材料和试剂
识破，Lav的ë的nDer ，10.0 V，16 × 100毫米，塑料管BD Hemograd封闭（BD，目录号：BD366643）
聚丙烯锥形管，50毫升（Fisher Scientific，Corning，目录号：07-203-510）
离心管，5 ml，锥形底部，无菌（Benchmark Scientific，目录号：C1005-T5-ST）
1.5 ml离心管，混合霓虹色（美国科学公司，目录号：1415-1448）
快速流动的无菌一次性过滤单元与PES膜，容量500毫升，孔径0.45微米物（Thermo Scientific的Nalgene，目录号：09-740-63E）
铝箔
Polymorphprep梯度培养基（Cosmo Bio USA，目录号：AXS-1114683）
注意：Polymorphprep应在室温下避光保存。长期暴露于光线会影响其功效。

不含L-谷氨酰胺的RPMI-1640（Lonza ，目录号：12-167F）
L-谷氨酰胺200 mM （Thermo Fisher，目录号：25030-081）
注意：将等分试样一次使用，并储存在-80 °C下。在37 °C的水浴中解冻以溶解白色沉淀物，然后添加到RPMI中以制成完整的中性粒细胞培养基。

库存EM级32％多聚甲醛（PFA）水溶液（科学服务，目录号：E15714）。几天内开放使用
超纯0.5 M EDTA pH 8.0（Thermo Fisher ，Invitrogen，目录号：15575020）
DPBS 1 × ，无氯化钙，无氯化镁（Gibco ，目录号141190-136）
细胞培养级水（Corning，目录号：25-055-CV）
牛血清白蛋白，热激分数，无蛋白酶，pH 7 .0 ，≥98％（Millipore Sigma，目录号A3294）
氯化钾颗粒（Mallinckrodt，目录号：6858）
二甲亚砜（DMSO），≥ 99.5％（GC），植物细胞培养物测试（Sigma-Aldrich公司，目录号：D4540）
牛血红素，≥90 ％（Millipore Sigma，目录号：9039）
注意：准备DMSO中的40 mM储备液，以单次使用的馏分等分并在-20 °C下储存。准备工作溶液时要充分混合。添加带有测试样本的仅DMSO控件。

PMA，用于分子生物学应用，≥99 ％，HPLC（Millipore Sigma，目录号：P1585）
注意：在DMSO中准备储备溶液，然后将单次使用的等分试样在-20 °C下冷冻。

LPS-EB，超纯，大肠杆菌0111：B4（InvivoGen Corporation制，目录号：TLR11的-3pelps）
注意：准备一份ddH 2 O的储备溶液，等分并在-20 °C冷冻。将解冻冻结周期限制为三个。

重组人IL-8（CXCL7，77aa）（Peprotech ，目录号：200-08）
钙离子载体A23187 ≥ 98％（TLC），粉末（Millipore公司Sigma，目录号：C7522）
抗人类CD66b-PE，克隆G10F5（Biolegend ，目录号305106）
兔多克隆抗组蛋白H4，瓜氨酸3（H4cit3，Millipore Sigma，目录号：07-596）（请参见注释）
山羊抗兔IgG （H + L）二抗，DyLight 680（Thermo Fisher，目录号：35568）（请参阅注释）
MPO多克隆抗体，已偶联AlexaFluor 594（Bioss抗体，目录号：bs-4943R-A594）
Hoechst 33342（BD Pharmingen ，目录号：561908）
来自猪皮的明胶，粉末，A型，适用于细胞培养（Millipore Sigma，目录号：G1890）
注意：准备2％的库存，并将其在4 °C下保存最多6个月。仅在无菌罩中打开。监视细菌或真菌污染的迹象。

BD Cytofix / Cytoperm试剂盒（BD Biosciences，目录号：554722）。在此协议中仅使用Cytofix / Cytoperm解决方案
洗涤缓冲液（请参阅食谱）
阻塞缓冲区（请参见食谱）
Paraformaldeh ý德8％瓦特工作会有溶液（见配方）
猪皮明胶库存2％（请参阅食谱）
0.6 M KCl （请参阅食谱）
中性粒细胞完全培养基（请参阅食谱）

