材料和试剂
植物材料
种间的IBL（近交回交系）种群（BC 2 F 6 ），来自杂交S. lycopersicum cv。将Tueza（轮回亲本）× P . pimpinellifolium （LA1589）（供体亲本）用作植物材料。该种群在先前的研究中得到发展，并在文献中有更完整的描述（Celik等，2017；GürbüzÇolak等，2020a和2020b ）。Tueza是栽培新鲜市场番茄符合大（150 - 160克），红，稍扁平圆水果。LA1589是具有小野生番茄加入（0.8 - 1克），红色，圆形水果。IBL人口和父母都是在土耳其安塔利亚的温室中种植的。每个基因型十株植物分别在宽行和窄行之间分别长140 cm和30 cm的双行中生长。在行中以40cm的间隔将植物间隔开。对于基础施肥，每公顷施用500 kg 15:15:15（N：P：K）肥料和50 t堆肥。在每次灌溉中使用滴灌施肥（1.4 dS m-1 EC值），每次灌溉使用1-2-1肥料直至结实，2-1-1肥料直到果实成熟，1-1-2肥料后成熟。

主要成分
C18柱（GL Sciences ，目录号：5020-03946）
NH2柱（GL Sciences ，目录号：5020-05546）
RTx 5DA色谱柱（Restek ，目录号：10523）
注射器（BD ，翡翠，目录号：307742）
注射器过滤器（Millipo re，目录号：Z227412）
聚酰胺膜滤器（45 µm，47 mm）（S artorius ，目录号：25006-47-N）
乙腈（VWR ，目录号：97065）
磷酸二氢铵（Merck ，目录号：1.01126.0500）
丁羟甲苯（BHT）（Sigma - Aldrich ，目录号：W218405）
氯仿（VWR ，货号：JT9175）
二氯甲烷（VWR ，目录号：BDH23373）
乙酸乙酯（VWR ，目录号：JT9282）
己烷（VWR ，目录号：BDH24575）
甲醇（VWR ，目录号：BDH20864）
盐酸甲氧明（Sigma - Aldrich ，目录号：M6524）
N-甲基-N-（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺（MSTFA）（Sigma - Aldrich ，目录号：69479）
正磷酸（Merck ，目录号：100573）
磷酸二氢钾KH 2 PO 4 （Riedel-deHaën ，目录号：04243）
吡啶（Sigma - Aldrich ，目录号：270970）
三乙胺（Merck ，目录号：8083520500）
三氟乙酸（Sigma - Aldrich ，目录号：T6508）
0.1 M KH 2 PO 4 ，pH = 7 .0 （请参阅配方）
0.05％三氟乙酸（水溶液）（请参阅食谱）

