材料和试剂

1. 2-巯基乙醇（卡尔·罗斯，目录号：4227.1）

2.苄am（Carl Roth，目录号：CN38.1）

3. BHQ （单链）（[BHQ1] GGTATTATTATTATTGCGTTATTATTATTATGG [BHQ1] 100 μM）（Sigma-Aldrich公司）

4.牛血清白蛋白（BSA）（New England Biolabs公司® ，目录号：B9000S）

5.细胞培养瓶T25，T75，T175（Sarstedt，目录号：83.3910.302、83.3911.302、833912.302 ）

6. CHAPS（卡尔·罗斯，目录号：1479.1）

7. CN-8-oxoG（单链）（[6FAM] CCATAATAATAATAAC [8-oxo-dG] CAATAATAATAATA

CC [6FAM] 100 µM）（Sigma-Aldrich）

8. CN-CTRL（单链）（[6 FAM] CCATAATAATAATAACGCAATAATAATAATACC [6FAM] 100 µM）（Sigma-Aldrich）

9. cOmplete TM迷你蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche Diagnostics，目录号：04693124001）

10. DMSO（卡尔·罗斯，目录号：A994.2）

11. Dulbecco的改良版Eagle媒介 –高葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D7777-10L）

12. EGTA（卡尔·罗斯，目录号：3054.1）

13.胎牛血清（FBS）（Gibco公司® ，目录号：26140079）

14.庆大霉素（10毫克/毫升）（Gibco公司® ，目录号：11500506）

15.甘油（Carl Roth，目录号：6967.1）

16.注射套管（G 20 × 1½”）（B。Braun，目录号：4657519）

17. KCl（卡尔·罗斯，目录号：6781.3）

18. KH 2 PO 4 （卡尔·罗斯，目录号：3904.2）

19.的LightCycler ® 480多孔板96（白色）（Roche Diagnostics公司，目录号：04729692001）

20.的LightCycler ® 480密封膜（Roche Diagnostics公司，目录号：04729757001）

21. MgCl 2 （卡尔·罗斯，目录号：KK36.1）

22. Na 2 HPO 4 · 12H 2 O（Carl Roth，目录号：N350.1）

23.氯化钠（卡尔·罗斯，目录号：3957.3）

24. NEBuffer TM 2（新英格兰生物实验室® ，目录号：B 7002S）

25.移液器过滤嘴：2.5 µl，10 µl，20 µl，200 µl，1和000 µl（Sarstedt，目录号：70.1130.217、70.1130.215、70.1114.215、70.760.216、70.762.216）

26. QuinoMit ® –航母控制（MSE Pharmazeutika）

27. QuinoMit ® Q10-液-泛醇（MSE Pharmazeutika）

28.反应管：0.2 ml，1.5 ml（Sarstedt，目录号：72.737.002、72.706.201）

29.重组人OGG1蛋白（100微克）（Abcam，目录号：ab98249）

30.注射器2毫升（Injekt ® 2ml）中的（贝朗，目录号：4606027V）

31. Tris-HCl（Carl Roth，目录号：9090.3）

32.柠檬酸三钠二水合物（≥99％）（卡尔·罗斯，目录号：3580.4）

33.胰蛋白酶-EDTA（0 。5％）（Gibco公司® ，目录号：10779413）

34. 1 × PBS（请参阅食谱）

35. CHAPS缓冲区（请参阅食谱）

36.载波控制（10 mM）（请参阅食谱）

37.泛醇配方（10毫米）（请参阅食谱）

38.用于成纤维细胞的DMEM（请参阅食谱）

39.反应缓冲液（请参见食谱）

40. 2 M柠檬酸三钠二水合物（请参阅食谱）

设备

离心机Eppendorf 5427 R（Eppendorf，目录号：5409000210）
离心机Eppendorf 5804 R（Eppendorf，目录号：5805000010）
冰柜（利勃海尔Comfort（利勃海尔，目录号：不提供）
培养箱中在37℃，5％CO 2，90％湿度（HERA细胞240，目录号：2510-413-01）
的LightCycler ® 480（罗氏诊断，目录号：05015278001）
PCR冷却器（Eppendorf，目录号：3881000031）
pH计FiveEasy TM F20 （梅特勒-托利多（Mettler Toledo），目录号：30266626）
移液器，微量离心研究®加：0 。1 µl 10 µl，20 µl，200 µl，1和000 µl（Eppendorf，目录号：3123000012、3123000020、3123000039、3123000055、3123000063）
Sonoplus Ultraschall-Homogenisator HD 3100（班德林电子）
热循环仪MKR13 HLC（DITABIS，目录号：MKR 13）
超纯水（ddH 2 O）制备装置，Purelab flex 4（Veolia Water Technologies）

软件

的GraphPad Prism，8.2版本0.1（格拉夫派得软件® ）
的LightCycler ® 480软件（仪器软件），版本1.5.0.39 （罗氏诊断）

程序

细胞培养
在适当的细胞特异性培养基中，在有或没有测试物质的情况下，首先在37°C下以5％CO 2和90％湿度的形式培养成纤维细胞。
在适当的温育期后，用胰蛋白酶-EDTA去除细胞，并将3.0 × 10 6个细胞转移到新的1.5 ml反应管中。
在1200 × g和4°C下将细胞离心5分钟，然后将得到的沉淀重悬于1 ml 1 × PBS中（洗涤步骤）。

