigma-Aldrich，目录号：X103）
Affi-Gel TM 10（Bio- R广告，目录号：1536099）
异丙醇（费希尔小号系统求解，目录号：A426P-4）
消泡剂A浓缩液（Sigma-Aldrich，货号： A5633）
Thermo Scientific TM酵母DNA提取试剂盒（Fisher Scientific，目录号：PI78870）
Thermo Scientific TM Y-PER TM酵母蛋白质提取试剂（Fisher Scientific，目录号：PI78991）
Universal-ES液体闪烁鸡尾酒（MP Biomedicals TM ，目录号：88248001）
3,3'，5,5'-四甲基联苯胺溶液（Alfa Aesar ，目录号：J61325）
PageRuler加上预染的蛋白梯（费舍尔小号系统求解，目录号：26619）
BioAcryl -P（30％，29：1）液体（Alfa Aesar ，目录号：J63279）
QIAquick凝胶提取试剂盒（Qiagen，目录号：28704）
10 ×磷酸盐缓冲液（请参见配方）
免疫印迹阻断缓冲液（请参见配方）
免疫印迹孵育缓冲液（请参阅食谱）
免疫印迹洗涤缓冲液（请参见配方）
LB板（请参阅食谱）
YNBD板（请参阅食谱）
YPD介质（请参阅食谱）
YPD琼脂平板（请参阅食谱）
BMGY培养基（请参见食谱）
BMMY培养基（请参阅食谱）
通用洗涤缓冲液P1（请参阅配方）
受体裂解缓冲液P2（请参阅食谱）
受体制备缓冲液P3（请参阅食谱）
受体制备柱洗涤缓冲液P4（请参阅食谱）
色谱柱洗脱缓冲液P5（请参阅配方）
XAC柱洗脱缓冲液P6（请参阅配方）
G蛋白洗涤缓冲液P1（请参阅食谱）
G蛋白裂解缓冲液P2（请参阅食谱）
G蛋白洗脱缓冲液P3（请参阅食谱）
Q缓冲液A-Gα（请参阅配方）
Q缓冲液B-Gα（请参阅食谱）
Q缓冲液AGβγ （请参阅食谱）
Q缓冲液BGβγ （请参阅食谱）
免疫印迹封闭缓冲液（请参见配方）
免疫印迹洗涤缓冲液（请参见食谱）
放射性配体结合/洗涤缓冲液（请参见食谱）

设备

（可选）-80°C冰箱
热科学TM SORVALL TM离心机（Thermo Scientific的，米Odel等：ST 40R）
Eppendorf TM微量离心机（Eppendorf，型号：Legend Micro 21R）
Applied Biosystems TM SimpliAmp TM热循环仪（Applied Biosystems，型号：A24812）
Genesys TM紫外可见光谱仪（Genesys ，模式：10S）
热科学TM Heratherm微生物培育器117L（Thermo Scientific的，米Odel等：IGS100）
NanoDrop TM分光光度计（NanoDrop ，型号：Lite）
贝克曼L8-70M超速离心机（贝克曼，型号：L8-70M）
ÄKTApurifierFPLC （GE，型号：Purifier 100）
细胞电穿孔系统电穿孔仪（Bio-Rad，型号：Gene Pulser X）
FISHERBRAND TM重型Vortex混合器（FISHERBRAND ，米Odel等：STD）
5 L NEW不伦瑞克生物反应器（新不伦瑞克，米Odel等：BIOFLO III）
微流化TM处理器（IDEX材料加工，米Odel等：LM20）

程序

该协议已根据我们之前的工作（Ye等人，2016和2018b ）以及当前工作进行了修改和最终确定。与我们以前的工作不同，使用来自IDT网站的在线密码子优化软件对该协议中提出的所有靶基因进行了密码子优化，并分别合成了各个基因，然后通过Bam HI和Not HI限制酶整合到巴斯德毕赤酵母的基因组中。特别是，人源腺苷A 2A R（35.1KDa）和A 1受体（36.5KDa）基因在N和C末端分别具有FLAG和His 10标签。此外，在FLAG标签之后，将TEV蛋白酶切割位点以及α-因子肽添加到基因的前面（图1）。在此相反，没有FLAG标签和α -因子序列G中α （45.7KDa），以及为G β （38.7KDa）和G ^ γ （7.6KDa）构建体; 特别是，没有他的标签序列摹γ考虑摹β和g ^ γ共表达在一起。