用作控制分子的化学品
β-胡萝卜素（Carl Roth ，目录号：5669.1）
芹菜素（Applichem ，目录号：A3641）
咖啡酸（Sigma - Aldrich ，目录号：C0625）
儿茶素（Applichem ，目录号：A4325）
绿原酸（Sigma - Aldrich ，目录号：00500590）
Chry sin（Fluka ，目录号：9582）
肉桂酸（Sigma - Aldrich ，目录号：W228826）
柠檬酸（Carl Roth ，目录号：X863.1）
香豆酸（Carl Roth ，目录号9906.1）
氰胺盐（Carl Roth ，目录号4545.1）
表儿茶素（Applichem ，目录号：A3424）
表没食子儿茶素（Applichem ，目录号：A2010）
阿魏酸（Sigma - Aldrich ，目录号：128708）
果糖（Sigma - Aldrich ，目录号：F0127）
富马酸（Sigma - Aldrich ，目录号：47910）
没食子酸（Sigma - Aldrich ，目录号：91215）
葡萄糖（Sigma - Aldrich ，目录号：G8270）
羟基苯甲酸（Sigma - Aldrich ，目录号：W398608）
乳酸（Sigma - Aldrich ，目录号：L1750）
叶黄素（Applichem ，目录号：A1283）
木犀草素（Applichem ，目录号：A3424）
番茄红素（Carl Roth ，目录号：5670.1）
苹果酸（Carl Roth ，目录号8684.1）
Malvidin（Applichem ，目录号：A8720）
杨梅素（Carl Roth ，目录号：6461.1）
氧化型谷胱甘肽（Sigma - Aldrich ，目录号：G4376）
Pelargonidin（Carl Roth ，目录号：4540.1）
Peonidin（R＆D ，目录号：0942）
翼龙（Sigma - Aldrich ，目录号：P1499）
槲皮素（Applichem ，目录号：A3415）
还原型谷胱甘肽（Sigma - Aldrich ，目录号：G4251）
白藜芦醇（Sigma - Aldrich ，目录号：R5010）
水杨酸（Sigma - Aldrich ，目录号：W398500）
ki草酸（Carl Roth ，目录号：7305.2）
芥子酸（Carl Roth ，目录号：5317.1）
蔗糖（Sigma - Aldrich ，目录号：S5016）
丁香酸（Carl Roth ，目录号：5361.1）
酒石酸（Carl Roth ，目录号：K302.1）
香草酸（Carl Roth ，目录号3685.1）
维生素C（Sigma - Aldrich ，目录号：A5960）
维生素E（Sigma - Aldrich ，目录号：T3251）
玉米黄质（Carl Roth ，目录号5672.2）
萃取溶剂1（请参见配方）
萃取溶剂2：氯仿：甲醇：水（1：3：1，v：v：v）（请参见配方）

设备

-80°C冷冻室
分析天平（梅特勒-托利多，型号：AB54-S）
离心机（贝克曼库尔特（Beckman Coulter），型号：Allegra X-15R）
离心机（T hermo Scientific，型号：SL 16）
带有RTx 5DA色谱柱（0.25 mm × 0.25 mm × 30 m）的GC / FID（Shimadzu ，型号：GC 2010 plus ）（Restek;目录号：10523）
HPLC（Shimadzu ，型号：LC20-AT;折射率（RI）检测器型号：RID 10A;光电二极管阵列（PDA）检测器型号：SPD M20A;荧光检测器型号：RF 20A）带C18色谱柱（5 µm - 25 × 4.6 mm））（GL Sciences ，目录号：5020-03946）和NH2色谱柱（5 µm - 25 × 4.6 mm）GL Sciences; 目录号：5020-05546）
磨刀机（Retsch ，型号：GM200）
冻干机（基督，型号：Epsilon 1-4 LSC）
轨道振动筛（IKA ，型号：KS260）
真空蒸发器（L一bconco ，型号：Centrivap）
真空过滤（Do-Chrom ，型号：FB01）

软件

LC解决方案（Shimadzu，https://www.shimadzu.com/an/lcms/opensolution/opensol4.html）
GC解决方案（Shimadzu ，https://www.shimadzu.com/an/gc/advflowtech/sw-dl.html）

程序

代谢物的提取
收集10个成熟的Tom Ato水果（平均新鲜重量为65克），散装并切成小方块。取100克样品，冻干两天（确保它们完全干燥）。用刀磨机研磨干燥的样品，得到细粉。
称量1克干燥样品，然后加入5毫升萃取溶剂1 （参见R ecipes）以萃取非极性代谢物。通过在18℃下以400 rpm的速度在振荡器上振荡过夜，提取代谢物。
离心3样品，724 ×克在4℃下进行20分钟。保存上清液，并使用相同的溶剂对沉淀进行第二次过夜萃取。
再次离心样品，合并提取物。分装提取物（1 ml）并保存在-80°C直至分析。
要提取的极性代谢物，使用在得到的颗粒步骤A4和按照相同的步骤1-4使用萃取溶剂2（参见ř ecipes）。分装提取物（1 ml）并保存在-80°C直至分析。
见注1。