设备

W¯¯亚特浴在37 ℃下
LabGard ® ES，II级，A2型，生物安全柜（NuAire ，普利茅斯，MN）
台式离心机，带有可旋转的桶形转子（贝克曼库尔特，型号：Allegra X-14R）
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall ST 16R）
CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：Heracell VIOS 160i）
Amnis ImageStream Mark II成像流式细胞仪（Luminex Corporation，美国德克萨斯州奥斯汀）

软件

Amnis INSPIRE（Luminex公司，美国德克萨斯州奥斯汀）进行数据采集
Amnis IDEAS（Luminex公司，美国德克萨斯州奥斯汀）进行数据分析，可在公司网站上下载

程序

使用Polymorphprep培养基进行嗜中性粒细胞分离
笔记：

选择一种高产率的一步中性白细胞纯化方法，因为该NETs检测方案需要相对大量的中性白细胞（每个样品2 × 10 6 ），且背景活化最少。
离心步骤必须在摆桶式转子中进行，因为必须在试管中间，血液与Polymorphprep介质之间的界面处达到500 × g的速度。
当使用女性供体的血液时，多形体分离失败的情况并不少见。根据我们的经验，这种分离与MHCH（平均红细胞血红蛋白浓度）值在正常范围内的两性供体一致。
始终将纯化的中性粒细胞置于冰上，并在2小时内用于实验。

在10毫升EDTA（紫色顶部）真空容器中收集全血，并在抽血1小时内开始中性粒细胞分离。
将离心机的转子和适配器平衡至室温（18 °C至22 °C ）。将“加速度”设置为一；将“减速度”设置为零。将离心力设置为500 × g 30分钟。
始终保持在室温下（1：1比率），非常缓慢地将未稀释的全血覆盖在Polymorphprep培养基上，然后进行离心。离心管将从上到下具有以下几层：血浆，外周血单核细胞–多形核细胞（嗜中性粒细胞）–红细胞（如图1B所示）。
收集中性粒细胞环并轻轻重悬于50 ml冰冷的DPBS中。在4 °C下以400 × g离心10分钟，最大加速度和减速度设置为。除去并丢弃含血小板的上清液。
轻弹沉淀以重悬，然后加入3 ml冰冷的无菌水，并通过轻轻上下吹打几次确保沉淀完全重悬。30 s后，用6 ml无菌冰冷的0.6 M KCl恢复渗透压。充满冰冷的DPBS，在330 × g下离心，在4°C下7分钟。
弃去上清液，然后将沉淀重新悬浮在室温下平衡的中性粒细胞完全培养基（RPMI补充2 mM L-谷氨酰胺）中，浓度为4 × 10 6细胞/ ml。

NETosis的诱导
笔记：

根据实验要求调整NETs诱导剂的选择和治疗时间。
独特的NETs激动剂在治疗期间的不同长度时诱导最佳反应。在该方案中测试了五个时间点（2、7、15、30和60分钟）和5种不同的激动剂（钙离子载体，血红素，血红素，LPS，IL-8和PMA）。
用NETs诱导剂治疗之前，让纯化的中性粒细胞静置以减少其背景活化。
对于每个实验，在1 × DPBS中准备新鲜的8％PFA稀释液，并将其在黑暗中保持阴凉直到需要使用（在下一步中将其进一步稀释至4％的最终浓度。请勿储存用于第二次使用）。
如果如此选择，下面的所有步骤都可以直接在1.5 ml Eppendorf管中进行。但是，通过移液将PFA剧烈混合到细胞悬液中会导致细胞飞溅和丢失。使用5毫升试管可提供更多空间，以进行充分混合并防止细胞损失。

