材料和试剂

处理细菌
大方培养皿（500 cm 2 ）（Thermo Fisher Scientific ，目录号：R80115TS ）
纤维素过滤器膜（0.45微米孔径，默克）
Eppendorf管（Axygen ，目录号：MCT-150-C）
PCR管（Axygen ，目录号：PCR-02-A ）
康宁50毫升离心管（默克（Merck），目录号：CLS430828-500EA ）
96孔深孔板（Thermo Fisher Scientific ，目录号：A43075）
冷冻管（Thermo Fisher Scientific ，目录号：5000-1020 ）
野生型E. piscicida EIB202（山口- [R ）; “收件人”单元格
大肠杆菌SM10 λ PIR窝藏pMKGR用于经由接合（提供Tn的安培- [R ，公里- [R ）; “供体”细胞（参见注释1 ）
Luria-Bertani（米勒的LB汤底，Thermo Fisher Scientific ，目录号：12995027 ）和琼脂培养基（默克公司，目录号：05040 ）
Colistin（Col，20毫克/毫升，BBI）
氨苄西林（Amp，100 mg / ml，BBI）
庆大霉素（Gm，15 mg / ml，BBI）
甘油（Titan ，目录号：56-81-5 ）

热不对称交错PCR（TAIL-PCR）
Tiangen 2 × Taq PCR MasterMix （TIANGEN BIOTECH ，目录号：KT205-02）
无核酸酶的水H 2 O（QIAGEN ，目录号：129114）

基因组DNA（gDNA）纯化
0.5 ml单管（Thermo Fisher Scientific，目录号：AB0350）
Tiangen gDNA提取试剂盒（TIANGEN BIOTECH ，目录号：DP302-02）
100％乙醇（Titan，目录号：64-17-5 ）

图书馆建设
Qiagen凝胶纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28104）
VAHTS HiFi扩增混合液（Vazyme Biotech ，目录号：616-01 / 02）
琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，目录号：16500500）和电泳仪（BIO-RAD ，目录号：1704489EDU）
Qubit TM dsDNA HS检测试剂盒（Invitrogen ，目录号：Q32851）

寡核苷酸DNA （参见注释2 ）（HPLC纯化，BGI）
“ EIB202-F”：5'-TCATCGCACATACAGAATAAACGCC-3'
“ EIB202-R”：5'-CCGTAACATTTCTTACAACACTGCG-3'
“ pMKGR -F”：5'-AGGTGATGCTACATACGGAAAG-3'
“ pMKGR -R”：5'-AGCGCATGAACTCCTTGATG-3'
“ Tn-F”：5'-AAAAGTCCGCTGGCAAAG-3'
“ Tn-R”：5'-CCCTTCAAGAGCGATACAAC-3'
“ Sp1-F”：5'-GCTCCGTAGTAAGACATTCATCGCG-3'
“ Sp2-F”：5'-GCTTACGTTCTGCCCAAGTTTGAG-3'
“ ABS-R”：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'
“ AB2-R”：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNCTCT-3'
“ Seq2-F”：5'-CAATTCGTTCAAGCCGAGATCG-3'
“ AD_fork截短的NH2”：5'- TACCACGACCA-3'
“ AD_Index Fork R”：5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATGGTCGTGGT-3'
“ 1st_seq-out-psc189”：5'-ACTCTGGGGTACGCGTCTAG-3'
“ 1st_PCR_Index'R'引物”：5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTG-3'
“ P5间隔引物”：以下6个寡核苷酸的等摩尔混合物：
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGACTTATCAGCCAACCTGT-3'

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGACTTATCAGCCAACCTGT-3'

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATGACTTATCAGCCAACCTGT-3'

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGTCGACTTATCAGCCAACCTGT-3'

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCGACGACTTATCAGCCAACCTGT-3'

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCAGCGACGACTTATCAGCCAACCTGT-3'