代谢物的HPLC分析
类胡萝卜素

两种不同的方法用于分析类胡萝卜素：方法1用于分析番茄红素和β-胡萝卜素；方法2用于分析叶黄素和玉米黄质。

方法1：

制备番茄红素在甲醇：丙酮（1：1，v：v）中浓度分别为1，5，10，25，50和100 ppm的标准溶液，以及β-胡萝卜素在二氯甲烷中的浓度为1，5，10，25，50， 100 ppm浓度。
向乙酸乙酯和乙腈中添加0.05％三甲胺。使用真空过滤，通过膜滤器过滤甲醇，乙酸乙酯和乙腈。
以50:40:10（v：v：v）的比例使用甲醇：乙酸乙酯：乙腈作为流动相进行等度洗脱。
使用RP色谱柱并将色谱柱温度设置为30°C。将流速设置为1.5 ml / min。
通过注射器过滤器过滤样品和标准溶液。进样20 µl样品或标准溶液。在469 nm处检测番茄红素和β-胡萝卜素。
参见注释2和3。
一种用于100ppm的标准molecul色谱ES（图1），标准曲线（图URE 2一和2b ）和番茄样品色谱（图3）被示出。

图1.番茄红素和β-胡萝卜素标准品的色谱图

图2.类胡萝卜素的标准曲线。a ）番茄红素和b）β-胡萝卜素。

图3.番茄样品的色谱图，显示番茄红素和β-胡萝卜素峰

方法2：

配制叶黄素和玉米黄质在二氯甲烷中的标准溶液，其中含有0.01％BHT，浓度为0.5、1、5、12.5、50、100、200和300 ppm
向乙腈中添加0.05％三甲胺。使用真空过滤器通过膜滤器过滤甲醇和乙腈。
以90:10（v：v）的比例使用甲醇：乙腈作为流动相进行等度洗脱。
使用RP色谱柱，并将色谱柱温度设置为30°C。将流速设置为1 ml / min。
通过注射器过滤器过滤样品和标准溶液。进样20 µl样品或标准溶液。在469 nm处检测叶黄素和玉米黄质。
参见注释2和3。
色谱用于50ppm的标准分子（图4），标准曲线（图5A和5 B）和番茄样品色谱（图6）中示出。

图4.叶黄素和玉米黄质标准品的色谱图

图5.类胡萝卜素的标准曲线。a）叶黄素和b）玉米黄质。

图6.具有叶黄素和玉米黄质峰的番茄样品色谱图

维生素C

在超纯水中以10、50、100、150、200和250 ppm的浓度制备维生素C的标准溶液。
使用真空过滤通过膜滤器过滤甲醇和磷酸盐缓冲液。
使用甲醇：KH 2 PO 4 10:90（v：v）的比例作为等度洗脱的流动相。
使用RP色谱柱并将色谱柱温度设置为40°C。将流速设置为1 ml / min。
通过注射器过滤器过滤样品和标准溶液。进样20 µl样品或标准溶液。在265 nm处检测维生素C。
见注2。
显示了100 ppm标准分子的色谱图（图7），标准曲线（图8）和番茄的样品色谱图（图9）。

图7.维生素C标准品的色谱图

图8.维生素C的标准曲线

图9.带有维生素C峰的番茄的样品色谱图

维生素E

制备浓度为10、50、100、150、200、250、300和500 ppm的维生素E在乙腈：甲醇（80:20，v：v）中的标准溶液。
使用真空过滤器通过膜滤器过滤甲醇和乙腈。
使用25:75（v：v）比例的甲醇：乙腈作为流动相进行等度洗脱。
使用RP色谱柱并将色谱柱温度设置为40°C。将流速设置为1.5 ml / min。
通过注射器过滤器过滤样品和标准溶液。进样20 µl样品或标准溶液。用荧光检测器在300 nm激发和360 nm发射下检测维生素E。
见注2。
显示了500 ppm标准分子的色谱图（图10），标准曲线（图11）和番茄的样品色谱图（图12）。

