材料和试剂

材料

7 ml Bijou试管（Greiner，货号：189170）
移液器吸头（Greiner，目录号：739288）
1.5 ml微量离心管（Greiner，目录号：616201）
皮尔-A-路®嵌入模具（广场- S22，Polysciences公司）
Sterilin TM标准90毫米培养皿（Thermo Fisher，目录号：101R20）

动物

在我们最初的研究中使用的小鼠是在CBA背景下饲养的。用于定时交配的小鼠年龄在6至24周之间。

试剂种类

蔗糖（Thermo Fisher，产品目录号：S25590）
1 × PBS（赛默飞世尔（Thermo Fisher），目录号：14190094 ）
Tris-HCl（Thermo Fisher，产品目录号：10812846001）
CaCl 2 （赛默飞世尔（Thermo Fisher），目录号：10657662）
乙醇（Thermo Fisher，目录号：AC615090010）
牛血清白蛋白（Merck，目录号：A1933）
多聚甲醛（默克（Merck），目录号：158127）
OCT嵌入矩阵（Cellpath，目录号：KMA-0100-00A）
硼氢化钠（默克（Merck），目录号：452882）
甘氨酸（默克（Merck），目录号：G8898）
牛血清白蛋白（默克，目录号：05470）
肝素酶I和III的混合物（Millipore Sigma，目录号：H3917）
重组人类FGFR1β（IIIc）Fc嵌合蛋白（R＆D Systems，目录号：661-FR-050）
重组人类/小鼠FGF-8b蛋白（R＆D Systems，目录号：423-F8）
重组小鼠FGF-17蛋白（R＆D Systems，目录号：7400-FG）
抗人IgG（Fc特异性）-Cy3抗体（默克（Merck），目录号：C2571）
DAPI（Thermo Fisher，目录号：D1306）
Vectashield Hardset（矢量实验室，目录号：H-1400）
肝素酶缓冲液（请参见食谱）

设备

移液器
解剖显微镜（Euromex，目录号：DZ1100）
低温恒温器（徕卡，目录号：CM3050 S）
保温箱（37°C）
5号镊子（Fine Science Tools，目录号：11251-20）
微型剪刀，切削刃5毫米（精细科学工具，目录号：15003-08）
剪刀，9厘米（精细科学工具，目录号：14060-09）
Super-frost Plus载玻片（Thermo Fisher，目录号：J1800AMNZ）
科普林罐（Millipore Sigma，目录号：S6016）
模拟摇摆平台摇床（VWR，目录号：10127-872）
疏水性隔离笔（VectorLabs，目录号：H-4000）
加湿室/载玻片染色托盘（Heathrow Scientific，目录号：HS15951A）
带有图像捕获软件的落射荧光或共聚焦显微镜（例如，Leica AF6000落射荧光显微镜）

软件

ImageJ / FIJI 1.53版（https://imagej.net/Fiji）

程序

简介：该协议分为两部分。在A部分中，我们描述了从胚胎脑的解剖，组织的嵌入和冷冻切片开始的LACE分析。然后，我们详细介绍了LACE分析本身，包括将重组配体和受体蛋白与组织切片一起孵育，然后使用荧光偶联抗体检测结合的受体蛋白。在B部分中，我们描述了反应组织切片的成像以及使用FIJI软件对荧光LACE信号的定量。

花边测定
在所需的胚胎阶段剔除怀孕的母鼠。用剪刀打开腹部，取出应该清晰可见的子宫。
注意：在我们的测试中，我们已经成功地使用年龄在E11.5和E18.5之间的小鼠脑组织进行了LACE分析。除CHO细胞系外，其他小组也成功地使用了胚胎的心脏，肺和肝组织（Allen和Rapraeger，2003年）。

将子宫放在冰冷的PBS皿中。用镊子打开子宫，小心取出胚胎并转移到新鲜的PBS皿中。
用剪刀从胚胎的身体上切下头部，然后转移到新鲜的冷PBS中。用镊子从头部剥去皮肤，露出颅骨，用小剪刀剪掉颅骨的中线，再剥开颅骨，露出大脑。小心地将大脑与头部的底部分离，并用镊子将其移除（图1A-1 D）。
注意：如果需要，抽取组织样本进行基因分型。

将大脑固定在7 ml bijou管中的PBS中的4％多聚甲醛（PFA）中，在4 °C摇动（20 rpm）过夜。
注意：7 ml PFA对胚胎大脑来说足够了。出生后大脑中P3以下的应固定在20 ml试管中，较老的大脑应通过经心灌注固定。