“ P7条码引物”
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC（因样品而异）

Ë quipment

多通道移液器（Thermo Fisher Scientific）
高速离心机（Eppendorf ，型号：5415R）
热循环仪（E ASTWIN，型号：ETC811）
水浴（Thermo Fisher Scientific ，目录号：TSGP02 ）
高速离心机（Eppendorf ，型号：5415R）
浴超声仪（Diagenode ，目录号：B01020001）
热循环仪（E ASTWIN，目录号：ETC811）
VAHTS用于Illumina的通用端制备模块（Vazyme Biotech ，目录号：N203-01）
用于Illumina的VAHTS通用适配器连接模块（Vazyme Biotech ，目录号：N204-01）
Qubit TM 4荧光计（Invitrogen，目录号：Q33238）或等效的基于荧光的DNA定量设备

程序

家长图书馆建设
接种“供体”（在含Amp的LB肉汤中，100 μ克/ ml）和“受体”的细胞（在LB肉汤与山口，20 μ克/毫升），在37 ℃振荡和培养过夜。
准备不含抗生素的LB琼脂平板。让他们干井和地点0.45微米在板的顶部的膜过滤器（4层膜可以施加到每个板）（见注3 ）。
通道E. piscicida ，将2ml在50ml（4％）中，添加氯化钙2至50毫米（500 μ升，10 M），在30旋转200转°C，培养1 h 15分钟后OD 600将达到〜0.6-0.8（请参见注释4 ）。
测量SM10和piscicida的所有细菌的OD 600 ，预计分别为0.8 。
将培养物移入50 ml康宁管中，在10 °C下旋转5,000 × g 5分钟，然后用10 ml LB洗涤，然后在5,000 × g旋转10 min。
重悬于LB与所述下面的体积以达到最终OD 600 = 4。
混合SM10和等体积E. piscicida在一个Eppendorf管，并且点4 * 80 μ升在步骤A2中制备的过滤器。让drop吸附到琼脂中并干燥。
将这些板放入30 °C的培养箱中，注意不要使细胞悬液溢出到膜外（请勿翻转板）。
孵育3小时后，除去过滤器进入一个由镊子50毫升离心管中。通过上下移液和涡旋使过滤器中的细胞重悬在1 ml的LB肉汤中。
将重悬细胞的系列稀释液进行稀释，然后将100 µl 1：1、1：10和1：100稀释液置于含有Col和Gm的LB琼脂板上（以估计转座子的插入效率，因为实际的文库板也可能变得如此）拥挤地挑选殖民地）。在30 °C下孵育过夜。
检查〜100山口ř了Gm ř通过菌落PCR菌落3对通用引物EIB202-F / R，pMKGR -F / R ，和Tn的-F / R（见注5 ）。
将单克隆抗体放入96个深孔板中，在30 °C下旋转200 rpm过夜。
将900 µl细胞与300 µl 80％甘油混合到冷冻管中，以在-80 °C下存储可回收的文库。

热不对称交错PCR（TAIL-PCR）
对于每种单克隆抗体，请在PCR管中准备第一个反应系统：
0.5 µl细菌培养物（来自小标题3.1）。

1 µl 10 µM“ Sp1-F”。

1 µl 10 µM“ AB2-R”。

10 µl Tiangen 2 × Taq PCR MasterMix 。

将H 2 O加入20 µl。

在该程序下的PCR Thermo Cycler上运行。
1 = 94°C持续4分钟。

2 = 94°C持续30 s。

3 = 42°C持续30 s。

[选项]每个周期-1°C。

4 = 72°C，持续3分钟。

5 =转到2，共6次。

6 = 94°C持续30 s。

7 = 58°C持续30 s。

8 = 72°C 1分钟。

9 =转到6，共25次。

10 = 72°C，持续3分钟。

将PCR产物稀释十倍，在PCR管中准备第二个反应系统：
1 µl稀释PCR产物。

2 µl 10 µM“ Sp2-F”。

2 µl 10 µM“ ABS-R”。

25 µl Tiangen 2 × Taq PCR MasterMix 。

将H 2 O加入50 µl。

在该程序下的PCR Thermo Cycler上运行。
1 = 94°C持续3分钟。

2 = 94°C持续30 s。

3 = 64°C持续30 s。

4 = 72°C 1分钟。

5 =转到2，共30次。

6 = 72°C，持续3分钟。

用引物“ Seq2”收集PCR产物和序列。

N冗余子集库的构建（请参阅注释6 ，以E. piscicida EIB202为例）
序列结果被映射到受体EIB202基因组。
绘制饱和度曲线以确保库的饱和度。
根据识别的插入位点，进行了手动生成的非冗余子集库，以促进一个全基因组筛选。
根据不同的实验目的，非冗余的子集库将用于在屏幕上。

