第一部分：B流式细胞术与细菌黏蛋白结合

材料和试剂

1.嗜肺军团菌Brenner等。（1979 ）（ATCC ® BAA-74 TM ）

WT 130b从ATC C购买（见上文）
如先前报道的ChiA突变体（DebRoy et al。，2006）
如先前报道，GFP质粒（pMGFP）衍生自pMMB-GRN / pMMB-Gent（addgene 45475）。GFP是由Ptac启动子表达的，因此需要IPTG（White和Cianciotto ，2016）（Sturgill-Koszycki和Swanson ，200 0）。虽然军团菌中的拷贝数未知，但PMMB-Gent源自PMMB67EH（ATCC 37622）
2. 1 ×磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Corning，目录号：21-040-CM）

3. IPTG（Sigma-Aldrich，目录号：I6758）

4. II型猪胃粘蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：M1778）

5. III型猪胃粘蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：M2378）

6. Texas带红色标签的WGA（ThermoFisher Scientific，目录号：W21405）

7.碳酸钠Na 2 CO 3 （西格玛奥德里奇，目录号：S7795）

8.碳酸氢钠NaHCO 3 （西格玛奥德里奇，目录编号：S5761）

9.缓冲木炭酵母提取物（BCYE）琼脂板（请参见食谱）

ACES（Sigma- Aldrich，目录号：A9758）
KOH（Sigma-Aldrich，目录号：221473）
酵母提取物（西格玛奥德里奇，目录号：Y1625）
α-酮戊二酸钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：K1875 ）
活性炭（西格玛奥德里奇，目录号：C9157）
细菌琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A5306）
L-半胱氨酸HCl（Sigma-Aldrich，目录号：C1276）
焦磷酸铁（Sigma-Aldrich，目录号：P6526）
10. 50 mM Carb / Bicarb缓冲液（请参阅食谱）

11.粘蛋白溶液（请参阅食谱）

设备

使用蓝色激光（488 nm），长通滤光片600和505，带通滤光片600-620的流式细胞仪（https://www.bdbiosciences.com/zh-cn/go-campaign/lsr-ii-comp-cont）和500-550 （BD Biosciences，型号：LSR II ）
通用紫外/可见分光光度计（贝克曼库尔特，型号：DU720）
强制空气微生物培养箱（VWR，目录号：89511-430）

软件

适用于Mac的GraphPad Prism版本8.0.0 （GraphPad软件，美国加利福尼亚圣迭戈，www.graphpad.com）
适用于Mac的FlowJo TM软件，版本8.8.6 。（俄勒冈州阿什兰：Becton，Dickinson and Company ，www.flowjo.com）

程序

Lpn制备
将都带有GFP表达质粒的Lpn菌株130b和ChiA突变体NU319划线到BCYE琼脂平板上，该平板含有1 mM的IPTG。
在37℃下孵育平板3天 °C孵化器可以长出细菌的草坪。
重悬〜3个拭子刮下细菌分成5米升的PBS，并且使用分光光度计DU720读取在660nm处的每个悬浮液的光密度（OD）。使用PBS稀释细菌悬液至OD为0.3，对应于大约 1 × 10 9 CFU /毫升。

粘蛋白制备
根据以下配方，在carb / bicarb缓冲液中准备II型和III型猪胃粘蛋白溶液。

粘蛋白/ Lpn孵育
在25 °C或37 °C的培养箱中，将1 ml的Lpn悬液与100μl的II型猪胃粘蛋白，III型猪胃粘蛋白或PBS静态孵育1小时。一式三份重复每个条件。
注意：保留等分的II型和III型猪胃粘蛋白溶液（无细菌）作为流式细胞仪分析的对照。

离心机，在室温下，5分钟的混合物在4 ，000 ×克（对于37 ℃下的样品）或8 ，000 ×克（对于25 ℃下的样品）。
用1毫升PBS洗涤每个沉淀
重复离心和洗涤步骤（小号TEP小号Ç 2和C ^ 3）三次。
将沉淀重悬于1 ml含7.5的PBS中 μg带有TexasRed标签的WGA，在25 °C静态孵育15分钟。
重复三次离心和洗涤步骤（步骤C2和C3 ）。
将沉淀重悬于500 µl PBS中。

流式细胞仪
我们è BD LSRII流式细胞仪来分析悬液通过一个TexasRed过滤器（蓝色激光- 488纳米：长通600，带通滤波器600-620）和GFP过滤器（蓝色激光- 488纳米：长通505，带通滤波器500-550）。