用1 × PBS短暂清洗大脑，并在4 °C下用PBS中的30％蔗糖冷冻保护组织过夜，或直至组织沉没。
注意：可以倒掉PFA和PBS，而无需更换容器。

将大脑转移到包埋模具中，并用50％OCT包埋基质覆盖组织；50％蔗糖/ PBS。将组织定位在所需的方向并在干冰上冻结（图1E，1F）。
使用低温恒温器以10 µm的厚度切片组织，并在Superfrost Plus载玻片上收集切片。（图1G- 1 I）。
注意：切片可在-20 °C下保存，直到需要为止。

图1.胚胎小鼠脑组织的解剖图，包埋图和切片图。一。胚胎的头部脱离了身体。乙。沿颅骨的中线（红色虚线）开一个n切口。Ç 。头骨被剥去以露出大脑。d 。大脑脱离头部。Ë 。将大脑放置在包埋模具中，并浸入OCT /蔗糖溶液中。˚F 。然后将脑组织在干燥的冰上冷冻。摹-我。然后可以使用低温恒温器对冷冻的组织进行切片，并将切片安装在超霜载玻片上。

选择用于LACE分析的玻片，切记包括用于肝素酶消化和无配体对照的玻片。
将载玻片在室温下于95％乙醇中放置5分钟。
通过将载玻片在室温下于PBS中的4％PFA中放置10分钟并在振动下固定切片
室温下摇晃2 × 5分钟，在1 × PBS中清洗切片。
注意：所有洗涤步骤均应在室温下进行，将载玻片放在可平罐中，盖上1 × PBS，并以50 rpm摇动。

在室温下将切片与coplin广口瓶中的0.05％硼氢化钠溶液一起孵育5分钟。
注意：在孵育过程中，应在组织切片上形成氢气气泡，如果未形成气泡，则应组成新鲜的硼氢化钠溶液，然后重复进行。

更换为新鲜的0.05％硼氢化钠，再将切片孵育10分钟。
用1 × PBS洗涤切片，2 × 5分钟。
在0.1M甘氨酸孵育切片在1 × PBS在4 ℃下振荡过夜。
注意：硼氢化钠/甘氨酸处理可减少醛固定诱导的自发荧光，从而减少背景荧光，因此更易于检测LACE信号。

用1 × PBS洗涤切片，2 × 5分钟。
在肝素酶缓冲液（0.5 mU / ml工作浓度）中稀释肝素酶。
选择用于肝素酶消化控制和配体阴性控制的玻片，使用疏水性隔离笔在切片周围画图。
注意：包括肝素酶消化和配体阴性对照，以确保观察到的LACE信号是HS：配体：受体复合物形成的结果。如果肝素酶消化后检测信号（即，去除HS）或在配体阴性对照这表明受体而不复合物形成直接绑定到所述组织。

将肝素酶溶液应用于选定的玻片，将未处理的玻片留在1 × PBS中。
将载玻片放在密封的加湿室中，并在37 °C下孵育2小时。
更换为新鲜的肝素酶溶液，并在37 °C下再温育2小时。
在ddH 2 O中洗涤处理过的载玻片1 × 5分钟。
用1 × PBS洗涤所有载玻片1 × 5分钟。
块部分使用1％牛血清白蛋白在1一封闭溶液× TBS 1个小时。
FGFR1 / FGF处理，在4 °C下过夜。
在我们的实验中，我们分别以9 µM和100 nM的浓度使用了FGFR1和FGFR3 。FGF8和FGF17的浓度分别为30 nM和3 µM。
将重组FGFR和FGF在1 × TBS中的1％牛血清白蛋白中稀释。
将100 µl FGFR / FGF溶液应用于每个载玻片。
载玻片应放置在潮湿的房间中过夜培养。
注意小号：

该方案中使用的重组Fc嵌合融合蛋白是与IgG的Fc结构域进行遗传连接的蛋白（在我们的情况下为FGFR1 / 3）。此Fc标签可使用抗体轻松检测目标蛋白。Fc融合蛋白可用于多种不同的受体，包括FGFR，VEGFR，Robos，Neuropilins和DCC。
此处使用的FGFR / FGF浓度是从最初描述这些结合测定的文献中获得的（Friedl等，2001 ；Allen和Rapraeger，2003）。在我们的测试中，对于我们使用的FGFR / FGF组合，我们始终保持大约3：1的受体/配体比率。要使用其他受体/配体对进行此测定，用户需要滴定这些浓度，但是我们建议从此处使用的浓度开始，并保持3：1受体/配体比率。
在1 × TBS中洗涤切片，4 × 5分钟。
在封闭溶液中稀释200倍稀释的荧光偶联二抗（抗人IgG，Fc特异性Cy3）。
在1 × TBS中洗涤切片，4 × 5分钟。
用DAPI以1比1稀释，000比1 × PBS稀释5分钟。
注意：DAPI储备溶液的浓度为1 mg / ml。