添加纯化的嗜中性粒细胞，2 × 10 6细胞（在500 μ升完整嗜中性粒细胞的培养基）在5毫升的无菌管中，并允许纯化嗜中性粒细胞在室温下平衡。
将试管转移到37°C的5％CO 2的培养箱中，并让它们静置至少30分钟而不关闭瓶盖。
添加100  μ完全RPMI的l为未处理的对照或RPMI含有选择的母语诱导物，轻轻所有管和回流管中的相同的次数混合以培养箱为期望的时间段。在此孵育期间，请勿关闭管盖。
从培养箱中并停止反应通过除去dding 600 μ升新鲜制备的8％PFA的在1 × DPBS为4％PFA的最终浓度，通过移液混合至少5倍，并允许在室温下静置至少30分钟，盖上铝箔。
加入1ml洗涤缓冲液（WB在室温和离心机）在1 ，120 ×克5分钟，在4℃下。将含有PFA的上清液丢弃到指定的化学废物中。为确保除去PFA，请再次重复此洗涤步骤。
轻轻重悬浮沉淀用500 μ升WB的，并将其传输到1.5毫升的Eppendorf管中用于随后的染色步骤。
重复5-ml管的洗涤与另一个5 00 μ升WB的，以确保所有细胞已被收集用于染色。

NETosis染色技术用于流式细胞术成像
笔记：

在所有步骤从细胞完全去除上清，同时注意不来的过程中失去的细胞。
通过用高于和低于供应商推荐的一系列稀释液进行滴定来确定染色板中使用的所有抗体的最佳工作稀释度（例如，对于建议的1：1：1稀释度，应最多添加5种不同的稀释度）经过测试 – 1：250；1：500、1：1,000、1：2,000、1：3,000）。这是必需的，因为不同ImageStream细胞仪上的激光器可能具有不同的功率。
最佳H4cit3稀释度定义为可将阳性染色与背景进行最大分离的浓度（在进行抗体滴定时具有最高的指数得分）。由于公司提供的抗体储备的浓度可能在批次之间变化，因此必须为每个新批次的抗体确定最佳的H4cit4稀释度。
在染色方案结束后的72小时内采集样品。较长的等待时间可能会干扰信号强度，特别是对于Hoechst（随时间从染色细胞中自由泄漏）。我们的建议是立即获取它们。
将染色的细胞在4°C下黑暗保存，并在ImageStream细胞仪上进行采集期间将其保存在冰上和黑暗中。

在1.5 ml的Eppendorf管中，将固定并彻底洗涤的细胞重悬于100μl含CD66b-PE的2％BSA中，用移液器剧烈混合至少5次，并在室温下于黑暗中孵育20分钟。
洗涤步骤：加入500 μ升WB和离心机在1120 ×克5分钟，在4℃下。除去上清液，并重复清洗两次。
重新悬浮在300洗涤的沉淀μ升BD的CYTOFIX / Cytoperm ，通过上下抽吸至少5倍，孵育15分钟，在室温下混合，在黑暗中。
洗涤（步骤2）。
重悬在500洗涤的沉淀μ升阻断缓冲液中，通过上下抽吸至少5倍，孵育过夜，在4混合℃下，在黑暗中。
洗涤（步骤2）。
在100重悬μ升含有2％BSA的抗组蛋白H4瓜氨酸3（H4cit3）初级抗体在最佳确定稀释。上下吸移至少10次，并在4 °C下孵育过夜。
注意：此一抗的浓度是荧光信号最终强度的限制因素（请参见上面的注释b）。

洗涤（步骤2）。
在确定的最佳稀释度下，将微球重悬于100μl含2％BSA的二抗DyLight 680中，并与抗MPO- AlexaFluor 594偶联。至少用移液器上下吸移10次，在黑暗中于室温下孵育30分钟。
洗涤（步骤2）。
在200重悬μ升2％的含有稀释的Hoechst由供应商（：1000 1）所建议的BSA。通过移液彻底混合，并在黑暗中于室温下孵育15分钟。
加入500 μ升WB和离心机在1120 ×克5分钟，在4℃下。除去上清液。
在50重悬μ升WB为的ImageStream （成像流式细胞仪）获取（见注D和E段）。