仅使用粘蛋白和仅细菌设置门控TexasRed和GFP参数。
至少收集500,000个事件。

数据分析

该实验至少重复3次，每个实验有3个技术重复。使用FlowJo软件分析粘蛋白与Lpn的结合百分比。使用能够表达GFP和分离的粘蛋白的细菌为TexasRed和GFP阴性群体（未标记的粘蛋白，且无IPTG依赖的GFP表达）以及TexasRed和GFP阳性群体（TexasRed标记的粘蛋白和IPTG-）设置阈值诱导的GFP表达）。设置了这些阈值（左侧的四个直方图，请参见下文）后，单个GFP阳性（象限[Q] 3），单个TexasRed-使用FloJo象限工具计算阳性（Q1），双GFP和TexasRed阳性（Q2）。因此，Q2被用作粘蛋白与细菌结合的百分比的计算。由于实验日之间平均荧光的差异，将数据标准化为单独用TexasRed荧光团孵育的GFP-Lpn（背景），请参见下面的样品数据表和图4D （Rehman等，2020 ）。使用GraphPad Prism8统计软件对细菌与粘蛋白的结合百分比进行绘图和分析。Prism8分析量化了标准偏差，并使用了两尾学生t检验函数来检验测试组之间的显着差异。仅小于0.05的P值被确定为显着。

流式细胞仪协议（图1）

图1 。流式细胞术。使用单阳性样品设置阈值。1. IPTG在Lpn中诱导GFP产生（左上方直方图），以及2.具有TexasRed标记粘蛋白的非GFP细菌（顶部中部直方图）。使用1.设置无IPTG的细菌（左下直方图）。2.带有未标记粘蛋白的非GFP细菌（下中直方图）。为了进行样品分析，将IPTG诱导的，表达GFP的细菌与TexasRed标记的粘蛋白共孵育。门控参数用于设置用于分析的象限百分位。使用FloJo工具将收集的所有事件划分为四个象限。将仅德克萨斯红阳性的总人口的百分比标记为Q1，将双GFP和将德克萨斯红细菌的种群标记为Q2，将单个GFP阳性群体标记为Q3，将所有非荧光的阴性群体标记为Q4。GFP和TexasRed双阳性（Q2）的人口百分比用作黏蛋白与细菌结合的指标，并在下面的样本表中进行了分析（表1）。

样品沓TA （表1）

表1 。对德克萨斯红粘蛋白和GFP- Lpn （Q2）双阳性的人口百分比用作粘蛋白与细菌结合的值。在上述所示的流程情节WT行为单例如，该值是85％（最右边的曲线图图URE 1）。该值加上从另外两个测试WT细菌的独立重复获得的值添加到左侧前三列的第三行，即标题Rep1，Rep2，Rep3下。通过对另一种细菌样品的分析获得的三个技术重复样品的原始值；即ChiA突变体出现在第4行的最左侧的三个泳道中。然后将每个重复样本的值标准化为单独与TexasRed一起孵育的GFP细菌（WT或突变体）（如第1和2行所述），以量化背景TexasRed荧光团与细菌的结合。对于用粘蛋白孵育的两个细菌样品，这些值出现在第3行和第4行的第5、6和7列中。最后，对标准化值进行平均，并计算标准差，如最后两列所示。在此样本数据集中，22.5 + 5.4％的WT细菌显着结合了粘蛋白。

菜谱

BCYE琼脂板
将10克ACES加入约900毫升双蒸馏水中。搅拌入溶液
加入〜2.2 g KOH。搅拌入溶液
加入10克酵母提取物和1克α-酮戊二酸。搅拌入溶液
调整的pH值的肉汤6.85-6.95。使用浓缩HC升或10 -KOH作为必需的。加双倍蒸馏水至1升
将肉汤分配到2升烧瓶中
加入1.5克活性炭和15克琼脂
在121 °C下高压灭菌20分钟
制备半胱氨酸和IR分别通过添加0.4克L-半胱氨酸HC对溶液升至10ml双蒸水和0.25g的焦磷酸铁至10ml双蒸水。一旦每个溶液制成，消毒用溶液滤波器（0 0.22微米）。
高压灭菌后，在水浴中将培养基冷却至50 °C
分别添加10米升过滤灭菌的（0 0.22微米）半胱氨酸和10米升过滤灭菌的（0 0.22微米）焦磷酸铁到介质
如果用IPTG使板，添加1米升1个的灭菌微米的过滤器（0 0.22微米）IPTG
冷却至40 °C
凝固后将板倒入并储存在4 °C下
50 mM Carb / Bicarb缓冲液
将1.59 g Na 2 CO 3和2.93 g NaHCO 3溶解在1 L去离子水中
使用HCl或NaOH将pH调节至9.6
粘蛋白溶液
搅拌30分钟，以将10 mg II型或III型猪胃粘蛋白溶解在100 ml的上述50 mM Carb / Bicarb缓冲液中。在135 °C下高压灭菌15分钟以灭菌并进一步溶解粘蛋白*。

