材料和试剂
1. 2毫升微管
2. 1.5毫升管
3.注射器用仪26针（BD，CA talog号：9304308）
4.注射器为0.2μ米注射器过滤器（BD，CA talog号：7212651）
5.用于GC进样的ALS注射器（Agilent Technologies，目录号：5181-3354）
6.微型管（Axygen Scientific，目录号：02820037，1.5 ml，目录号：12018028，2 ml）
7. 0.2μ米注射器过滤器（Thermo Scientific的，目录号：00293112）
8. GC MS样品瓶盖（安捷伦科技公司，目录号：5182-0717）
9.玻璃插件（Agilent Technologies，目录号：5181-2085，规格：250μl）
10.一次性杵（Argos Technologies，目录号：7339-901 ）
11. C57 B6 / J鼠标（杰克逊实验室，目录号：664）
12.乙醇（Fisher Chemical，目录号：172382，LOT特定浓度：96％）
13.液氮
14.甲醇（Fisher Chemical，Optima TM LC / MS等级，目录号：164905）
15. HPLC水（Fisher Chemical，Optima TM LC / MS级，目录号：7732-18-5）
16.己烷（Sigma-Aldrich，HPLC级，目录号：MKCF5755）
17.二氯甲烷（Fisher Chemical，目录号：163938）
18.氦气（MATHESON，目录号：HE UHP1A）
19.吡啶（Sigma-Aldrich，目录号：SHBK1583）
20. N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺（TBDMS）（Sigma-Aldrich，目录号：394882）
21.铵-15 N氯化物（15 NH 4 Cl）（Sigma-Aldrich，目录号：229251）
22.氨基酸标准混合物（Sigma-Aldrich，目录号：AAS18-5 ml）
23. 10 ×磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Fisher Chemical，目录号：10010049）
24.汉克平衡盐溶液（HBSS）（Fisher Chemical，目录号：14170112）
25. EDTA（Fisher Chemical，目录号：6N011324）
26. 15 NH 4 Cl溶液（参见配方）
27.提取缓冲区（请参阅食谱）
28.内部标准（请参见食谱）
29.甲氧胺混合物（请参阅食谱）

设备

Dumont Tweezer，样式5（电子显微镜科学，目录号：0108-5-PO）
-20°C冰箱
解剖显微镜（Zeiss，型号：Stemi 2000-C）
用于小鼠和大鼠的FirstHand外科手术器械套件（肯特科学公司，型号：INSSMOUSEKIT）
电池供电的杵式电动搅拌机（Argos Technologies，目录号：EW-44468-25 ）
Omni组织匀浆器（115V 125W）（OMNI International the Homogenizer Company，THB-01）
气相色谱质谱仪（Agilent Technologies，型号：7890B / 5977B GC-MS）
DB-5ms GC色谱柱（长度30 m，内径0.25 mm，膜厚0.25μm）（Agilent Technologies，目录号：122-5532）
凝胶泵（Savant仪器（GP110）
Speed vac Plus（Savant Instruments，SC110A）
离心机（Eppendorf，货号：5424）
Thermomixer（Eppendorf ThermoMixer C，5382000015）

软件

MassHunter工作站软件（安捷伦B.07.01版）
MS定量软件（安捷伦版本B.07.01 /构建7.1.524。0 ）
Python 2.6以上版本（http://www.pythonxy.com）
IsoCor软件（http://metasys.insa-toulouse.fr/software/isocor）

程序

图1是此协议中过程的概述。

图1 。该协议的流程图。向动物注射15 N示踪剂，并提取其代谢物，以使用GC MS分析15 N标记的代谢物。

示踪剂注入
新鲜编写，J重新15 NH 4氯在PBS（小号EE ř ecipe 1）。
称重小鼠并计算注射量。
腹腔注射（IP）15 NH 4 Cl，剂量为1 67 mg / kg或相同体积的PBS。

组织收集
在注射后的不同时间点，使小鼠迅速处死并使其脱臼。例如，0分钟，5分钟，15分钟，30分钟和60分钟。
注意：根据组织的不同，不同的代谢物可以在不同的时间点达到其峰富集。