图1.本方案中描述的GPCR和G蛋白的构建体。该质粒pPIC9K-A 1个R / pPIC9K中-A 2A - [R具有α -因子肽，FLAG标签，TEV蛋白酶切割。相反，在G蛋白构建体中没有FLAG标签和α-因子序列。特别是，没有他的标签在主题摹γ考虑摹β和g ^ γ共表达在一起。

GPCR和G蛋白的质粒制备
1个 μ升的construc的吨的pP我Ç 9K_ADORA2A这是pPIC9K中的重组载体含有ADORA2A受体序列，在〜100的浓度纳克/微升，由T.小林（日本）慷慨提供（安德烈等人。，2006 ）用化学方法转化成2微升通过热激45秒，在42 XL-10金感受态细胞℃。

200 μ升LB培养基立即加入到混合物中，并转化细胞都在含有5025毫升LB平板扩散 μ克/米升氨苄青霉素。在37 °C下孵育过夜。
ø NE菌落被挑选从板和接种d成一个含有4毫升LB培养基50  μ克/米升氨苄青霉素和培养d在37过夜℃下。
按照说明使用GenElute TM质粒微型制备试剂盒提取质粒。
所提取的质粒用1消化μ升的Bam HI -HF AND1 μ升无tI -HF用1 × NEB CutSmart ®缓冲˚F或在1.5ml Eppendorf管中1.5小时。1 μ升快速CIP是为30分钟的消化和磷酸加入到创建pPIC9K中骨干轴承的Bam HI和无TI在每一侧上的限制性位点。总体积随所用质粒的量而变化。一般，1微升的每个限制性酶是用于20的消化μ克质粒。
所有的靶基因片段，包括甲2A R，A 1 R，G α小号，G β ，和G ^ γ （〜200毫微克/ μ升）按照合成巴斯德毕赤酵母密码子优化的序列。值得注意的是，所有基因片段在N和C末端都带有Bam HI和No tI限制酶位点。
的基因片段，也消化1 μ升每个的Bam HI -HF和无TI -HF限制性内切酶用1 × NEB CutSmart ®缓冲器，用于无急CIP处理2小时。
消化的pPIC9K质粒和基因片段均经过DNA电泳（Krettler等，2013 ），并使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化，并使用NanoDrop TM Lite分光光度计测量浓度。
将连接处理用骨架质粒和基因片段之间各种比例使用1处理微升T4 DNA连接酶与1 ×在0.2毫升PCR管NEB T4 DNA连接酶缓冲液。Ť他摩尔比基因之间fragements和空质粒分别设定为1：3,1：1和3：1的10-100纳克/浓度μ升。
含有不同基因片段连接后的质粒转化到XL-10金的感受态细胞（Smbrook等，1989; Dubnau ，1999 ）和涂布在含有50所述LB平板 μ克/米升氨苄青霉素。在37 °C下孵育过夜。
使用GenElute TM Plasmid Miniprep Kit提取每种构建体的质粒。20 μ克质粒在100每个构建体的μl用1线性化微升经Pme我限制用1酶× NEB CutSmart ®缓冲器，用于在一个0.2毫升PCR管2小时。
200 μ升100％乙醇加入到100 μ升的线性化质粒和在冰上温育5分钟。
然后将线性化的质粒在4°C下以16,200 × g的速度离心5分钟。
弃去上清液，并将线性化的DNA沉淀干燥UND ER一个烟气罩20分钟前重新悬浮在20 μ升的蒸馏水与DNA浓度约为1 μ克/ μ升。
10 μ升的线性化质粒的用80轻轻混合μ升巴斯德毕赤酵母感受态细胞在1.5ml Eppendorf管中并在冰上保持至前5分钟转移到一个2mm电比色皿。
的转化，使用基因脉冲II电穿孔用的1的条件下进行，500伏电压充电，25 μF的电容，并且400Ω的电阻。
立即将1 ml冰冷的1 M山梨糖醇加入电穿孔比色杯中，并转移到14 ml圆底试管中。
然后将样品在30 °C下温育3小时，不摇动，然后将其铺展到YNBD板上。
值得注意的是，线性化的G ^ β和g ^ γ质粒（10 μ升每个），我们重新转化到巴斯德毕赤酵母一起，而所有其他的线性化的质粒分别转化。

