材料和试剂

1.5毫升Eppendorf管
半微型石英电池108F-QS（Sigma-Aldrich，Hellma Analytics，目录号：HL108-F-10-40）
1毫米石英池350毫升（Sigma-Aldrich，Hellma Analytics，目录号：HL110-F-1-40）
棕榈酸（Sigma-Aldrich，目录号：C0125-5G）。储存在4°C
颗粒中的KOH，BioXtra（Sigma-Aldrich，目录号：P5958）
不含RNase的水（Sigma-Aldrich，目录号：W4502）
具有5'-FAM和3'-TAMRA荧光探针的RNA寡核苷酸（如果是PIF7发夹，则为5'-FAM-AAG AGA GCU UAA UUG UCA GUU UAU UCU CUG-3'-TAMRA ）; RNA序列应覆盖整个预测的发夹形成序列，但在任一侧均不应超过该序列之外的3个以上核苷酸，以确保有效的FRET（IBA Gmbh，HPLC纯化）。储存在4°C
囊状缓冲液（请参见食谱）
1 M KOH（请参阅食谱）

设备

2 L玻璃烧杯
搅拌棒
SevenCompact pH计S220（Mettler Toledo，型号：30019029）
-80 ° C冷冻室
装有Varian温度控制单元的Varian Cary Eclipse荧光光谱仪（安捷伦，Varian，Cary Eclipse荧光模拟仪）
配备1.5 ml SmartBlock的ThermoMixer C（Eppendorf，型号：EP5382000015 ）（Eppendorf，型号：EP5361000031）
配备温度控制单元的应用光物理学Chirascan（CD）（应用光物理学Chirascan TM ）

软件

Cary Eclipse Kinetics软件（安捷伦，https：//www.agilent.com/en/product/molecular-spectroscopy/fluorescence-spectroscopy/fluorescent-software/cary-eclipse-software）
GraphPad Prism 8（GraphPad软件，https ://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）

程序

60 mM岩藻酸盐缓冲液的制备
笔记：

在准备缓冲液时，应穿戴适当的PPE，这一点很重要，包括丁腈手套，耐腐蚀的实验室外套和护目镜。
Ca codylic Acids含有砷，因此是有毒的，应弃置在专用的重金属废物收集中。
在一个2 L的玻璃烧杯中称重8.280 g水杨酸，并将其溶于500 ml无RNase的水中，确保所有白色粉末都被完全溶解。如果需要，请使用额外的水，直至总体积为700毫升，以确保衣藻酸完全溶解。
用任何标准实验室pH计测量S tep A 1中生成的衣藻酸溶液的pH，确保在同一天对pH计进行了校准。起始溶液的测得的pH预计为〜4.0 。
通过将5.61 g的KOH溶解在100 ml的无RNase的水中来制备1 M的氢氧化钾（KOH）溶液。考虑到由KOH引起的强烈的排毒反应，建议在冰浴中溶解于水中。
用玻璃移液器向顺丁烯二酸溶液中滴加1 M KOH溶液，同时用搅拌棒在磁力搅拌板上搅拌该溶液。在每次滴加后测量pH，直到其稳定在7.4，这是CD和FRET实验所需的最终pH。
将无RNase的水加到手酸盐缓冲液（pH 7.4 ）中，使其总体积为1L。
将该溶液置于4°C以便长期保存。缓冲液在4°C的温度下不应超过3个月。此时间过后，强烈建议准备新鲜的缓冲液。

RNA密封
注意：在进行实验的前一天，对RNA序列进行退火非常重要，以便有足够的时间正确折叠正确的RNA结构。

将双标记的RNA寡核苷酸重悬于适当体积的无RNase的水中，以得到最终浓度为100的储液 μ M.为了实现这一点，加水的体积为10 ×相对于RNA NA的总数nomoles。例如，对于5纳摩尔RNA的添加50 μ升无RNase水中。储存于该解决方案- 80 °下长期储存。
稀释RNA如下：
用于FRET的测量，稀1 μ升100的μ中号RNA股票溶胶在499 ution μ升60mM的（200 nM的最终浓度）的二甲胂缓冲液（pH值7.4 ）在1.5ml Eppendorf管中。
对于CD测量，稀释10 μ升100的μ中号RNA储备溶液在190 μ升（5 μ 60mM的二甲胂缓冲的M个终浓度）（pH为7.4 ）在1.5ml Eppendorf管中。
使用装有1.5 ml SmartBlock的Eppendorf Th ermomixer在90 ° C下加热装有该溶液的Eppendorf管10分钟，以退火在S tep B 2中制备的RNA溶液。在加热RNA溶液的同时准备一个冰盒，并在完成10分钟的加热周期后立即将RNA溶液放入冰中。
在进行任何FRET或CD测量之前，将RNA溶液在4 ° C下储存过夜。