gDNA提取
使用市售的gDNA提取试剂盒，请参阅相关协议。

超声处理gDNA剪切
在新鲜的0.5 ml单个试管中稀释gDNA，使其在100 µl H 2 O中的终浓度为50 ng / µl 。
对DNA进行超声处理以产生片段：30s开/ 90s关，持续12个循环。
在琼脂糖凝胶（2％）上运行消化液样品（5 µl）。大多数DNA应该落在200-500 bp的范围内，这对于下游连接和PCR来说是合适的。

结束维修和计费
在PCR管中准备反应：
VAHTS Turbo End Prep酶混合物：3.0 µl。

VAHTS涡轮末端制备反应缓冲液（10 × ）：6.5 µl。

片段DNA（50 ng / µl，加1 µg）：20 µl。

将H 2 O加入65.0 µl。

使用以下循环条件进行PCR。
1 = 20°C持续30分钟。

2 = 65°C，持续30分钟。

适配器连接
在PCR管中准备以下适配器混合物。
5 µl 100 µM“ AD_fork截短的NH2”。

5 µl 100 µM“ AD_Index货叉R”。

0.4 µl 2 mM氯化镁2。

在该程序下的PCR Thermo Cycler上运行。
1 = 95°C持续4分钟。

2 = 95°C 1分钟。

[选项]每个周期-1°C。

3 =转到2，进行75次。

4 =结束。

稀到一半浓度：添加了H的相同体积的2 O.
在PCR管中准备以下连接反应。
A-尾DNA（来自上述小标题3.5）：65微升。

VAHTS Turbo T4 DNA连接酶：2.0 µl。

VAHTS Turbo Ligation Enhancer：30.5 µl。

Tn-seq的适配器（从小标题3.6，第2步开始）：2.5 µl。

将H 2 O加入100 µl。

将反应在20°C下孵育30分钟。
柱纯化的DNA，用35 µl预热的H 2 O洗脱。

Tn相关gDNA的扩增
制备在以下的PCR反应的Eppendorf管中。
50 µl VAHTS HiFi扩增混合物。

200 ng连接的DNA（来自小标题3.6）。

5 µl 10 µM“ 1st_seq-out-psc189引物”。

5 µl 10 µM“ 1st_PCR_Index'R'引物”。

将H 2 O加入100 µl。

分装到2个PCR管中（每个50 µl），并在以下循环条件下进行PCR。
1 = 98°C持续30 s。

2 = 98°C持续10 s。

3 = 53°C持续30 s。

4 = 72°C持续30 s。

5 =转到2，共29次。

6 = 72°C，持续5分钟。

合并2个PCR反应，然后用35 µl预热的H 2 O洗脱纯化PCR产物。

第二次PCR以添加条形码，Illumina附件（P5，P7）和可变性序列
制备在以下的PCR反应的Eppendorf管中。
300 ng纯化的PCR产物（来自小标题3.7）。

75 µl VAHTS HiFi扩增混合物。

7.5 µl 10 µM“ P5间隔引物”。

7.5 µl 10 µM P7 Index条码（应随样品的不同而不同）。

将H 2 O加入150 µl。

分装到3个PCR管中（每个50 µl），并在以下循环条件下进行PCR。
1 = 98°C持续30 s。

2 = 98°C持续10 s。

3 = 55°C持续30 s。

4 = 72°C持续30 s。

5 =转到2，共17次。

6 = 72°C，持续7分钟。

合并3个PCR反应，然后用35 µl预热的H 2 O洗脱纯化PCR产物。

尺寸选择
在0.5 × TAE缓冲液中的2％琼脂糖凝胶上运行所有纯化的PCR产物（来自小标题3.8）。
通过剪切200至500 bp之间的拖尾来选择大小。请确保不包括约200基点可见头对头引物二聚体。
使用标准凝胶提取程序对DNA进行柱纯化，并用50 µl预热的H 2 O洗脱。
通过Qubit定量DNA浓度。现在，DNA已准备好在Illumina测序仪上运行。