GPCR和G蛋白高产构建体的制备
如图2A所示，在YNBD平板上生长菌落后3-5天的潜伏期被转移到含有YPD平板1mg / ml的G418和我ncubate d 3-5天，在30 ℃下。制备了梯度G418浓度的YPD平板，并保存在4 °C进行后续筛选。

图2.电穿孔和高产率构建体筛选腺苷A 2A R和A 1 R受体的示意图（A）以及使用SDS-PAGE和Western印迹法进行鉴定（B）

将在含有1 mg / ml G418的YPD平板上生长的菌落进一步转移到含有2 mg / ml G418的第二个YPD平板上。在30 °C下孵育3-5天。
连续地，最终将在含有2mg / ml G418的YPD平板上生长的菌落转移到含有4mg / ml G418的YPD平板上。孵育ð额外3-5天，在30 ℃下。
5-10菌落在含有YPD平板4毫克/毫升G418分别使用针对免疫印迹测定法采摘表达水平评估他10个FLAG标签。pPIC9K中的多拷贝整合可以增加遗传霉素® 0.5阻力一级毫克/毫升（12份）到4毫克/毫升（7 - 12个拷贝）。
将单一菌落在摇动（275 rpm）下于30 °C的14 ml F alcon管中的4 ml BMGY培养基中接种至少24 h，直到OD 595 = 2.0-6.0。
然后将培养基转移入200ml BMMY培养基在500ml摇所涵盖瓶中一个棉塞。
将细胞继续在22 ℃下以275rpm摇动培养60小时。
将0.5％甲醇/ 12 h加入培养基中，以诱导和维持受体或G蛋白的表达。
在诱导结束时，将细胞沉淀物离心分离后收集在3 ，800 ×克10分钟在4 ℃下在250ml离心瓶中。
细胞沉淀用普通洗涤缓冲液P1以1：2的比例洗涤一次。
然后以等于1：4的细胞沉淀与缓冲液之比将细胞沉淀重悬浮于受体裂解缓冲液P2中。
然后将细胞沉淀悬浮液在5 mm玻璃珠浆液的存在下于2,000 rpm在4 °C涡旋2 h 。
将破碎的细胞沉淀物在4°C下以9,720 × g离心30分钟，并丢弃未破碎的细胞和细胞碎片。
收集含有细胞膜的上清液并进行免疫印迹分析（Gallagher和Chakavarti ，2008 ）。
为了准确起见，分别针对FLAG标签和His标签对抗His和抗FLAG进行了免疫印迹。
将1μl上清液印迹在硝酸纤维素膜上并使其干燥。
将第二个1μl的上清液加到先前的位置，使其干燥。
将膜在室温下置于20 ml免疫印迹封闭缓冲液中1小时。
然后将膜转移至20ml我mmunoblotting孵育缓冲液含有任一His标签抗体（1：2 ，000）或FLAG -tag抗体（1：2 ，000）2小时。
然后将膜用免疫印迹洗涤缓冲液洗涤3次，然后用蒸馏水洗涤。
膜最终通过BM Blue POD底物（3,3'，5,5'-四甲基联苯胺溶液）可视化。
选择强度最强的菌落用于进一步表达。如果表达水平少于0.5毫克/大号细胞培养物，第二循环的质粒转化中的指令之后进行在Pro描述cedure甲和B.菌落直接筛选含6毫克/毫升G418的YPD平板上（图URE 2A）。
用20％高压灭菌的甘油制备经筛选的高产率表达构建体的储备液，并在-80°C的冰箱或液氮中冷冻。

