材料和试剂
1. 35毫米玻璃皿（IWAKI，目录号：3971-035）
2. 100毫米细胞培养皿（Falcon，目录号：353003）
3. 1.5米升吨UBE（沃森，目录号：131-815C）
4. 15米升管中（Corning，目录号：CLS430791）
5. 0.22μm过滤器（Millipore，目录号：SLGP033RS）
6.编码FRET探针的哺乳动物表达载体（请参见下面过程部分的开头）
7. HEK293细胞（ACTT ® CRL-1573 TM ）
8.聚-L-赖氨酸（PLL）溶液0.01％（Sigma-Aldrich，目录号：P4707-50ML）
9. DMEM（Ñ acalai Ť式的，目录号：08458-16）
10. 0.5％胰蛋白酶-EDTA（10 ×）（Gibco，目录号：15400-054）
11.胎牛血清（Gibco，目录号：10270-106）
12.带有PLUS试剂的Lipofectamine LTX（Thermo Fisher Scientific，目录号：15338100）
13. Opti-MEM（1 × ）（Gibco，目录号：2151680）
14. FluoroBrite DMEM（Gibco，目录号：A1896701）
15.丙酮酸钠（100 mM）（Gibco，目录号：11360-070）
16. GlutaMAX（100 × ）（Gibco，目录号：35050061）
17.氯化维拉帕米（Wako，目录号：228-00783）
18. PEI MAX（MW = 40,000）（Polysciences，目录号：24765-1）
19. 5'-t磷酸腺苷（ATP）二钠盐（东方Y东，目录号：45142000）
20.链球菌溶血素O（SLO）（生物科学院，目录号：01-531）
21. DAPI（Sigma-Aldrich，目录号：D9542-1MG）
22. NaCl（N acalai T esque，目录号：31320-05）
23. Na 2 HPO 4 · 12H 2 O（Nacalai Tesque ，目录号：31723-35）
24. KCl（Nacalai Tesque ，目录号：28514-75）
25. KH 2 PO 4 （Nacalai Tesque ，目录号：28721-55）
26. HEPES（Nacalai Tesque ，目录号：17514-15）
27. KOH（Nacalai Tesque ，目录号：28616-45）
28. CH 3 COOK（和光目录号：160-03175）
29.氯化镁2 · 6H 2 O（Nacalai Tesque ，目录号：20909-55）
30.二甲基亚砜（DMSO）（西格玛奥德里奇，目录号：D2650）
31. NaOH（Nacalai Tesque ，目录号：31511-05）
32. PLL解决方案（请参阅食谱）
33. 10 × PBS（-）（请参阅食谱）
34. 1 × PBS（-）（请参阅食谱）
35. 10 ×传输缓冲区（请参阅食谱）
36. 1 ×传输缓冲区（请参阅食谱）
37. 0.05％胰蛋白酶-EDTA（请参阅食谱）
38. 100 mM ATP储备溶液（请参阅食谱）
39. 50 mM维拉帕米储备溶液（请参阅食谱）
40. 1 mg / m l DAPI储备溶液（请参阅食谱）
41. 100 mM NaN 3储备溶液（请参阅食谱）
42. 1 M MgCl 2储备溶液（请参阅配方）
43. 1 mg / m l PEI-MAX（请参阅食谱）
设备
自动拍（TOMY，型号：LSX-500）
涡旋混合器（科学工业公司，型号：VORTEX-GENIE 2）
温度浴（TAITEC，型号：SDminiN）
CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：Forma 310 Direct Heat CO 2培养箱）
离心机（TOMY，型号：LC-200，转子：TS-7LB）
细胞计数器（DeNovix，型号：Cell Drop BF）
共焦激光扫描显微镜（Carl-Zeiss，型号：LSM700）由Zen 2012操作，并配有物镜（Plan-Apochromato × 63 / 1.4 NA油浸），孵育室，温度模块S和CO 2模块S。
软件
基于ImageJ的斐济语（1.52p版）（https://imagej.net/Fiji）（Schindelin等人，2012 ）
FRET和共定位分析仪
（https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fret-analyzer/fret-analyzer.htm）（Hachet-哈斯等人。，2006 ）
程序