在解剖型HBSS中，在解剖显微镜下去核小鼠眼睛并分离神经视网膜和眼杯。将神经视网膜存储在预先称重的1.5 ml微管中，将眼杯存储在预先称重的2 ml微管中。称量组织并在液氮中速冻。
使用带有26G针头的注射器进行心脏穿刺以抽取100-300μl血液。轻轻将血液分配到含EDTA的试管中。将血液样本放在冰上。离心血液在1 ，008 ×克在4 10分钟℃，将上清转移到新的1.5ml管中，并存储在上清液-20℃的冰箱中。
快速去除脑和肝组织，将它们存储在预先称重的2 ml微管中，并在液氮中速冻。
注意：请抽出整个大脑以避免不同区域的异质性。用剪刀从同一瓣切下一块肝组织（约40 mg）。

代谢物提取
组织代谢物提取（图2）

图2 。代谢物提取和衍生化的示意图。一。用Omni THb均质器将脑，肝和眼杯均质化，而将视网膜用研棒电动搅拌器均质化。将匀浆在干冰上放置30分钟，然后在25 °C ，200 × g下于4 °C离心15分钟。将上清液转移至含有5 µl内标物的玻璃插入物中，并用高速真空干燥。B.甲DD 10微升的F reshly p repared甲氧胺（20毫克/毫升）插入在插入并孵育90分钟的干燥的样品在37℃下在70在恒温，随后孵育30分钟℃，之后将加入30 µl TBDMS。将每个插入物转移到样品瓶中，以进行GC MS分析。

在干冰上将提取缓冲液（配方2）预冷10分钟。
将预冷的提取缓冲液转移到装有组织的试管中。在140 µl提取缓冲液中，使用手持式研杵电动搅拌器将神经视网膜匀浆15-20 s；用Omni THb均质器在200 µl提取缓冲液中均质化眼罩15-20 s；使用Omni THb均质器在提取缓冲液中均质化大脑或肝脏组织20-30 s （每5 mg组织添加200 µl提取缓冲液）。
注意：为每个样品更换一次性杵。用清水将Omni Thb均质机的探针至少清洗两次，并在样品之间擦拭以避免交叉污染。将样品放在干冰上30分钟。

离心机将样品在25 ，200 ×克于4 ℃下15分钟。
用0.2 µm注射器过滤器过滤上清液。
在1.5 ml试管中的每个玻璃插件中加入5 µl内标物（配方3）。
将上清液转移到每个玻璃插入物上，打开管盖，在冷藏室中的Speed vac中干燥。
不是：为确保高灵敏度而又不超载，请将视网膜或眼罩样品中的所有上清液转移至干燥处，并将50 µl脑或肝组织转移至干燥处。确保样品完全干燥。水分会影响衍生化和电离的效率。
血浆代谢物提取
将10 µl血浆样品与40 µl预冷的提取缓冲液混合。
将混合物在冰上放置15分钟。
离心样品，并按照组织代谢物提取中的说明，将10 µl转移至具有内标的插入物中。

样品制备（图2）
新鲜制备甲氧基胺混合物（配方4），向每个插入物中添加10 µl ，将干燥的样品放入1.5 ml微管中。混合并盖上盖子，然后在热混合器中将试管在37°C和300 RPM下孵育90分钟。
注意：轻轻敲打带有插入物的试管至内部3-5次以进行混合，向下旋转样品并盖紧盖子。

孵育后，快速旋转试管，并向每个样品中添加30 µl TBDMS。在70 °C下孵育30分钟。
旋转试管，并将每个插入物转移到GC MS玻璃小瓶中。

GC-MS分析
运行前准备
我nstall GC MS用DB-5 MS柱和注射器针头。
将氦气的流速设置为1 ml / min。
分别用己烷和二氯甲烷填充针洗溶剂瓶A和B。
按照表1设置GC柱箱温度梯度。每个样品的总运行时间为31.5分钟。

表1. GC柱箱温度参数

设置GC MS扫描范围，速度，频率，循环时间和步长的参数，如表2所示。选择5.4分钟的溶剂延迟。

表2. GC-MS上GC MS扫描范围的参数和加速器参数

如表3所示，为要监测的每种代谢物的离子设置用于选择监测（SIM）模式的参数。

表3.在SIM模式下监控的代谢物离子列表

注意：同位素共聚体分别命名为M0，M1，M2。M0是未标记的质量，并且1到2表示从同位素标记开始的质量偏移。

在不分流模式下将进样量设置为样品的1 µl。
将这些参数保存为“ GC MS氮气法”。
使用自动调谐功能对GC MS进行调谐，以检查质量准确性并确保系统中没有泄漏。
注意：系统中的漏气和脏污源会大大降低灵敏度。每周定期更换气阱并进行气源维护非常重要。