GPCR和G蛋白的表达
GPCR和G蛋白的表达使用以下步骤中类似的方法，但有细微的差异。

将转化子的甘油储备液接种到含有0.1 mg / ml G418的YPD琼脂平板上。
3-5天后，将单个菌落接种到14 ml圆底管中，在30°C下于4 ml高压灭菌的YPD中，以275 rpm振摇24 h。
随后将4 ml培养基转移到200 ml高压灭菌器中 BMGY培养基，在500 ml摇瓶中于30°C培养覆盖由铝箔275的转速，直到OD的振荡速度595达到2-6，这将需要约24小时。
为了诱导表达，将200ml细胞沉淀物离心分离并转移至2.8L烧瓶中的1升高压灭菌的BMMY培养基中，并在20℃以275rpm的振荡速度培养。过滤甲醇溶液每12小时（5毫升/添加有0.5％大号配有鎓）如果折流使用烧瓶。如果发酵罐是所使用的，甲醇的加入速率以最大为1ml / h的控制每个升，这是依赖的培养物体积上
发酵80小时后收集受体表达细胞，而60小时后收集G蛋白表达细胞。

GPCR和G蛋白的纯化
的GPCR，G的纯化α ，和G βγ蛋白质是在这个协议不同。因此，我们在以下各节中分别描述它们。

GPCR的纯化

表达80小时后，将细胞沉淀物于3800 × g于4 °C在250 ml离心瓶中收集10分钟。
细胞沉淀物用普通洗涤缓冲液P1以1 g细胞沉淀物与2 ml P1的比率洗涤一次，并在3800 × g下于4 °C在250 ml离心瓶中离心10分钟。
将洗涤过的细胞沉淀以4：1的比例重悬于受体裂解缓冲液P2中，以确保在250 ml离心瓶中充分悬浮。
然后使用微流化器在15,000 psi的工作压力下在冰上将细胞破坏四个周期。裂解前，将微流化剂与缓冲液P2平衡。
我ntact细胞和细胞碎片从膜悬浮液在9720分离×克在4℃下30分钟，250 ml的离心瓶中。
然后收集上清液，并使用带有相应试管的Beckman Ultracentrifuge的T ype 45 Ti转子以100,000 × g离心75分钟。
弃去超速离心的上清液，并收集不同运行的膜，并将其悬浮在通用洗涤缓冲液P1中以除去EDTA。
弃去超速离心的上清液，将膜沉淀溶解在装有受体制备缓冲液P3的50 ml锥形离心管中，并在4°C摇动直至所有膜充分溶解。
将该溶液在4°C下以1,980 × g离心5分钟以除去未溶解的膜。
使用受体制备柱洗涤缓冲液P4将溶解的膜与预平衡的Talon树脂混合。通常，将2 ml Talon树脂用于6 g膜。在4°C下孵育2小时。在孵育过程中，添加咪唑至终浓度为100μM 。
2小时后，将Talon树脂填充到处理柱上，并用5倍柱体积的受体制备柱洗涤缓冲液P4洗涤。
随后，使用柱洗脱缓冲液P5以重力从柱上洗脱受体。
洗脱的受体浓缩至1 ml 通过Ultra-15离心过滤器3K和10 ml受体制备柱洗涤缓冲液P4进行一次更换，在4 °C下以10的稀释倍数以10 3846 ×克。
然后，受体通过XAC配体柱，该XAC配体柱使用Receptor Preparation Column Washing Buffer P4进行了预平衡。重复三遍。
使用受体制备柱洗涤缓冲液P4洗涤结合了XAC受体的XAC色谱柱，体积为2倍，以去除非功能性受体。
然后使用XAC柱洗脱缓冲液P6洗脱受体，该缓冲液P6由具有25 mM茶碱的受体制备柱洗涤缓冲液P4组成。
洗脱的受体通过3K Ultra-15离心过滤器浓缩至1 ml，并用SlideK -A- Lyzer TM MINI透析设备3.5K对受体制备柱洗涤缓冲液P4透析，稀释因子为10 6，以除去所有配体，从而使受体进入载脂蛋白状态。
将纯化的受体通常与0.5-2毫克/大号生产率通过SDS-PAGE验证（的Laemmli ，1970 ）作为WEL升免疫印迹，如图2B所示。