成像流式细胞仪采集。
在INSPIRE软件中，建立采集设置并创建一个模板，以用于所有实验重复。

在“照明”选项卡下，基于荧光染料面板打开785激光器（侧面散射激光器– SSC）和所有其他要在实验中使用的激光器（可在屏幕上找到显示激光激发波长及其相应染料的图表）。公司的网站）。
在“放大倍数”部分下，将放大倍数调整为60 × 。
在“流体”部分下，将“速度/灵敏度”栏向左滑动（以确保低速和高灵敏度的采集）。
在“文件获取”下，创建一个新文件夹以保存获取的文件（扩展名为。rif –原始图像文件）。
加载具有所有颜色染色的样品的d预期产生最亮的信号，用于所使用的所有染料（用PMA作为示例-这里的理性是确保正荧光信号在范围内，不会被饱和的通道）。
根据相应的激光激发，根据每种荧光染料的荧光最大值而没有通道饱和的情况下调整激光电压。
Ñ OTE：当设置信道特定的激光功率，激光的最佳电压是一个不饱和的检测器（小于4096个像素所生成的图像中），并且也促进了阴性和阳性群体之间有明显的区别。每个已使用通道均应具有“原始最大像素”功能。此功能提供了输入蒙版中包含的像素的最高价值。

设置好激光电压后，将样品“返还”并放在一边，以便在采集单个色彩补偿控制管用于溢出矩阵计算后重新采集样品。
以产生补偿矩阵文件，启动上激发补偿向导，并获取至少1 ，从每个补偿控制管000的事件。
注意：Amnis ImageStream网站上的客户门户网站提供了有关如何使用INSPIRE（购置软件）中的向导运行和验证矩阵的详细说明。补偿矩阵必须应用于每个获取的。rif文件，首次在IDEAS软件中打开以进行分析（从n开始，当使用INSPIRE获取该文件时还应用了补偿矩阵）。溢出补偿可以在数据文件的采集或采集后进行。如果获取的文件的停止栅极基于荧光信号，例如，获取基于对CD66b 5000个阳性细胞，然后它是可取的上INSPIRE执行补偿（使用补偿向导），以确保荧光信号被校正用于其他荧光通道的溢出。

创建亮区面积（BF）与侧向散射（SSC）通道强度的点图，然后单击点（群体）并评估图库中显示的对应图像，可以找到单个单元格和边界决定。在此协议中，对于纯化的中性粒细胞，单个细胞的门的面积应在50 µm 2至200 µm 2的范围内。这应该排除大部分的碎片，小颗粒（在底部和左侧）和骨料（略右上-请参考˚F igure 2A）。
注：d UE，以中性粒细胞的性质，我们认为这将是更容易识别汗衫通过使用面积与SSC的; 但是，也可以使用BF的面积与纵横比（AR）来确定单个单元格。长宽比是宽度与高度的比率，应将单个事件定位在距离AR接近1的事件处。

在上方的门上，使用BF（通道1或9）的梯度RMS（均方根）功能创建直方图，以选择聚焦的单元格。由于此功能可测量图像的清晰度，因此像素值大于等于40的更改通常对应于最佳聚焦的像元。选择库并可视化图像库中库中的对应单元格将有助于确定在此直方图中从何处开始聚焦门。
设置“获取”选项卡以获取20,000个单个和重点单元（分别创建了第一和第二个图）。
保存此模板以用于后续采集，并具有相同的激光功率，放大倍数和采集的事件数设置。
在“采集”选项卡中键入样品的名称。
“加载”样本，确认单元格居中并对准焦点，然后单击“获取”。
注意：按照两个可用的明场通道之一（通道1或通道9）确认单元格居中（即，单元格在通道的中间流动）并聚焦（流动单元格的图像清晰且清晰）酥脆）。

数据分析

笔记：

图2A中显示了步骤3至5的代表性图像。
有关我们测试过的NETs激动剂的完整实验结果，请参阅我们以前的出版物（Barbu等，2020）。

在IDEAS分析软件中，打开。rif扩展文件进行分析。
应用要使用的补偿矩阵。
注意：先前制作的补偿矩阵存储为。ctm文件。IDEAS软件将提示您选择每个补偿矩阵。需要分析的rif文件。导航到存储的文件并按照分析软件中的说明加载它。

创建BF图像（M01 –默认遮罩）与侧面散射（SSC –通道6）的面积的点图。
注意：具有较高SSC和相对较大细胞面积的单个中性粒细胞将显示为不同的聚集种群。Ç赫克几个单电池以限定的边界单峰栅极和排除碎片和单核细胞。除了图形中可见的事件簇以外，确定和验证门边界的最佳方法是单击图中的一些点并可视化对应的图像。当区轴线看到，不要指望单一事件右侧的碎片或小细胞群体和双联体的左侧，更大的聚集体或更大的细胞，如果细胞悬浮液可能含有这种细胞。