条件必需基因分析
使用EL-ARTIST管道确定转座位点和插入的丰度（Chao等，2013）。基于所述中性碱基对模型，转座子插入的随机分布，含有库Ñ突变体，并且在总的基因数目的基因组是ķ ，通过转座子揭露的基因的数量是N.基因j的插入得到的概率p j ，转座子的未发现基因数为N t = 。将必需基因数设为k 1。作为中性碱基对模型，未发现必需基因的概率为N e = ，并且预测的必需基因数k 1 = N- N t + N e 。

笔记

pMKGR是基于Himar1 Mariner转座子构建的。扩增了无启动子的卡那霉素抗性（Kan r ）盒和具有核糖体结合位点（RBS）的基因egfp 。在这项研究中使用的RBS序列是“ AAGGAGG”，其源自大肠杆菌16S rRNA 3'末端保守序列“ CCUCCUU”。将三重末端位点“ TGACTAGCTAA”和48-bp T7终止子序列引入到pMKGR中。将构建的pMKGR转化到大肠杆菌SM10中，并通过PCR和测序进行验证。
的p MKGR ，其衍生物的Himar1水手转座子和菌株E. piscicida EIB202被用作在该协议的例子; 对于不同的转座子和菌株，所有引物序列都需要进行相应的修饰。
制备的膜应与缀合反应一样多。随着越来越多的采摘菌落用于测序，被破坏的基因数量正在增加，并且增加的速率逐渐变为水平，并在步骤C2中达到平稳。这意味着已经产生了大量诱变，并且收集到的突变体能够组装一个全面而饱和的文库。
大肠杆菌EIB202的最佳生长温度为30 °C 。需要根据不同的受体菌株修改以下孵育温度。
当抗生素被用作选择性标记物，有一个小的机会来观察菌落不是真正抗性和能在抗生素存在即使不含有转座子插入（表型抗性）生长。为了确保成功的换位，建议随机restreak 〜100个菌落在新鲜平板并用3对通用引物，其被设计为转座子，其载体质粒和“收件人”小区执行菌落PCR。对于菌落PCR，1）用无菌的扁平牙签或移液器吸头挑选单个菌落，并在无菌水中涡旋。2）大号YSE细菌通过或者简单煮沸使用之前样品或直接加入样品以PCR反应的小体积，以释放DNA。细菌将在常规PCR程序的初始加热步骤中裂解。3）循环条件为：98°C，1分钟；随后进行30个98°C的循环，持续5 s；55°C，5 s; 和72°C，40 s。4）PCR产物的大小是通过电泳确定，然后PCR产物用桑格测序验证。
从亲本库中分离出五个子库。1日和平行2个第二子集文库分别包括单突变为每个ORF，和插入位点在端分别给予优先各ORF-3' 5'内0.4-0.6百分比。一旦ORF仅包含一个插入位点，这些突变体被选择之前到1日的子集库。的3次子集库是一个转录融合文库，其中每个突变体携带MKGR与当地ORF相同的取向和优先考虑接近插入位点的各ORF的5'端。类似于1第一子集库的标准，在4个中生成的库，并且包括不超过两个突变体针对每个基因间区域。5个化合物库是所有从突变体的混合物的1日，2次和4个的子集库和需要2×10 7 CFU为每个相应的突变。

致谢

所描述的协议改编自Wei等人。，2019.这项工作得到了中国国家自然科学基金（32002436授予SS，82010033授予LW），中国国家重点研究与发展计划（2018YFD0900504授予QW），上海航海计划（20YF1411100）的资助。中国农业部科学基金（2020M671034）（CARS-47）和上海市科学技术委员会（17391902000）。

利益争夺

没有利益冲突或利益冲突。

参考

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