材料和试剂

1. ITO Ç oated Ç过小号唇，22 × 22毫米，吨hickness＃1，70-100欧姆- [R esistivity （SPI小号upplies ，目录号：06470-AB ）

2.银线（Alfa Aesar ，目录号：11468-G9 ）

3.铂金线（Alfa Aesar ，目录号：10958-CB）

4.可重复使用的小号ilicone阱（SARSTEDT，flexiPERM ® ，目录号：94.6032.039）

5.链霉亲和素（VWR，目录号：97062-810 ）

6. （3-缩水甘油基羟丙基）三甲氧基硅烷（Sigma-Aldrich，目录号：440167）

7.牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：05470）

8.山羊IgG（MW = 150 kDa ）（Abcam ，目录号：ab76907）

9.兔抗山羊IgG（MW = 150 kDa ）（Invitrogen，目录号：A16138）

10.生物素-PEG10k-NHS （N anocs ，目录号：PG2-BNNS-10k）

11.聚苯乙烯（PS）的纳米颗粒，d的iameters 50，100，150和200纳米（邦斯实验室，目录号：PS2002，PS2 004，PS2006，PS2008和）

12. （可选）叠氮化钠纯化试剂盒（Nanopartz ，目录号：PPZ-KIT-10-MAG）

13. 1 ×磷酸盐缓冲盐水（Corning，目录号：21-040-CV）

14. A型浸油（Cargille ，目录号：16482）

15.异丙醇（Sigma-Aldrich，目录号：109827）

16.丙酮（VWR，BDH ® ，BDH2002）

17.乙醇（Koptec的纯乙醇200证明，去污实验室，目录号：V1001）

18.氢氧化铵（Mallinckrodt Chemicals，目录号：3256）

19.过氧化氢（VWR，目录号：BDH7814-3）

20. H 2 O 2 / NH 3 ·H 2 O / H 2 O（1：3：5）混合物（请参阅食谱）

21. 0.1 mg / ml BSA封闭溶液（请参阅食谱）

22. 100倍稀释的PBS缓冲液（请参阅食谱）

设备

倒置光学显微镜（奥林巴斯，型号：IX-81）
60 × NA 1.49油浸TIRF物镜（奥林巴斯，型号：APON60XOTIRF ）
防震光学平台（Newport，型号：RS2000）
XYZ平移台（Thorlabs ，型号：PT3）
超发光发光二极管（SLED）（Superlum ，型号：SLD-260-HP-TOW-PD-670）
SLED电流d河（Superlum ，型号：PILOT4-AC）
CMOS相机（滨松，型号：ORCA-Flash 4.0）
函数发生器（Agilent，型号：33521A）
恒电位仪（Pine仪器公司，型号：AFCBP1）
USB数据采集卡（National Instruments，型号：NI USB-6251）
V acuum泵（TOPSFLO，型号：TM30A-B6-P9504（V6004））
塑料管，0.02 ” ID × 0.06 ” OD （圣戈班，TYGON ® ，型号：AAD04103）
带Luer-Lok TM尖端的注射器，20 m l （Fisher Scientific，目录号：22-124-967 ）
灌注歧管，4至1个端口（Warner Instruments，型号：MM-4）
注射器1通旋塞阀（B.Braun Medical Inc.，目录号：455980）
点胶针头（Weller，目录号：KDS2312P ）
盖上玻璃染色罐（Fisher Scientific，目录号：02-912-636 ）
超声波Ç精简（Fisher Scientific公司，型号：FS20D）
镊子（电子显微镜科学，目录号：72750-D）
计算机（处理器：Intel Xeon E-2274G; RAM：64 GB;硬盘：Samsung SSD 970 PRO 1TB）

软件

HCImage Live（滨松）
MATLAB （MathWorks ）
斐济（https://imagej.net/Fiji）
Origin 2019（OriginLab）
Office 365（微软）

程序

ITO表面的清洁和硅烷化
将ITO芯片放入染色罐中，然后依次在丙酮，乙醇和去离子水中分别超声处理20分钟，以去除表面污染物。
在另一个装有H 2 O 2 / NH 3 ·H 2 O / H 2 O（1：3：5）混合物的广口瓶中，将干净的ITO芯片在室温下孵育1小时，以增加OH的表面密度。
用去离子水冲洗ITO芯片，然后用N 2冲洗y y 。
用异丙醇中的1％（3-环氧丙氧基丙基）三甲氧基硅烷填充预干燥的染色罐，将干燥的ITO芯片放入罐中，并在室温下孵育过夜，以使带有末端环氧基的芯片功能化（图2A和2 B）。
用异丙醇和水冲洗ITO芯片，每次3次，然后用N 2干燥。安装一个小号ilicone在阱的ITO的侧制造蛋白质振荡器之前芯片。