的G纯化α

细胞小球中收获由离心在3 ，800 ×克为10分钟使用的在4离心机在250ml离心瓶中℃下。
细胞沉淀物用一次洗涤共洗涤缓冲液P1中的比例为1克细胞沉淀至2ml P1和具有3800的速度离心×克为10分钟，在4在250ml离心瓶中℃下。
将细胞沉淀以1：4的比例重悬于G蛋白裂解缓冲液P2中。
通过Microfluidizer在15,000 psi下使用4个循环破碎细胞，以完全破坏酵母细胞壁。裂解前，将微流化剂与缓冲液P2平衡。
将裂解液在250毫升离心瓶中于4°C离心30分钟，离心9,720 ×g 。
将上清液施加到达隆树脂2小时，在将其用100的终浓度加入咪唑μ中号，以便降低非特异性结合。
将结合了G蛋白的Talon树脂应用于处理柱。
然后用5倍柱体积的G蛋白洗涤缓冲液P1洗涤填充柱。
用10 ml G蛋白洗脱缓冲液P3以重力洗脱目标Gα。从战略RECYCL荷兰国际集团洗脱缓冲液，以减少洗脱体积是可选的。
毫克氯2加入至1mM的最终浓度以及在50 GDP μ中号。
的Gα通过超15离心过滤器浓缩至2ml，3K在4 ℃下以3的速度，846 ×克。在将洗脱的Gα蛋白应用到系统之前，将FPLC系统用Q Sepharose色谱柱的缓冲液A-Gα平衡。
Q缓冲器A-Gα：50mM的HEPES，pH值8.0，50 μ中号GDP，1毫摩尔MgCl 2 。
Q缓冲器B-Gα：50mM的HEPES，pH值8.0，50 μ中号GDP，1毫摩尔MgCl 2 ，1000毫米的NaCl 。
应使用20％的Q缓冲液B洗脱Gα蛋白。

为目标Gα洗脱FPLC程序示于图3和Gα被洗脱出来如该曲线图所示，在该流率，最大列压力，和级分设定为1.0毫升/分钟，0.5兆帕，和2.0ml的，分别。

图3.酵母来源的Gα蛋白的纯化。一。His-tag纯化后的馏分的SDS-PAGE。乙。洗脱程序和用于所得洗脱曲线G ^ α 。Ç 。SDS-PAGE用于（B）中标记的来自FPLC的浓缩级分。

对应的级分收集，浓缩至1使用超15离心过滤器3K以4ml ℃下与3的速度，846 ×克。
使用BCA试剂盒测量Gα的浓度，生产率为2-5 mg / L细胞培养。

Gβγ的纯化

细胞小球中收获由离心在3800 ×克为10分钟使用的离心机在4在250ml离心瓶中℃下。弃去上清液。
将细胞沉淀物以1 g细胞沉淀物与2 ml P1的比率用Common Washing Buffer P1洗涤一次，并在3800 x g的条件下于4°C在250 ml离心瓶中离心10分钟。
Ç ELL佩尔Ë TS瓦特ERE洗涤一次以1：2的比例共洗涤缓冲液P1，并在4离心℃下的速度3800 ×克为10分钟。
将细胞沉淀物悬浮在冰冷的G蛋白裂解缓冲液P2中。
将细胞球粒进行溶解通过微射流均质机为4个周期在一个压力的为15,000psi。裂解前，将微流化剂与缓冲液P2平衡。
Ť ħ Ë升ý SED Ç ELL佩尔Ë TS分别为Ç Ë Ñ三˚F uged一吨9720 ×克为30分钟吨ö ř EM ö已经所有德b RIS一个Ñ d我Ñ圆通Ç厄尔在250ml离心瓶中。
将上清液施加到Talon树脂上2小时。
注意：添加咪唑至终浓度为100μM ，以减少非特异性结合蛋白。