对于此协议中，我们使用人P-gp的FRET探针小号（二俣等人，2020 ）。带有荧光蛋白标签的P-gps的示意图如图1所示。人P-gp FRET探针可从通讯作者上田一和（ueda.kazumitsu.7w@kyoto-u.ac.jp）获得。
图1.荧光蛋白标记的P-gps的示意图。我们生成了一个FRET构建体，即人P-gp-FRET，其中在NBD1之后插入了mCerulean（供体），在NBD2之后融合了mVenus（受体）。预测另一种FRET构建体P-gp-VsCn，其中mVenus和mCerulean在NBD2之后串联融合，尽管其构象仍显示出高水平的FRET。构建了在NBD1之后插入mCerulean的P-gp–mCerulean和在NBD2之后融合mVenus的P-gp–mCerulean作为阴性对照。TMD，跨膜结构域。NBD，核苷酸结合结构域，aa，氨基酸。
注意：HEK293细胞在37 °C，5％CO 2下的100 mm细胞培养皿中保存在补充有10％FBS（10％FBS-DMEM）的DMEM中。为了进行培养，使用了CO 2培养箱。
完整细胞
荧光蛋白标记的P-gps的瞬时表达
天1个添加100μ升PLL溶液至35毫米的玻璃基盘，孵育在室温下30分钟。
注意：PLL溶液用于促进细胞粘附在培养皿上。
用1.5 ml 1 × PBS（-）洗涤两次。
准备在100 mm细胞培养皿中培养的H EK293细胞，并弃去培养基。
用1.5 ml 1 × PBS（-）洗涤两次
添加1米升0.05％EDTA-T rypsin和孵育2分钟，在37℃，5％CO下2 。
加入9 ml 10％FBS-DMEM，然后转移到15 ml管中。
在室温下以1100 × g离心2分钟。
弃去上清液并加入10 ml 10％FBS-DMEM。
按照制造商的协议使用CellDrop计数细胞数。
将细胞稀释至1.5 × 10 5细胞/ ml 。
将HEK293细胞以3.0 × 10 5个细胞/孔接种到玻璃皿中，并在5％CO 2下于37°C孵育24小时。
第2天准备DNA-脂质复合物。
注意：最小质粒DNA集是P-gp-FRET，两个阴性对照（P-gp-mCerulean和P-gp-mVenus）和一个阳性对照（P-gp-VsCn）。
拌2.5微克质粒DNA和2.5μ升PLUS试剂在500μ升的Opti-MEM和与混合涡流混合器。
在室温下孵育5分钟。
添加6.25 μ升脂质体LTX并用旋涡混合器混合。
在室温下孵育30分钟。
替换500的介质μ升DNA-脂质复合物和1.5M升在10％FBS-DMEM 23小时，孵育37℃，5％CO 2 。
图像采集
第3天用2 ml的FluoroBrite DMEM洗涤两次。
将培养基替换为添加了10％FBS，1 mM丙酮酸钠和1 × GlutaMAX的1 m l FluoroBrite DMEM，并孵育1 h。
将培养皿转移到配备有显微镜的培养箱中。
转移50 0 μ升米edium到1.5米升管中并用2混合μ升维拉帕米氯碱IDE储备溶液（最终100μM）。
ñ OTE小号：
不要将维拉帕米氯化物原液直接添加到玻璃皿中，因为可以通过移液将HEK293细胞剥离。
维拉帕米是P-gp底物。
将培养基放回玻璃皿中，再孵育5分钟。
根据以下参数获取mVenus，mCerulean和FRET信号的图像，并保存为.lsm或.czi格式。
mVenus是在488nm处激发，在荧光发射使用带通收集过滤器（521 - 600纳米）（图2）。mCerulean在445 nm处激发，并使用短通滤光片（490 nm）收集荧光发射。对于FRET信号图像时，激光被设置为445 nm，并且敏化发射使用带通滤波器（521收集- 600纳米）（图3）。
注意：所有四个质粒的每个通道的代表性原始图像如图4所示。
图2.用于mVenus成像的Zen软件设置
图3.用于mCerulean成像和FRET信号成像的Zen软件设置
图4.所有四个质粒每个通道的代表性原始图像。比例尺= 10μm。
半完整细胞
注意：膜通透性适合控制小分子（如核苷酸）的浓度。
荧光蛋白标记的P-gp构建体的瞬时表达。
天1个种子的HEK293细胞作为描述在步骤d小号A1A-A1K 。
第2天如下制备DNA-脂质复合物。
注意：进行膜通透时，请勿使用Lipofectamine LTX，因为它会抑制SLO形成孔。
混合2微克质粒DNA和98μ升的Opti-MEM中为1.5米的升管中，用涡旋混合器混合。
混合10 μ升1毫克/米升PEI-MAX和90 μ升的Opti-MEM中另外的1.5米升管中，用涡旋混合器混合。
混合DNA和PEI-MAX，并与涡旋混合器混合。
在室温下孵育30分钟。
替换200的介质μ升DNA-PEI复合物和1.8米升在10％FBS-DMEM 24小时，孵育37℃，5％CO下2 。