FRET协议
在该实验中，可以使用FRET深入了解RNA序列5'和3'末端之间的距离。为此，在488 nm处激发FAM荧光团（位于序列的5'-末端）并记录500至700 nm之间的发射，覆盖FAM和TAMRA的发射峰（位于3'序列的末端）荧光团。

转移500 μ升的RNA溶液中制备的小号TEP B2a的在半微量石英池108F-QS比色杯中并将其插入到卡里的Eclipse Fluorimiter在17温度预平衡° C.
在比色皿中将荧光比色皿平衡10分钟后，使用以下参数记录荧光发射：
激发波长488 nm;

发射范围500-700 nm;

激发狭缝：5 nm；

发射缝5 nm；

检测器电压高。

将Cary Variant加热块的温度提高到27 ° C，一旦达到温度，则将样品平衡至少10分钟。
使用以下参数记录荧光发射：
激发波长488 nm;

发射范围500-700 nm;

激发狭缝：5 nm；

发射缝5 nm；

检测器电压高。

重复小号TEPS Ç 2至ç 4小号为宜。由于RNA相对较低的稳定性，这个周期可以repeate d的格言微米的12-14倍。代表性光谱显示在图1A中。

图1.随温度变化的发夹动力学，以FRET效率的变化来衡量。实验中使用了带有发夹序列的5'-FAM和3'-TAMRA荧光标记的32 nt RNA寡核苷酸。在17到27 ° C之间的多个位移下，在488 nm处激发时记录了500到700 nm（A）之间的发射光谱；520和578 nm处的峰值发射用于计算FRET效率（B）。FRET效率是使用以下公式计算：[ FA /（FA + FD）] × 100 ，瓦特这里Fa是受体（FAM）的发射和Fd是供体（TAMRA）的发光强度。

CD测量
在该实验中，RNA在不同条件下采用的总体二级结构将提供可实时监控的特征CD签名。光谱机智h的最大在〜270nm处和minimu在〜210nm处米指示经典RNA发夹结构。

转移200 μ升的RNA的制备小号TEP的B2B成1毫米石英池，并将其放置在Chirascan TM仪器预平衡在17温度° C.
在比色杯中在圆二色谱仪中平衡至少10分钟后，使用以下参数记录300至180 nm之间的CD强度（报告为摩尔椭圆率θ）：
R ecord每纳米1点；

B宽度0.5 nm;

Ť每点1秒IME。

连续3次在17 ° C下获取CD光谱。
将Chirascan TM升至27 ° C，并在此温度下平衡样品至少10分钟。
使用以下参数记录300至180 nm之间的CD强度：
R ecord每纳米1点；

B宽度0.5 nm;

Ť每点1秒IME。

连续3次在27 ° C下获取CD光谱。
重复小号吨EPS d 1至d 6用200 μ升60 nM的二甲砷酸盐缓冲液的记录的基线。

数据分析

对于FRET测量，对于每种温度，将578 nm处记录的发射（TAMRA发射峰）除以578 nm和520 nm处记录的发射（FAM发射峰）之和（图1B）；该比率成反比与两个荧光团之间的距离（相关即，在RNA寡核苷酸的端部）。因此，FRET效率的降低反映了发夹结构的（部分）打开或不稳定。
对于CD光谱，将每个温度的三个重复测量结果取平均值，以减少背景噪声并减去在各个温度下记录的基线。绘制基线校正的CD强度与波长的关系图，并覆盖在S teps D3和D6中获得的两个光谱，以可视化在17和27 ° C下RNA发夹结构之间的结构差异（图2）。发夹型特征信号在〜270 nm处显示可检测的最大值，在〜210 nm处显示最小值，〜210 nm的峰更明显，表明发夹结构的稳定性增强。

图2.随温度变化的发夹动力学随CD光谱的变化而变化。包含发夹的RNA寡核苷酸的CD光谱在17和27 ° C下记录。

笔记

我们建议在整个协议中使用无RNase的实验室器具。
可以将本协议中使用的17和27 ° C的测定温度调节至实验者感兴趣的温度。
菜谱

ac状缓冲液
在无RNase的水中加入60 nM衣藻酸，用1 M KOH调节pH 7.4；储存在4 ° C （有关缓冲液制备的详细信息，请参阅第A节）

1 M KOH
在无RNase的水中

致谢

MB获得了EMBO长期研究金（ALTF 4815）的支持，MDA及其小组得到了BBSRC David Phillips研究金（BB / R011605 / 1）的支持。BYWC及其小组得到了惠康信托基金会（096082），MRC（MR / R021821 / 1）和皇家学会（RGS \ R2 \ 192222）的资助。

这项工作基于Chung等人的原始研究论文“ RNA热开关调节拟南芥的白天生长” 。（2020）。

利益争夺

我们声明不存在利益冲突。

参考

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