通过使用明场中的聚焦质量功能Gradient RMS（均方根）来选择聚焦的单元格。
创建粒细胞特异性标志物CD66b与Hoechst和门双重阳性事件（CD66b + Hoechst +）信号强度的点图，以进行进一步分析。
在CD66b + Hoechst +门中，为H4cit3信号的强度创建直方图，并评估该标记的H4cit3 +细胞百分比和/或均值/中值荧光（图2B）。
注意：我们建议对此参数使用中值强度荧光。

在核通道（Hoechst公司）的CD66b +的Hoechst +栅极创建“区”的一个点图相对于特定纹理特征“明亮细节Intensity_R3” （BDI_R3）以识别与嗜中性粒细胞解聚从那些在CD66b +的Hoechst +栅极正常核细胞核（图2C）。
注意：BDI是一项功能，可以计算图像中被遮罩区域内的局部亮点的强度（此协议以及此协议中使用的其他IDEAS功能的描述可以在可下载的IDEAS ImageStream Analysis Software用户手册中找到）。

图2.使用IDEAS软件识别中性粒细胞及其核NETosis标记的门控策略。A.用明场区域（BF – X轴）与通道6（SSC – Y轴）上的侧向散射强度（左图）的两参数点图识别的单个单元格。通过使用Brightfield （中间面板）中的Gradient RMS（均方根）来选择聚焦的单重态细胞。嗜中性粒细胞（CD66b + Hoechst +，草莓红）在通道7的Hoechst荧光（X轴）和通道3的CD66b（Y轴）（右图）的两参数荧光点图中由单线态聚焦细胞鉴定。B.代表性直方图显示CD66b + Hoechst +门中H4cit3 hi细胞的百分比和H4cit3中值荧光强度（MFI）。在右侧面板的嗜中性粒细胞在RPMI不处理（红色）或用共治疗20 ü中号氯化血红素15分钟（绿色）。C.解聚核（紫色）和正常核（绿色）用识别d OT-情节核的面积（吗啉Hoechst公司的迟缓掩模功能染色上通道7）相对于Hoechst公司的亮度细节强度R3从染色的核的（例子这两个门位于面板的右侧）。Ñ体中性不处理（左）或具有共治疗20 μ中号氯化血红素60分钟（右）。显示了具有缩合核的细胞的百分比。比例尺= 7μm 。

在核染料通道（Hoechst）和MPO通道上使用相似性功能来确定两个图像在具有正常和未凝聚核的细胞中被遮盖的核区域内线性相关的程度（图3A）。
注意：当位于细胞质中时，MPO染色与Hoechst染色核掩模相比具有不同的分布（即，相似度评分低，没有共定位）。当两种染料在核位置的强度很高时，高相似度值表示共定位。

使用核染料通道上自定义的“水平集”蒙版和“ LobeCount ”功能检测具有多叶核的细胞百分比的减少，并分别量化具有可变叶数（1叶到4叶）的细胞（图3B）。
在1瓣门中创建一个“核面积”与“整个细胞区域的核比率”的点图，以量化核超凝结。超凝聚核的两个参数值都很低。（图3C）。
注意：有关如何构造此自定义功能的说明，请参见独立的Notes章节。为了更好地解析核区域，应为上述参数使用自定义蒙版。

在正常核门中，构建“标准偏差”（X轴）和“调制”（Y轴）的点图以评估细胞膜质地的变化。暗场（SSC通道）的标准偏差和明场的调制的高值表明嗜中性粒细胞膜受损（图3D）。
注意：“标准偏差”功能提供有关对象复杂性的信息。调制功能可以量化图像质量，从而表征细胞的纹理。