Prepar的通货膨胀蛋白-PEG复合
稀释用PBS蛋白以达到一个最终的浓度100 nM的与100的体积μ升。
注意：蛋白质样品中不应含有任何NHS反应性添加剂，例如BSA和叠氮化物。如果叠氮化-free蛋白质样品是不可用的，钠叠氮化物纯化试剂盒可用于去除叠氮化物（例如：Nanopartz ，目录号：PPZ-KIT-10-MAG）。

制备10 nM的NHS-PEG10k生物素在10 0 μ升PBS。
注意：NHS在水中会快速降解，请始终使用新鲜溶液进行反应。

混合100 μ升蛋白溶液和100 μ升NHS-PEG10k-生物素溶液并在4孵育混合物℃过夜（图2D- 2 E）。
注意：蛋白质/ PEG的摩尔比为10/1，可以防止多个PEG分子连接至同一蛋白质分子。

蛋白质振荡器的组装
加入200 μ升0.1毫克/米升链霉（溶解在PBS中）至孔中的样品在ITO芯片和孵育2 ħ以允许链霉（图2C）的固定。
用PBS清洗芯片3次。
向ITO中添加0.1 mg / ml的BSA溶液，孵育20分钟以封闭非特异性结合位点。
用PBS清洗芯片3次。
加入200 μ升蛋白质-PEG复合物溶液到芯片和孵育2 ħ以允许PEG耦合到ITO表面（图2F）上的链霉亲和终端生物素。
慢慢除去100 μ升从井溶液，然后轻轻地添加400 μ升的100倍稀释的PBS到孔中。不要在溶液中产生快速流动，因为它可能会破坏拴系的蛋白质。
慢慢除去400 μ升从井中溶液。重复小号TEPS C6- Ç 7〜10倍，以减少游离的蛋白分子和未结合的蛋白-PEG复合物残留在溶液中的量。
注：表面应始终覆盖有至少100 μ升溶液，干燥的表面将导致拴系蛋白对表面的不可逆的粘附性。还请注意，移液时避免在表面上产生气泡。

图2.蛋白质振荡器的制造。交流电链霉亲和素在ITO表面的固定化。DF。蛋白质-PEG复合物和蛋白质振荡器的组装。

中号EAS uring蛋白振荡器的机电响应
将ITO芯片安装在显微镜上，并在物镜和芯片之间放半滴浸油。将相机曝光时间设置为1 ms 。设置相机帧速率到800个在2048 FPS × 256像素。关闭相机冷却风扇，以减少机械噪音。
将入射角停在全内反射角上方，所有入射光都会在此反射。通过调节SLED电流直至摄像机饱和（最大图像强度〜65,535），增加入射功率。
缓慢降低入射角直到略低于全内反射的角度，并且光的一半被反射到相机（图像强度〜30 ，000）。
设置电化学系统和重力样品输送系统，如图3A和3B所示。
仔细检查电极是否正确连接。小号园艺或开路会损坏ITO表面。
在表面上找到较大的杂质，并大致调整焦点，直到杂质的图案从抛物线形状（图3D）变为V形（图3C）。移动平台，找到没有杂质的干净区域（图4A）。

图3.用于测量蛋白质振荡的实验装置。A.显示整个设置的图片。B.放大样品台（A中的红色方块）。ITO芯片放置在物镜上。将自粘硅树脂孔粘贴到芯片上以固定溶液。ITO表面，Ag / AgCl导线和Pt线圈分别用作工作电极（WE），参比电极（RE）和对电极（CE）。样品入口可将样品引导至视野内的表面，以最大程度地减少扩散。出口管（连接到真空泵）固定在井的上边缘附近，并不断从井中去除多余的溶液。C.显示适当聚焦的大杂质（倒V形）的图像。D.图像显示出焦点不清晰的杂质（抛物线图案）。

在ITO表面施加80 Hz的6 V正弦波电势，并记录图像1 s （视频1）。

视频1.以800 fps录制1秒钟的图像序列。0 V至10 V之间的任何施加电势都只会对原始图像产生微小的变化，如果不进行图像处理就无法观察到这些变化。顶部的视频显示了相机记录的原始图像序列，底部的视频显示了通过从原始图像序列中的每个帧中减去第一帧而获得的差分图像（背景被移除）。视频中施加的电势为80 V（80 Hz）。传感器表面用IgG振荡器修饰。