图10.维生素E标准品的色谱图

图11.维生素E的标准曲线

图12.带有维生素E峰的番茄的样品色谱图

酚酸

制备浓度为1、5、10、20、30、40和50 ppm的酚酸在甲醇中的标准溶液。
使用真空过滤器通过膜滤器过滤NH 4 H 2 PO 4 ，乙腈和H 3 PO 4 。
使用NH 4 H 2 PO 4 （流动相A），乙腈（流动相B）和H 3 PO 4 （流动相C）作为梯度洗脱的流动相。有关梯度洗脱参数，请参见表1。

表1.梯度洗脱参数

使用RP色谱柱并将色谱柱温度设置为35°C。将流速设置为1 ml / min。
通过注射器过滤器过滤样品和标准溶液。进样20 µl样品或标准溶液。使用PDA检测器在不同波长下检测酚酸。在204 nm处检测到表没食子儿茶素，表儿茶素和chrysin。在254 nm处检测到羟基苯甲酸，香草酸，杨梅素和槲皮素。在280 nm处检测到没食子酸，儿茶素，丁香酸和肉桂酸。绿原酸，咖啡酸，香豆酸，阿魏酸，芥子酸，白藜芦醇，芹菜素和pterostilben都在320nm处检测。木犀草素在360 nm处检测到，而氰化物，pelargonidin和peonidin在520 nm处检测到。
见注2。
显示了50 ppm标准分子的色谱图（图13），标准曲线的色谱图（图14a-v）和番茄的样品色谱图（图15）。

图13.标准分子的色谱图

图14.酚酸的标准曲线。a）表没食子儿茶素b）表儿茶素c）胰蛋白酶d）羟基苯甲酸e）香草酸f）杨桃素g）槲皮素h）没食子酸i）儿茶素j）丁香酸k）肉桂酸l）绿原酸m）咖啡酸n）香豆酸o）阿魏酸p）芥子酸r）麦维菌素s）白藜芦醇t）芹菜素u）萜品戊烯v）木犀草素w）花青素x）pelargonidin y）peonidin 。

图15.番茄样品色谱图，显示酚酸峰

谷胱甘肽

准备浓度为10、50、100、150、200、250 ppm的酚酸在甲醇中的标准溶液。
使用真空过滤，通过膜滤器过滤三氟乙酸和甲醇。
使用三氟乙酸：甲醇（97：3，v：v）作为流动相进行等度洗脱。
使用RP色谱柱并将色谱柱温度设置为35°C。将流速设置为0.2 ml / min。
通过注射器过滤器过滤样品和标准溶液。进样20 µl样品或标准溶液。用PDA检测器在208 nm处检测谷胱甘肽的氧化还原形式。
见注2。
下面列出了50 ppm标准分子的色谱图（图16），标准曲线（图17a -b）和番茄的样品色谱图（图18）。

图16.还原和氧化的谷胱甘肽标准品的色谱图

图17. a）还原的和b）氧化的谷胱甘肽的标准曲线

图18.带有谷胱甘肽结果的番茄样品色谱图

糖类

在100、150、200、250、300、500、750、1000、1500、2000、2500 ppm浓度的超纯水中制备糖（葡萄糖，果糖和蔗糖）的标准溶液。
使用真空过滤，通过膜滤器过滤三氟乙酸和甲醇。
使用乙腈：水（90:10，v：v）作为流动相进行等度洗脱。
使用RP色谱柱并将色谱柱温度设置为40°C。将流速设置为1 ml / min。
通过注射器过滤器过滤样品和标准溶液。进样20 µl样品或标准溶液。使用正模式的RI检测器检测糖。
见注释2和4。
色谱用于50ppm的标准分子（图19），标准曲线（FIGUR Ë图20A-C）和番茄样品色谱（图21）在下面给出。