膜通透性和图像采集
注意：我们建议一次使用一个或两个样本执行此步骤，以避免细胞长时间渗透。
第3天用2 ml冰冷的1 × PBS（-）洗涤。
添加1米升含有50ng /无血清DMEM μ升SLO并孵育在冰上5分钟。
注意小号：
在使用前稀释e SLO。
SLO是形成25个链球菌毒素-质膜，其允许离子和小分子的自由通道内30nm的水性孔。
用2 ml冰冷的1 × PBS（-）洗涤3次。
加入1米升1 ×转运缓冲液在37预热℃，补充有2mM的MgCl 2 ，5毫摩尔ATP二钠盐，和2微克/立方米升DAPI。为ATP耗竭，添加1 ×转运缓冲液补充有2mM的MgCl 2 ，2微克/立方米升DAPI，和10mM的NaN 3 。
在5％CO 2下于37°C孵育10分钟。
用预加热至37°C的2 ml 1 ×运输缓冲液洗涤两次。
添加1米升预加热1 ×补充有2mM的MgCl转运缓冲液2 ，5毫摩尔ATP二钠盐，和100 μM维拉帕米酰氯。
将培养皿转移至配备有显微镜的培养箱中，并在5％CO 2下于37°C孵育5分钟。
根据在步骤A2f中描述的参数，获取DAPI阳性细胞的mVenus，mCerulean和FRET信号的图像。
数据分析
使用公式1计算FRET效率（接近率）。
（式1），
其中是FRET信号或致敏发射受体供体激发（激发445纳米/发射期间521 - 600 nm）时，被供体时的供体荧光激发（激发445纳米/发射490纳米），并且是在受体荧光受体激发（激发488纳米/发射521 - 600纳米）。和分别是受体和供体的渗漏。
质膜的分割和邻近比的计算：
用ImageJ打开.lsm或.czi格式的图像，然后转换为.tiff格式。
将图像分割到每个通道（图像菜单>颜色>分割通道）。
使用“ FRET和共定位分析仪”分别计算表达P-gp-mCerulean和P-gp-mVenus的图像的供体和受体渗出。
从https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fret-analyzer/fret-analyzer.htm下载“ FRET和Colocalization分析器”到plugins文件夹。
重新启动ImageJ以将“ Fret Analyzer”命令添加到“插件”菜单。
从“插件”菜单中打开“ FRET分析器”。
对于供体渗出评估，请输入对照数量（最多10个对照）。
选择第一个控件的施主通道图像和FRET信号图像。
点击“获取”按钮。
对所有控件执行（c）和（d），并获取供体渗漏的平均值。
计算供体渗漏的方式与供体渗漏的方式相同。
如有必要，裁剪图像，以便仅可见单个单元格。
将mCerulean，mVenus，FRET信号的图像保存到单独的文件夹中。
从FRET信号图像中减去供体和受体的渗漏，并创建校正后的FRET（cFRET）图像。该过程由下面描述的自制ImageJ宏自动执行。
注意小号：
若要使用下面的ImageJ宏，请将宏文本以.txt格式保存在ImageJ目录的Macro子文件夹中。安装宏（插件>宏>安装）。运行宏（插件>宏>宏名称）。
在执行此ImageJ宏之前，请取消选中“转换时缩放”（“编辑”菜单>“选项”>“转换...”）。
setBatchMode（true）; //批量模式开启
// setBatchMode（false）; //关闭批处理模式
dir1 = getDirectory（“选择mCerulean文件夹”）;
//选择保存mCerulean图像的文件夹
dir2 = getDirectory（“选择mVenus文件夹”）;
//选择保存mVenus图像的文件夹
dir3 = getDirectory（“选择FRET信号文件夹”）;
//选择保存FRET图像的文件夹
dir4 = getDirectory（“选择cFRET文件夹”）;
//选择要保存cFRET图像的文件夹
list1 = getFileList（dir1）;
list2 = getFileList（dir2）;
list3 = getFileList（dir3）;
A = getNumber（“输入施主BT”，0）;
B = getNumber（“输入接受者BT”，0）;
对于（i = 0; i 调整>自动局部阈值>方法“全部尝试”） ***
run（“ Options ...”，“ iterations = 1 count = 3 black do = Open”）;
//通过“打开（腐蚀后稀释）”使质膜光滑
run（“ Analyze Particles ...”，“ size = 1-100 pixel include add”）；
setForegroundColor（0,0,0）;
roiManager（“ deselect”）;