图3. IDEAS软件分析功能可识别和量化其他核和细胞改变。A. DNA（Hoechst –通道7）和MPO（AF-594 –通道4）的相似性分析功能表明，在具有正常核（绿色）和缩合核（紫色）的嗜中性粒细胞中，核区与I型颗粒共定位。包括具有低（< 1）和高（3）相似度分数的细胞示例，分别指示低和高DNA-MPO共定位（其特定位点在图中的位置以浅绿色表示）。B.核瓣计数功能可根据核图像识别核瓣数目的变化，并量化每个类别中的细胞数目。包括具有1个叶或多裂核的嗜中性粒细胞的代表性图像。C. X轴上核面积的点图（Hoechst染色的形态学掩模）与1个叶核门中整个细胞面积的核比例之比确定了低核面积的超浓缩核，因此除以核素后的比例很低。整个细胞区域。呈现了具有超浓缩核的细胞的代表性图像。D.具有受损膜的中性粒细胞（亮绿色）通过通道6（X轴）与明场调制（Y轴）上标准偏差侧向散射的两参数点图来区分。两项功能均获得高分表示复杂和有纹理的对象。包括两个闸门内细胞的代表性图像。（BF =明场； H =赫斯特）。比例尺= 7μm 。

建立所有分析参数后，保存文件。对于每个。rif采集文件，在分析步骤中创建了两个附加文件（.daf和.cif ）。使用。daf进行分析。不要删除。cif一个（这是所有分析数据的存储位置）。
使用“工具”选项卡下的“批处理数据文件”将所有保存的分析参数分配给其余的。rif文件进行分析。
在里面。daf分析文件使用“报告”为目标亚群中所有感兴趣的参数定义统计报告，然后使用“生成统计报告”将其应用于所有分析的样本文件（图4）。

图4.定义并生成具有所有感兴趣的分析参数的统计报告。使用“添加文件”功能将所有已定义的统计信息应用于。daf分析文件。IDEAS软件生成并存储一个.txt统计文件，可以使用Excel打开该文件以进行进一步处理。

笔记

在该协议中，所有步骤（嗜中性白细胞的分离和刺激，染色，检测和NETs定量）都会严重影响数据质量。
中性粒细胞因在纯化过程中易于活化而臭名昭著。在NETs刺激之前，将纯化的种群在培养箱中静置30分钟，以减少假阳性数据。
通过另外的方法（嗜中性白细胞群体的确认纯化例如，细胞离心涂片器）。
通过将PFA添加到反应混合物中来停止NETs攻击步骤，而不是旋转试管并除去上清液，然后再添加PFA以通过其他方式减少活化。
通过运行带有细胞和二抗DyLight 680抗体但无H4cit3一抗的对照管，确认二抗（DyLight 680）没有非特异性结合。
使用自定义遮罩和IDEAS软件进行数据分析，因为它们可以更准确地表示关注区域。通过确认掩膜确实掩盖了感兴趣的区域（即，没有丢失目标区域的一部分，或者相反，掩盖了什么区域之外的“重影”区域）来验证自定义掩膜的总细胞面积和细胞核与功能相关）（Dominical et al。，2017）。
请注意，该协议允许在将DNA和细胞质蛋白串释放到细胞外空间之前，在整个嗜中性粒细胞中鉴定NETosis标记。这个细节对于决定NETs诱导剂对刺激做出反应的峰值细胞数的挑战时间至关重要，并且可以通过ImageStream细胞仪获取。长时间的刺激可能会导致假阴性结果，原因是细胞已经溶解并释放了它们的内含物，因此对于流式细胞仪不再“可见”。这种情况可以通过独立评估来确认：例如，通过在染色管中观察到的沉淀物的大小，以及与之相比，通过流式细胞仪在受激管中主动捕获的CD66b + Hoechst +门中的事件数减少了。未经处理的对照。
生成自定义特征以评估核超凝结：
在IDEAS软件中，打开一个。在daf扩展文件中，选择一个Hoechst + CD66b +双阳性细胞。
在IDEAS的顶部菜单上，选择“分析”，然后选择“掩码”。在打开的弹出窗口中，选择“新建”，然后选择“功能”。
要为核染色创建遮罩：为图像和通道框选择核图像的荧光通道。在功能蒙版的下拉菜单中，通过查看成像框中的蒙版变化来测试哪种蒙版功能最适合核图像（通常“形态”最适合作为核蒙板，因为它可以更准确地覆盖核染色区域）（Dominical等，2017）。选择新的功能蒙版后，单击“确定”。
为该掩码创建一个名称，或使用软件建议的默认名称。
再次单击“确定”以生成遮罩。
要创建新的面膜，请按“新建”。
重复步骤b到e，以使用CD66b图像或BF通道遮盖整个细胞区域。“对象”或“侵蚀”功能遮罩是遮罩单元格区域的不错选择。
单击“关闭”关闭mas k窗口。
要将新功能应用于创建的这些新的自定义蒙版，请返回顶部菜单栏中的“分析”，然后选择“功能”。在弹出窗口中选择“新建”。
“功能类型”框可用于选择一个选项。选择“单个”，然后在侧面的下拉菜单中选择“区域”功能。
在“功能类型”框下方的遮罩框中，选择新创建的核遮罩。“设置默认名称”或创建新名称。完成后单击“确定”。
代表吃了步骤i至k。接下来，使用生成的“整个单元”蒙版输入新区域特征的蒙版框，以创建新的“整个单元区域”特征。
要计算所创建的这些新要素的比例，请在同一要素窗口中选择“新建”以创建组合要素。
在“功能类型”框中，选择“组合”。
在左侧的“功能框”中，选择创建的“核区域”功能。
突出显示该功能，然后在窗口的右侧选择“向下箭头”以将该功能插入框中。
选择“ /”（正斜杠）以计算比率。
突出显示创建的“整个单元格的面积”新功能，然后按向下箭头以将该功能插入比率符号后的框中。现在，核面积除以整个细胞面积。
命名新功能。完成后单击“确定”。
单击“关闭”以关闭“功能”窗口。现在可以在直方图或两参数点图中应用此新功能。