*注意：粘蛋白很难溶解，仅靠混合不能完全溶解。因此，需要高压灭菌以获得均匀的解决方案。建议为每个实验新鲜制备粘蛋白。

第二部分：[R ecombinant蛋白粘蛋白与ELISA的结合

材料和试剂

Immulon 2-HB 96孔板（VWR，目录号：735-0464 ）
纯化的N端带有His标签的蛋白质样品
抗His HRP偶联抗体（Sigma-Aldrich，目录号：SAB4301134 ）
来自II型猪胃的粘蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：M2378 ）
来自III型猪胃的粘蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：M1778）
碳酸钠Na 2 CO 3 （Sigma-Aldrich，目录号：S7795）
碳酸氢钠NaHCO 3 （Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
牛血清白蛋白（BSA）（Melford，目录号：A30075）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Fisher Scientific，目录号BP399-1）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
氯化锌ZnCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：229997）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
邻苯二胺二盐酸盐片（OPD）（Sigma-Aldrich，目录号：P9187）
蛇皮®透析管（Thermo Scientific的，目录号：68100 ）
孵育缓冲液（请参阅食谱）
50 mM Carb / Bicarb缓冲液（请参阅食谱）
粘蛋白溶液（请参阅食谱）
阻塞缓冲区（请参见食谱）

设备

P后期读取器（LABSYSTEMS读者的iEMS MF ，：目录号5921200）使用450nm的过滤器
孵化器（New Brunswick Innova 4230）
离心机（Eppendorf ，型号：5810R）

软件

适用于Windows的Ascent Microplate Reader软件版本2.7.0
适用于Mac的Microsoft Excel版本16.43；尽管任何数据库分析软件都适用

程序

蛋白质制备
将样品蛋白质以100μM的浓度注入根据以下配方制备的孵育缓冲液中。将透析后的最终蛋白质浓度调整为10μM。

粘蛋白制剂
根据以下配方，在carb / bicarb缓冲液中准备II型和III型猪胃粘蛋白溶液。

孵化
将Immulon 2-HB 96孔板与50μlII型猪胃粘蛋白，III型猪胃粘蛋白或PBS在4°C的培养箱中静态孵育过夜。一式三份重复每个条件。
除去粘蛋白溶液和用200μl阻断缓冲液阻断的孔中，根据下面的配方，静态1 ħ在一个24 ℃的培养箱中。
除去封闭缓冲液，通过添加200μl孵育缓冲液并在长凳上静态孵育5分钟来洗涤一次。接下来，将孔在24°C的培养箱中与50μl纯化的蛋白质样品或PBS静态孵育3 h 。
如上所述，用200μl孵育缓冲液洗涤，并重复进行总共4个洗涤步骤。

侦查
2：删除缓冲器，并用50微升抗His-HRP抗体，稀释1的孵育的孔，在培养缓冲液000，静态1个小时在24℃下孵化。
如上所述用200μl孵育缓冲液洗涤四次。
向每个孔中加入150μl邻苯二甲胺二盐酸盐，然后将板置于24°C的培养箱中，在黑暗中不摇动30分钟。
使用酶标仪在450 nm处记录。

数据一nalysis

该实验至少重复3次，每个实验有3个技术重复。数据将导入到Microsoft Excel软件中，并通过与PBS单独的样品一起孵育来校正基线。下面给出了ChiA，NttE（阴性对照）和SslE（阳性对照）与II型猪胃粘蛋白结合的样品数据（另请参见图4C ，Rehman等，2020）。Excel分析提供标准偏差值，并使用两尾学生t检验函数来检验测试组之间的显着差异。仅小于0.05的P值被确定为显着。