将结合G蛋白的树脂施加到处理柱上。
用5倍柱体积的通用洗涤缓冲液P1洗涤该柱。
对于g βγ在重力速率用10毫升聚体G蛋白的洗脱缓冲液洗脱。从战略RECYCL荷兰国际集团洗脱缓冲液，以减少洗脱体积是可选的。
对于g βγ物通过超离心15浓缩至2ml过滤3K在4 ℃下与3846的速度×克。并将缓冲液改为Q Sepharose高性能缓冲液AGβγ 。
将样品上样到FPLC上，并用Q Sepharose高性能缓冲液BGβγ梯度洗脱（图4A）。
级分用用于G的相同参数收集α ; 典型的洗脱曲线如下（图4）：

图4.酵母来源的Gβγ蛋白的纯化。一。洗脱程序和用于所得洗脱曲线ģ βγ 。乙。SDS-PAGE用于（A）中标记的浓缩级分。

洗脱的级分收集，浓缩，之后用2-5毫克/的生产率大号类似于G细胞培养α 。使用SDS-PAGE验证蛋白质的纯度和分子量，如图4B所示。

菜谱

10 ×磷酸盐缓冲液
49.7克Na 2 HPO 4

98.0克的NaH 2 PO 4在1 ，000毫升卫生署2 O，pH 6.5的

免疫印迹阻断缓冲液
125毫米氯化钠

25 mM Tris碱，pH 7.5，0.3％Tween-20和3％脱脂牛奶

免疫印迹孵育缓冲液
抗-His /抗-Flag 2：稀释至1抗体，000用封闭缓冲液

免疫印迹洗涤缓冲液
125毫米氯化钠

25 mM Tris碱，pH 7.5

0.3％吐温20

LB板
2.5％LB肉汤

1.5％琼脂

YNBD板
1.34％不含氮的酵母氮

0.0004％D-生物素

1％葡萄糖

1.5％琼脂

YPD培养基
1％酵母提取物

2％蛋白ept

2％葡萄糖

YPD琼脂板
1％酵母提取物

2％蛋白ept

2％葡萄糖

2％琼脂

BMGY培养基
1％（w / v）酵母提取物

2％（w / v）蛋白ept

1.34％（w / v）YNB，不含氨基酸

0.00004％（w / v）生物素

1％（w / v）甘油

pH 6.5的0.1 M磷酸盐缓冲液

BMMY培养基
1％（w / v）酵母提取物

2％（w / v）蛋白ept

1.34％（w / v）不含氨基酸的酵母氮碱

0.00004％（w / v）生物素

0.5％（w / v）甲醇

pH 6.5的0.1 M磷酸盐缓冲液

0.04％（w / v）组氨酸和3％（v / v）DMSO

10 μM茶碱

通用洗涤缓冲液P1
20 mM Bis- T ris，pH 6.5（50 mM HEPES，pH 7.4）

受体裂解缓冲液P2
20 mM Bis- T ris，pH 6.5（50 mM HEPES，pH 7.4）

2.5毫米EDTA

10％甘油

受体制备缓冲液P3
20 mM Bis- T ris，pH 6.5（50 mM HEPES，pH 7.4）

100毫米氯化钠

1％MNG-3和0.02％CHS

受体制备柱洗涤缓冲液P4
20 mM Bis- T ris，pH 6.5（50 mM HEPES，pH 7.4）

100毫米氯化钠

0.1％MNG-3和0.002％CHS

柱洗脱缓冲液P5
20 mM Bis-tris，pH 6.5（50 mM HEPES，pH 7.4）

100毫米氯化钠

0.1％MNG-3

0.002％CHS

300 mM咪唑

XAC柱洗脱缓冲液P6
受体制备柱洗涤缓冲液P4中20 mM茶碱

G蛋白洗涤缓冲液P1
50 mM HEPES，pH 8.0

G蛋白裂解缓冲液P2
50 mM HEPES，pH 8.0

10％甘油

100毫米氯化钠

G蛋白洗脱缓冲液P3