菜谱

8％低聚甲醛（PFA）工作溶液
2.5 ml PFA 32％库存

加入10毫升1 × DPBS，无钙，无镁

洗涤缓冲液（WB）
10克BSA（终浓度2％）

从0.5万库存中提取2毫升EDTA（最终浓度为2毫米）

加入500毫升1 × DPBS，无钙，无镁

通过0.45微米的滤器μ米孔隙

封闭缓冲液（BB）（保持无菌状态）
15克BSA（终浓度3％）

5毫升猪皮肤明胶储备液（最终浓度为0.2％）

加入50毫升1 × DPBS，无钙，无镁

过滤0.45 μ米孔隙

猪皮明胶2％
2克猪皮明胶

100毫升ddH 2 O

0.6 M KCl （保持冰冷）
37.28 g氯化钾颗粒

1,000毫升ddH 2 O

通过0.45微米的滤器μ米孔隙

中性粒细胞完全培养基（保持无菌）
从200 mM储备液中提取5 ml L-谷氨酰胺（终浓度2 mM ）

500 ml不含L-谷氨酰胺的RPMI-1640

致谢

作者要感谢医生。马里亚纳卡普兰（NIAMS）和博士。菲尔·麦科伊（Phil McCoy）和NHLBI流式细胞仪核心，为其提供了出色的科学和技术建议；吉姆·尼科尔斯和达琳·艾伦与献血者和博士的招聘协助。Laxminath Tumburu为他提供了帮助。这项工作得到了美国国立卫生研究院国家心脏，肺和血液研究所（至SLT）的壁内研究计划的支持。

利益争夺

作者声明没有竞争的金融和非金融利益。

伦理

从所有获得NHLBI机构审查委员会批准的研究方案NCT0004799入组血液样本的受试者均获得了知情同意。

参考

1. Barbu ，EA，Dominical，VM，Mendelsohn，L。和Thein ，SL（2019）。中性粒细胞在接受镰刀状细胞疾病的羟基脲治疗的患者中仍然有害。PLoS One 14（12）：e0226583。
2. Barbu ，EA，Dominical，VM，Mendelsohn，L。和Thein ，SL（2020）。检测与组蛋白H4的瓜氨酸化定量早期NETosis随着图像流式细胞仪版本4.接待免疫学11：1335。
3. Barnado ，A.，Crofford ，LJ和Oates，JC（2016年）。在床边：嗜中性粒细胞胞外诱捕器（NETs）作为自身免疫疾病中生物标志物和疗法的靶标。Ĵ Leukoc生物化学99 （2）：265-278。
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