样本数据（表1）

表1.与II型胃粘蛋白提取物的蛋白结合的示例数据

菜谱

孵育缓冲液（准备新鲜并在4 ° C下储存）
每1 L PBS缓冲液混合/溶解0.5 g BSA和0.5 ml Tween - 20
冷却至4 °C
50 mM Carb / Bicarb缓冲液（可预先制备并在室温下保存）
将1.59 g Na 2 CO 3和2.93 g NaHCO 3溶解在1 L去离子水中
使用HCl或NaOH将pH调节至9.6
粘蛋白溶液（可以在前一天制备并在4 °C下保存）
搅拌30分钟以将10 mg II型或III型猪胃粘蛋白溶解在100 ml的上述50 mM Carb / Bicarb缓冲液中。
在135 °C下高压灭菌15分钟以灭菌并进一步溶解粘蛋白*。
*注意：粘蛋白很难溶解，仅靠混合不能完全溶解。因此，需要高压灭菌以获得均匀的溶液。

封闭缓冲液（可在前一天制备并保存在4 °C ）
每1 L PBS缓冲液混合/溶解0.1 g BSA和0.5 ml Tween - 20
冷却至4 °C

致谢

Cianciotto实验室的工作得到了美国国立卫生研究院拨款R01AI 043987的支持。LSG和RCW也分别得到了美国国立卫生研究院培训补助金T32 GM08061和T32 AI0007476的部分支持。我们感谢西北免疫生物学流式细胞仪核心设备的维护和使用。Garnett实验室的工作得到了MRC赠款MR / M009920 / 1和MR / R017662 / 1的支持。

利益争夺

NPC和JAG拥有待决的专利申请（63 / 005,592），其中描述了ChiA在治疗应用中的用途。

伦理

此协议中未使用任何人类或动物受试者。

参考

Bhavanandan，副总裁和Katlic，AW（1979）。小麦胚芽凝集素与唾液糖蛋白的相互作用。唾液酸的作用。生物化学杂志254（10）：4000-4008。
Brenner，DJ，Steigerwalt，AG和McDade，JE（1979）。军团菌病细菌的分类：军团菌，肺炎军团菌，军团菌科新星种，家族新星。实习生医学90（4）：656-658。
DebRoy，S.，Dao，J.，Soderberg，M.，Rossier，O.和Cianciotto，NP（2006）。II型肺炎军团菌分泌基因组显示独特的外蛋白和几丁质酶，可促进细菌在肺部的持久性。美国国家科学院院刊103（50）：19146-19151。
法夫，DJ，布鲁恩，DF，米勒，堪萨斯州和斯托纳，DL（2000年）。对某些嗜酸性采矿细菌的基于荧光凝集素的染色技术的评估。应用环境微生物学66（5）：2208-2210。
Hubber，A. and Roy，CR（2010）。IV型嗜肺军团菌效应子对宿主细胞功能的调节。Annu Rev Cell Dev Biol 26：261-283。
模型，硕士，里斯，JL和弗雷泽，GC（2009年）。用荧光显微镜测量小麦胚芽凝集素的结合。细胞计数法A 75（10）：874-881。
Naughton，J.，Duggan，G.，Bourke，B.和Clyne，M.（2014年）。微生物与粘液和粘蛋白的相互作用：最新进展。肠道微生物5（1）：48-52。
Rehman，S.，Grigoryeva，LS，Richardson，KH，Corsini，P.，White，RC，Shaw，R.，Portlock，TJ，Dorgan，B.，Zanjani，ZS，Fornili，A.，Cianciotto，NP和Garnett ，JA（2020）。嗜肺军团菌几丁质酶ChiA的结构和功能分析揭示了金属依赖性粘蛋白降解的新机制。PLoS Pathog 16（5）：e1008342。
Rondelet，A.和Condemine，G.（2013年）。II型分泌物：不会消失的底物。Res Microbiol 164（6）：556-561。
Sturgill-Koszycki，S.和Swanson，MS（2000）。嗜肺军团菌复制液泡成熟成酸性内吞细胞器。实验医学杂志192（9）：1261-1272。
Valdizan，MC，Julian，J.和Carson，DD（1992）。WGA结合的粘蛋白糖蛋白可保护小鼠子宫上皮细胞的顶端细胞表面。J细胞生理学151（3）：451-465。
White，RC和Cianciotto，NP（2019）。在医学上重要的一个大类中评估II型分泌的影响，基因组学和进化：军团菌II型分泌范例。微型B GENOM 5（6）：e000273。
White，RC和Cianciotto，NP（2016）。II型分泌对于含军团菌的液泡与巨噬细胞Rab1B的最佳结合是必需的，但主要通过Rab1B独立机制增强细胞内复制。感染免疫84（12）：3313-3327。