用1 × PBS洗涤所有载玻片，1 × 5分钟
使用Vectashield Hardset盖玻片，在室温下干燥1小时。
干燥后，可以使用落射荧光或共聚焦显微镜对载玻片成像。

LACE量化
使用落射荧光或共聚焦显微镜的图像幻灯片。
注意：必须使用相同的物镜在恒定的曝光时间和增益下对所有用于定量采集的图像进行成像。还应注意确保图像中的像素没有过度曝光。

LACE信号在未经过肝素酶消化的经配体和Fc标签受体处理的组织切片中应该很明显（图2A，2E）。省略配体的对照部分应为空白（图2D，2H）。与未消化的切片相比，经过肝素酶消化的切片应看到LACE信号减少（图2 C，2 G），这表明配体/受体对的结合是HS依赖性的。

图2 。在E14.5小鼠脑组织上进行FGFR1 / FGF17 LACE分析。A，E。LACE信号（红色）在WT胚胎的皮层中可见。B ，F.在Hs2st -/-胚胎中LACE信号大大降低。丙氨酸酶消化后，WT组织中的LACE信号大大降低。D，H。当从结合步骤中省略FGF17配体时，LACE信号被完全消除。我。在WT和花边信号的量化HS2ST / - -在E和F系带信号示出皮质中减少显著HS2ST / - -皮质与WT相比（吨-检验，P = 0.014）。E，F，G，H分别是A，B，C，D中方框区域的高倍放大图像。比例尺= 200 µm。

LACE图像应在ImageJ（或FIJI）软件中打开（图3 A）。
注意：在采集和定量之间不得以任何方式修改图像。

单击菜单栏上的“分析”，然后选择“设置度量”，在出现的弹出窗口中，确保已选中“均值”（图3 B）。
注意：可以在此窗口中选择任何其他所需的测量。

在ImageJ软件中打开配体阴性对照，并使用矩形，椭圆形或多边形工具在要量化的区域周围绘制形状，所使用的形状应为已知大小，在整个量化过程中应保持一致（图3）C）。
单击“分析”，然后选择“测量”，出现的弹出窗口将在“均值”下给出量化区域的平均灰度值（图3 D）。在至少2个其他配体阴性对照组织切片上重复此过程，并计算平均灰度值。然后可以将其用作同一LACE实验中切片的背景荧光值。

图3 。使用FIJI软件进行LACE荧光定量。A.在斐济软件中打开图像文件。B. è nsure “平均数灰度值”被“设置测量”窗口检查。C.在要量化的区域绘制大小一致的形状。D.单击“测量”并记录平均灰度值。

在ImageJ中打开实验图像，并在要量化的区域周围绘制选定的形状，如S tep B5中所示。确保形状在组织部分内具有相同的大小和相同的解剖位置。
点击“分析”，并选择“测量”作为在小号TEP乙6一次记录的平均灰度值。通过从为该部分记录的灰度值中减去背景荧光值来执行背景荧光减法。
使用至少2个以上的组织切片重复步骤B8，并计算该动物的平均灰度值。
对实验中所有其他动物的组织切片重复步骤B8和B9 。

菜谱

肝素酶缓冲液
20毫米Tris-HCl

4毫米CaCl 2

0.1 mg / ml牛血清白蛋白

致谢

这项工作得到了惠康基金会，生物技术和生物基金会的资助。

科学研究委员会（BB / M00693X / 1）和针对大脑发育的西蒙斯计划（SFARI-529085）。

利益争夺

作者宣称没有相互竞争的经济利益。

伦理

根据英国内政部的法律和爱丁堡大学伦理审查委员会和内政部批准的许可证，所有小鼠均在内部进行繁殖。畜牧业符合1986年《英国动物（科学程序）法》的规定。所有工作均根据内政部项目许可证编号P1351480E进行。

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参考

艾伦（Allen，BL）和拉普拉格（Rapraeger），交流（2003）。硫酸乙酰肝素在小鼠发育中的时空表达调节FGF和FGF受体组装。J Cell Biol 163（3）：637-648。
艾伦（Allen，BL），菲拉（Filla），密西根（MS）和拉普拉格（AC）Rapraeger，AC（2001）。硫酸乙酰肝素作为FGF-4和FGF受体识别的组织特异性调节剂的作用。J细胞生物学155（5）：845-858。
克莱格JM，帕金HM，梅森，JO和普拉特T.（2019）。Hs2st硫酸乙酰肝素硫酸盐化通过非细胞自主机制限制了发育中的小鼠前脑中星形胶质前体的体位易位。神经科学杂志39（8）：1386-1404。
Friedl，A.，Filla，M。和Rapraeger，AC（2001）。FGF和FGF受体与内源性硫酸乙酰肝素的组织特异性结合。方法分子生物学171 ：535 -546 。