50 mM HEPES，pH 8.0，300 mM咪唑

Q缓冲液A-Gα
50 mM HEPES，pH 8.0

50 μ中号GDP

1毫米氯化镁2

Q缓冲液B-Gα
50 mM HEPES，pH 8.0

50 μ中号GDP

1毫米氯化镁2

1 ，000毫氯化钠

Q缓冲A-摹βγ
20 mM Bis- T ris，pH 6.5（50 mM HEPES，pH 8.0 ）

Q缓冲B-摹βγ
20 mM Bis- T ris，pH 6.5（50 mM HEPES，pH 8.0 ）

1 ，000毫氯化钠

免疫印迹封闭缓冲液
125毫米氯化钠

25 mM Tris碱，pH 7.5

0.3％吐温20

3％脱脂牛奶

免疫印迹洗涤缓冲液
125毫米氯化钠

25 mM Tris碱，pH 7.5

0.3％吐温20

放射性配体结合/洗涤缓冲液
25 mM HEPES，pH 7.4

100毫米氯化钠

致谢

该文章得到了南佛罗里达大学（USF）的Nexus Initiative（LY）以及USF细胞生物学，微生物学和分子生物学系的启动资金（LY）的支持。

利益争夺

没有利益冲突或利益冲突。

参考

北卡罗来纳州安德烈（Andre），北卡罗来纳州彻鲁亚提（Cherouati ），德克萨斯州斯特凡（Steffan ），佐治亚州-卢茨（Geder- Lutz），马格宁（Magnin ），帕特斯（Fattus ），米歇尔（H.），瓦格纳（Wagner）和赖因哈特（Reinhart）（2006）。通过单个表达筛选将巴斯德毕赤酵母中G蛋白偶联受体的功能产生提高到结构研究所需的水平。蛋白质科学15（5）：1115-1126。
Congreve，M.，de Graaf，C.，Swain，NA和Tate，CG（2020）。GPCR结构对药物发现的影响。单元格181（1）：81-91。
Dubnau ，D。（1999）。细菌中的DNA吸收。Annu启微生物学53：217-244。
Gallagher，S.和Chakavarti ，D.（2008）。免疫印迹分析。视力扩展（16）。doi：10.3791 / 759。
Krettler ，C.，Reinhart，C.和Bevans，CG（2013）。GPCRs在毕赤酵母中的表达，用于结构研究。方法酶520：1-29。
英国Laemmli （1970）。T4噬菌头组装过程中结构蛋白的切割。自然227（5259）：680-685。
Overington ，JP，Al- Lazikani ，B。和Hopkins，AL（2006）。有多少种药物靶标？Nat Rev Drug Discov 5（12）：993-996。
Smbrook ，J.，Fritsch，EF和Maniatis ，T。（1989）。分子克隆：实验室手册。冷泉港实验室。
叶，L.，尼尔，C.，Sljoka ，A.，LYDA ，B.，皮丘金，D.，Tsuchimura ，N.，Larda ，ST，梨果，R.，加西亚，AE，恩斯特，OP，砂原，RK和Prosser，RS（2018 a ）。机械洞察力通过生理阳离子对A2A腺苷G蛋白偶联受体的变构调节。Nat Commun 9（1）：1372。
Ye，L.，Orazietti，AP，Pandey，A.和Prosser，RS（2018 b ）。酵母衍生的G蛋白偶联受体的高效表达和19 F标记用于动力学研究。方法分子生物学1688：407-421。
Ye，L.，Van Eps，N.，Zimmer，M.，Ernst，OP和Prosser，RS（2016）。通过构象选择激活A2A腺苷G蛋白偶联受体。自然533（7602）：265-268。