使用自定义的MATLAB快速傅立叶变换（FFT）滤波器提取80 Hz的振荡信号。该程序可以在Ma等人的支持信息中找到。（2020年）。
检查FFT图像，以查看视野中是否有足够数量的蛋白质分子振荡，以及它们是否正确聚焦。如果蛋白质不足，请将载物台移至另一个区域。如果重点是不正确，稍微调整调焦旋钮和重复小号TEPS d 7 d 9。
以80 Hz的频率以1 V或2V的间隔施加0 V至10 V的正弦电位。每个电位以800 fps录制1 s视频。如果需要，使用数据采集卡同时记录施加的电势和电流。

以抗IgG和IgG振荡器为例来测量结合诱导的大小和电荷变化
添加2 0米升的100倍稀释的PBS缓冲液和2M升的130 nM的抗IgG中稀释100倍PBS缓冲液中，以样品递送系统（图3A）的两个不同的注射器。
打开缓冲通道流动缓冲在ITO表面上用IgG振荡器改性（流速为约300 μ升/分钟，如果阀被完全打开）。
甲PP LY在80赫兹到ITO（其充分伸展PEG）与9 V振幅的电位。开始记录图像，如果需要，使用数据采集卡记录电位和电流。
在使缓冲液流动20秒钟以建立基线后，请关闭缓冲液注射器并打开抗IgG通道以启动关联过程。流动抗IgG 30 s。
切换回缓冲液通道并流动缓冲液30秒，以进行解离测量。
对于电荷检测，请使用较低的电位来振荡蛋白质（约5 V），以使PEG不能完全伸展。不要施加高电位来完全拉伸PEG，因为电荷变化可以是正的或负的，这会增加或减小振荡幅度。

使用PS纳米颗粒进行尺寸校准
用PBS稀释每种PS纳米颗粒储备溶液（50、100、150、200纳米）1000倍。
添加300 μ升P BS到样品井安装在裸ITO表面上，然后注入50 μ升的稀释50纳米的纳米颗粒溶液中以使纳米颗粒结合到表面上。注入后，开始以400 fps（512 × 2048像素）的速度记录图像1分钟。
重复小号TEP ˚F 2来衡量其他尺寸。每次测量均使用新的ITO芯片。
请注意，最佳纳米颗粒浓度应导致每个图像约5个结合事件。颗粒浓度可能会有所不同，如果不合适，请调整浓度。

数据分析

绘制尺寸校准曲线
使用斐济软件ö btain差分图像序列示出了纳米颗粒通过减去来自每个帧中的第一帧的序列中结合（去除背景）（视频2）。
在粒子图像的中心（视频2中的红色方块）上选择10 × 10像素的感兴趣区域（ROI），然后计算每个ROI内的平均强度（I ）。

视频2.不同大小的纳米颗粒结合到表面。每个视频都是从原始视频中裁剪出来的，该视频显示了绑定到表面的单个粒子（50、100、150和200 nm）。为了更好地可视化，背景噪声通过使用在斐济软件的移动平均函数每11个相邻帧平均降低（选择“插件>斯托尔斯> Jay_Unruh >消除趋势工具>堆栈划分均线JRU V2”）。

对于每种尺寸（D ），测量约100个单独的纳米颗粒。
绘制log（I ）与log（D ）并找到曲线的斜率，该斜率应为2左右。

单一蛋白质分析–时间快速傅里叶变换
使用自定义MATLAB程序（过程D8中提到的同一程序），对在过程D（图4 A）中记录的图像序列执行快速傅里叶变换（FFT ）。
在FFT图像序列中使用第81个图像，该图像显示80 Hz的信号，用于单个蛋白质分析（图4 B）。

单一蛋白质分析–去除背景
对上面获得的时间FFT图像执行k空间FFT ，然后使用斐济（选择“处理> FFT> FFT”）将图像转换为k空间（图4 C）。
应用带阻滤波器（图4 D），该滤波器滤出低频背景图案，同时保留信号。使用矩形选择工具选择低频区域，然后使用“编辑>清除”删除所选区域。
使用“ Process> FFT> Inverse FFT”将图像转换回时域（图4 E）。

振荡幅度与施加电势的关系
在被束缚的蛋白质的亮点上选择ROI（10 × 10像素）（图4 F）。测量每个ROI的平均强度，然后减去背景强度（整个图像的平均强度）。

图4.图像处理。A.在步骤D中获得的原始图像序列。校准栏以灰度显示图像强度。B.通过对图像序列执行FFT获得的IgG分子的时间FFT图像。施加的电势：80 Hz时为8 V；FFT积分时间：1 s。C. ķ在颞FFT图像执行-space FFT。D.应用带状滤镜（黑色区域）以部分去除背景。E.去除背景后的图像。F.选择10 × 10像素的ROI用于单个蛋白质大小和电荷分析。