roiManager（“ Fill”）;
//删除小于100像素的对象
setOption（“ BlackBackground”，true）;
run（“ Erode”）;
roiManager（“ Delete”）;
运行（“分析粒子...”，“大小= 50-无穷大像素圆度= 0.00-0.3添加”）；
//选择尺寸大于50像素且圆度小于0.3的对象
run（“全选”）;
//选择所有投资回报率
roiManager（“ Combine”）;
//合并所有ROI
setBackgroundColor（0，0，0）;
运行（“清除外部”）；
//在mVenus图片中的ROI外部删除
Save_name = dir5 +“ mem_” + Ori_name;
saveAs（“ Tiff”，Save_name）;
关闭（）;
selectImage（1）;
setOption（“ Show All”，true）;
roiManager（“ Measure”）;
Save_name = dir4 +“ ROI_” + Ori_name +“ .zip”;
roiManager（“ Save”，Save_name）; //保存ROI信息
关闭（）;
roiManager（“ Delete”）;
}
list4 = getFileList（dir4）;
//从mCerulean和cFRET图像评估接近率
对于（i = 0; i 0）{
setSlice（2）;
val2 = getPixel（ii，iii）;
比率= val2 / val;
//计算接近率（cFRET图像的像素值/ mCerulean图像的像素值）
和+ =比率;
计数+ = 1;
setSlice（3）;
ratiop =比率* 100;
setPixel（ii，iii，ratiop）;
setSlice（1）;
}
}
}
updateDisplay（）;
Save_name = dir6 +“ ratio_” + Ori_name;
saveAs（“ Tiff”，Save_name）;
ratiom =总和/计数；
//将总接近率除以计数的像素数
ar = newArray（sum，count，ratiom）;
Array.print（ar）;
//在Log窗口中显示接近率的总和，质膜的像素数以及接近率的平均值
总和= 0;
计数= 0;
run（“全部关闭”）;
roiManager（“ Delete”）;
}
菜谱
PLL解决方案
0.01％PLL解决方案1 m l
1 × PBS（ - ）29米升
储存在4 °C
10 × PBS（-）
注意：（-）表示不含镁或钙。
氯化钠80克
Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 29克
氯化钾2克
KH 2 PO 4 2克
用milliQ填充至1L。室温保存
1 × PBS（-）
10 × PBS（ - ）百米升
MilliQ 900百万升
高压灭菌
储存在4 °C
10 ×传输缓冲区
1 M Hepes-KOH（pH 7.4）125 m l
CH 3煮饭56.44克
氯化镁2 · 6H 2 O 2.54 g
用MilliQ填充至500 m l ，并用0.22μm过滤器灭菌
存放在室温下。
1 ×传输缓冲区
10 ×传输缓冲区100 m l
MilliQ 900百万升
储存在4 °C
0.05％胰蛋白酶-EDTA
0.5％胰蛋白酶-EDTA（10 × ）10 m l
1 × PBS（ - ）90米升
储存在4°C
100 mM ATP储备液
ATP二钠盐551.1毫克
用MilliQ填充多达1000万升
用NaOH将pH调节至7
用0.22μm过滤器灭菌
储存在-30 °C
50 mM维拉帕米原液
注意：使用前请做好准备。
维拉帕米氯化物24.6毫克
DMSO 1米升
用0.22μm过滤器灭菌
储存在-30 °C
1 mg / m l DAPI储备溶液
DAPI 1毫克
DMSO 1米升
用0.22μm过滤器灭菌
储存在-30 °C
100 mM NaN 3储备溶液
NaN 3 6.501毫克
的MilliQ 1米升
用0.22μm过滤器灭菌
储存在-30 °C
1 M MgCl 2储备溶液
MgCl 2 ·6H 2 O 20.33 g
用MilliQ填充多达1亿升
高压灭菌
储存在4 °C
1 mg / m l PEI-最大
PEI-MAX 10毫克
1 × PBS（ - ）10米升
用0.22μm过滤器灭菌
储存在4 °C
致谢
这项工作得到了JSPS KAKENHI资助号18H05269的支持。
利益争夺
作者宣称没有任何竞争性的经济利益。
参考
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