运行样本
将样品放在自动进样器中。
在序列表中填写样品名称和样品瓶名称。选择GC MS氮气法。
使用GC MS运行样品。
注意：检查仪器是否正常运行，尤其是长期运行。典型的仪器运行故障包括序列表填充不正确，注射器针头有缺陷以及灯丝故障。

GC MS数据处理
使用基于表3的安捷伦MS定量软件设置定量方法。
在软件中单击“文件”以设置新批次。
选择定量方法并提取每个选定离子的峰面积。
将峰面积导出到excel文件中。

自然丰度校正
自然丰度校正
安装IsoCor进行自然丰度校正软件
在http://metasys.insa-toulouse.fr/software/isocor下载IsoCor软件；下载Python 2.6+（http://www.pythonxy.com）并安装模块：wxPython（v 2.8.11.0），NumPy（v1.6.0.2），SciPy（v0.9.0.1）。

设置IsoCor软件的参数
E dit“代谢产物。dat”文件。使用记事本打开IsoCor文件夹下的“ Metabolites.dat”文件，并在表4中输入代谢物及其元素公式。将文件保存在同一文件夹中。

表4.用于自然丰度校正的代谢物列表及其元素公式

编辑“衍生工具。dat”文件。使用记事本编辑此文件并输入化学衍生物及其元素公式，如表5所示。将输入数据文件设置为表6，然后将GC MS峰面积（离子强度）复制到该表中。将文件保存在同一文件夹中。

表5.化学衍生物及其元素式列表

TBDMS1、2或3表示衍生物代谢物中的TBDMS数。

数据校正
将Excel Input数据文件（表6 ）另存为“ xxx”。文本。”
打开IsoCor软件，然后将同位素示踪剂选择为“ N”。
选择示踪剂的纯度为（0.02; 0.98）。
注意：纯度取决于您使用的示踪剂。例如，15 NH 4 Cl的纯度为98％。它表示为（0.02; 0.98）。

使用“加载多种方式”按钮加载输入数据文件。
点击“处理”按钮。
打开一个新的Excel文件并加载输入数据file_res.txt。
注意：计算结果将自动保存为.txt文件，分别为（Input File_res.txt）和（Input File_log.txt）。将它们保存在同一文件夹中。表7是代表了看跌自然丰度修正后的文件。

表6 。IsoCor的输入数据文件模板

强度是从提取的峰面积中得到的代表数据，用于特定监控的离子。

数据分析

代表数据

图3 。标准品和小鼠组织样品的GC MS色谱图。A.氨基酸标准混合物中谷氨酸M0的GC MS色谱图（m / z 432.3）。使用标准混合物计算谷氨酸M0的校准曲线。B.接受PBS注射的小鼠视网膜样品中TIC的谷氨酸M0（m / z 432.3）色谱图。

请在文本中引用图3 （引用）。

图3是标准品和小鼠组织样品的代表性GC MS色谱图。表7是代表性的GC MS数据，该数据是在注射15 NH 4 Cl后从肝脏组织中自然富集校正后得出的。同位素同位素分布是示踪剂中15 N的富集。除包括亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸的支链氨基酸外，所有其他代谢物在一次示踪剂注射后5分钟达到其峰富集。由于代谢降解，富集在15分钟时下降。

表7.自然丰度校正后5分钟和15分钟时肝组织的同位素同位素分布的代表性GC MS数据

配方小号

15 NH 4氯离子搜索解决方案Ñ
称重15 N氯化铵，并以33 mg / ml的浓度溶于已过滤的1 × PBS中

提取缓冲液
以80:20（Vol：Vol）混合甲醇和HPLC水

内部标准
称取肉豆蔻酸-D27粉末并以2：5：2的比例（Vol：Vol：Vol）溶于异丙醇：甲醇：HPLC水混合物

甲氧胺混合物
迪斯olve methox yamine盐酸盐在吡啶中于20毫克/毫升溶液

注意：用注射器针头将吡啶溶液穿过密封的橡胶盖，以防潮湿。

致谢

健康格兰特EY026030全国学院和EY031324 （公司JD），Brigh TF OCUS基金会（公司JD）和视网膜研究基金会（公司JD）支持这项工作。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

根据美国国立卫生研究院的指导方针进行了小鼠实验，并且实验方案（＃1611004455，01/18 / 2020-01 / 17/2023）得到了西弗吉尼亚大学的机构动物护理和使用委员会的批准。

参考

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