在不同的施加电势下，测量每种束缚蛋白的平均强度（扣除背景）。
绘制强度（y轴）与施加电势（x轴）的关系。强度首先随着施加的电势线性增加，并在高电势（通常> 6 V）时达到平稳状态，因为系链已完全拉伸（图5）。
使用以下公式将强度转换为以纳米为单位的振荡幅度：

[1]

其中，振荡振幅，I是蛋白质的e逝波散射强度，是z 0处的蛋白质振荡强度，d是van逝场的衰减常数。I是在63nm （PEG的长度）时从振荡平台状态确定的，并且是蛋白质的最大FFT图像强度。

单一蛋白质大小分析
使用强度与施加电势图（图5）找到每种蛋白质的值。确定我使用方程每种蛋白质[1] 。

图5.计算大小和费用。该图显示了振荡响应（强度）与单个IgG分子施加的电势的关系。在低电势下，振荡会随着电势以大致线性的方式增加，因为PEG被电场拉伸了。在高电位下，PEG被完全拉伸，并且振荡（强度）达到最大值。蛋白质的大小取决于平台的强度（），电荷的大小取决于PEG完全拉伸时的电势（U ）或电场。和U的位置在图中标出。

使用尺寸校准曲线将I转换为直径D app 。在此，D app是蛋白质-PEG复合物的有效直径。
计算蛋白质的直径使用，其中d PEG是PEG线圈的通过动态光散射测得的直径。根据我们的动态光散射测量，在100倍稀释的PBS中，PEG10k的D PEG约为4.5 nm 。

单一蛋白质电荷分析
发现潜在ù上的I ntensity与施加在振荡幅度达到平台期电位曲线图（图5）。
转换的可能性û电场Ë 0使用情商uation 。
注意：此关系是在我们的系统上确定的，考虑到系统差异，建议读者在进行实验之前对其进行校准。请参考Ma等。（2020年）了解详情。

确定充电q使用，其中ķ PEG是PEG系绳的熵弹簧常数。对于PEG10k ，。
确定所述移动性每种蛋白质的通过，在那里是溶液粘度。

菜谱

H 2 O 2 / NH 3 ·H 2 O / H 2 O（1：3：5）混合物
Ť ø使45毫升：

5毫升H 2 O 2

15毫升NH 3 ·H 2 O

25毫升去离子水

0.1 mg / ml BSA封闭液
向10 ml PBS缓冲液（pH 7.4 ）中加入1 mg BSA。

100倍稀释的PBS缓冲液
Ť ø使40毫升：

400微升PBS

39.6毫升H 2 O

致谢

感谢国家卫生研究院（R44GM126720）的财政支持。该协议基于我们在《自然通讯》（Ma等，2020）中发表的工作。

利益争夺

亚利桑那州董事局已代表亚利桑那州立大学基于该协议中描述的方法提交了美国专利申请（16 / 584,120），该方法已于2020年3月26日发布。

参考

Ma，G.，Wan，Z.，Yang，Y.，Zhang，P.，Wang，S. and Tao，N.（2020年）。单个蛋白质大小，电荷，迁移率和结合的光学成像。Nat Commun 11（1）：4768。
Ruggeri，F.，Zosel ，F.，Mutter，N.，Rozycka ，M.，Wojtas ，M.，Ozyhar ，A.，Schuler，B. and Krishnan，M.（2017）。单分子电泳。Nat Nanotechnol 12（5）：488-495。
Wang，Q.，Goldsmith，RH，Jiang，Y.，Bockenhauer ，SD和Moerner，W.（2012）。使用抗布朗电动（ABEL）阱探测溶液中的单个生物分子。Accounts Chem Res 45（11）：1955-1964。
Young，G.，Hundt ，N.，Cole，D.，Fineberg ，A.，Andrecka ，J.，Tyler，A.，Olerinyova ，A.，Ansari，A.，Marklund ，EG，Collier，MP，Chandler， SA，Tkachenko ，O.，Allen，J.，Crispin，M.，Billington ，N.，Takagi，Y.，Sellers，JR，Eichmann，C.，Selenko ，P.，Frey，L.，Riek ，R。，Galpin ，MR，Struwe ，WB，Benesch ，JLP和Kukura ，P.（2018）。单个生物大分子的定量质量成像。科学360（6387）：423-427。
Zhang，P.，Ma，G.，Dong，W.，Wan，Z.，Wang，S. and Tao，N.（2020年）。等离子散射成像的单个蛋白质和结合动力学。Nat Methods 17（10）：1010-1017。