图19.葡萄糖，果糖和蔗糖标准品的色谱图

图20.糖的标准曲线。a）葡萄糖b）果糖c）蔗糖。

图21.番茄的样品色谱图，显示糖的峰。在完全成熟的水果中未检测到蔗糖。

代谢物的GC分析
有机酸

称量标准分子，然后将它们溶解在浓度为0.25、0.5、1、2.5、5、7.5、10 mg / ml的盐酸甲恶胺（40 µl，在吡啶中为20 mg / ml ）中。
取100 µl样品。使用真空蒸发器在30°C下蒸发样品的有机溶剂，直到完全干燥。
将番茄样品在超声浴中溶解于盐酸甲恶胺（40 µl，在吡啶中为20 mg / ml）中，溶解5分钟。
将样品和标准分子在37°C衍生90分钟。
使用MSTFA执行第二次衍生化。向样品和标准分子中加入60 µl MSTFA，并在37°C下孵育30分钟。
在离心样品2 5 ，830 ×克，5分钟。
将上清液注入GC-FID。
使用热梯度程序分析Rtx 5DA色谱柱上的有机酸。从100设定的柱温℃（保持1分钟）至150℃以5的速率℃每分钟-1 ，150℃（保持1分钟）至280℃以5℃每分钟的速率-在最终温度下保持1到2分钟。
将进样口温度保持在250°C，将检测器温度保持在300°C。使用氮气作为载气，并调整分流比1/25。
见注释5和6。
色谱对1mg / ml的标准分子（图22），标准曲线（FIGUR Ë 23A-G）和番茄样品色谱（图24）在下面给出。

图22.有机酸标准品的色谱图

图23.有机酸的标准曲线。a）水杨酸b）富马酸c）乳酸d）苹果酸e）酒石酸f）iki草酸g）柠檬酸。

图24.番茄的色谱图，显示有机酸的峰

数据分析

重复实验并记录对照分子三个重复的数据。使用LC溶液（用于HPLC数据）和GC溶液（用于GC数据）绘制标准曲线。这些软件程序会计算三次分析的平均值，并根据面积和浓度自动绘制曲线。同样，软件程序会使用标准曲线自动计算样品中的代谢物浓度。亲本系和群体的平均代谢物含量见表2。

表2.在IBL人群和父母中测得的平均代谢物含量

*数量以mg 100 g -1 DW给出。

**在番茄样品中未检出白藜芦醇，萜烯，花青素，pelargonidin，peonidin，蔗糖，富马酸和酒石酸。

笔记

最好在黑暗和低温（+4°C）下进行提取，因为某些代谢物会受到光照和高温的影响。
这是更好地离心样品（25 ，830 ×克注射器过滤前一次，1-2分钟），以延长柱寿命。
RP C30色谱柱可以提供更好的分离度，但比RP C18色谱柱昂贵。
最好在分析之前等待RI检测器的调节。有时，最好是离开与流动相的检测器过夜低流速（例如，为0.1ml /分钟- 0.5ml /分钟）。
可以使用氦气代替氮气作为载气。
在吡啶中新鲜制备盐酸甲氧明。
仅使用超纯水进行提取和分析。

菜谱

萃取溶剂1
二氯甲烷：含有0.01％BHT的己烷（1：1，v：v）避免在提取代谢物时发生氧化反应
量取50毫升二氯甲烷
向二氯甲烷中加入0.01克BHT，混合直至BHT溶解
加入50毫升己烷并摇匀
萃取溶剂2：氯仿：甲醇：水（1：3：1，v：v：v）
量取20毫升氯仿
加入60毫升甲醇并充分混合
将溶液放在振荡器上，并向溶液中缓慢加入水，以避免相分离
0.1 M KH 2 PO 4 ，pH = 7 .0
在烧杯中称量13.609 g KH 2 PO 4
加800毫升水，搅拌直至KH 2 PO 4溶解
使pH值达到7.0
用水补足至1,000毫升
0.05％三氟乙酸（水溶液）
在容量瓶中计量950毫升水
加入0.5毫升三氟乙酸，用水将体积调至1,000毫升

致谢

这项工作得到了土耳其科学技术研究委员会（TÜBİTAK，项目号114Z116）和土耳其共和国农林部，农业研究所总局（TAGEM-16 / AR-GE / 03）的资助。。该协议源自GürbüzÇolak等。（2020 a，b ）手稿。

利益争夺

作者声明没有任何金融和非金融竞争利益。

伦理

这些规程中未使用任何人类和/或动物受试者。

参考

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