线粒体的分离与裂解
取3.0 × 10 6成纤维细胞于1 × PBS中，在1,200 × g和4°C下离心5分钟。
弃去上清液，将得到的沉淀重悬于200 µl CHAPS裂解缓冲液（pH 7.4）中，该缓冲液中补充有3 µl 2 M柠檬酸三钠二水合物，并在冰上孵育45分钟。
用注射器和套管（直径= 0.9 mm）在冰上通过上下吹打10次使样品均质化。
为了将线粒体与其余细胞结构完全分离，将样品在1200 × g和4°C下再次离心10分钟。
将带有线粒体的上清液转移到新的1.5 ml反应管中（在冰上预冷）。
在冰上进一步裂解步骤中，用20瓦脉冲超声将分离的线粒体裂解1分钟（打开0.5 s脉冲，关闭1.0 s脉冲）。
在21,000 × g和4°C下进一步离心45分钟后，可以将上清液保存在冰上，直到数小时内可以再次使用。将上清液在-20°C下保存过夜或更长时间。

报告寡核苷酸的制备
混合5μl每个单链报告子寡核苷酸CN-8-oxoG（[6FAM] CCATAATAATAATAAC [8-oxo-dG] CAATAATAATAATACC [6F AM]）（100 µM）和CN-CTRL（[6FAM] CCATAATAATAATAACGCAATAATAATACC [6FAM] ]）（100μM）分别与10微升BHQ1标记的互补链的（[BHQ1] GGTATTATTATTATTGCGTTATTATTA TTATGG [BHQ1]）（100μM）（所有西格玛奥德里奇GmbH）和35微升的单独0.2毫升反应管NE缓冲液TM 2. A中的报道寡核苷酸中可以看到的示意图˚F igure 1。
将寡核苷酸混合物在热循环仪中于95°C孵育15分钟，然后在-20 °C的冰箱中冷却完成的构建物（冷却阶段退火–退火温度= 50°C）。Ť他最终构建体的随后的存储发生在-20℃。

图1.测定的基本原理。带有8-oxoG碱基的双链核苷酸链（以红色显示）用于检测hOGG1的活性。带有损伤的链的两端带有6-FAM分子作为荧光报告分子，两端带有相对的淬灭剂。在未切割的报告寡核苷酸中，两条链彼此杂交，从而6-FAM分子的荧光信号被淬灭剂截获。如果具有损伤的链被切断，则两个核苷酸链彼此解离并且可以测量荧光信号。

碱基切除修复测定
移液管的样品和对照如表1所示，通过上下移液均质化样品放入白色96孔板（两个孔是必需的每Appro公司ACH - ø NE为CN -8-氧鸟嘌呤和一个用于CN-CTRL）。

表1.不同反应方法的组成

积极控制

负控制

样本

反应缓冲液

94.3微升

94.3微升

75.3微升

柠檬酸三钠二水合物[2M]

3.7微升

3.7微升

3.7微升

记者构建的[CN-8-oxoG 0.1 µM /

CN-CTRL 0.2 µM]

1微升（CN-8-oxoG）/

（CN-CTRL）

1微升（CN-8-oxoG）/

（CN-CTRL）

1微升（CN-8-oxoG）/

（CN-CTRL）

矩形。OGG1

1微升

--

--

ddH 2 O

--

1微升

--

样本

--

--

20微升

用密封箔将板密封，并在720 × g和4°C下将板离心5分钟。
为了实时检测基本切除活性，请在Light Cycler 480（Roche Diagnostics）中执行荧光信号的测量，共37个温度，每个周期80分钟，每次1分钟。的6-FAM分子的激发发生在波长范围内的483的荧光信号的465nm处和检测- 533ñ米（图2A）。
为了确定所得的寡核苷酸片段，在完成实时活性测量（图2B）后，在95°C至20°C的温度下进行熔解曲线分析。

图2.通过荧光和解链曲线分析确定hOGG1活性的示意图。一。用1.6单位商业购买的hOGG1以及从细胞裂解物中获得的hOGG1消化80分钟后每次1分钟的报告寡核苷酸CN-8-oxoG（有损伤）和CN-CTRL（无损伤）的荧光曲线在37°C下。B.中号报道的elting曲线与从细胞裂解物获得1.6单位商业购买和hOGG1基因hOGG1基因的消化后的寡核苷酸CN-8-氧鸟嘌呤和CN-CTRL。

数据分析

hOGG1的碱基切除修复活性可以通过缺陷报告寡核苷酸（CN-8-oxoG）减去非特异性消化（CN-CTRL）的荧光曲线的终点（最大荧光）来确定（图2A）。
实时活性测量完成后，可以使用记录的熔解曲线进行片段分析。为此，在从95°C到20°C （-（d / dT））的温度变化下记录荧光信号趋势的一阶负导数。所得的最小值代表不同片段的熔化温度。位置1处的峰表示hOGG1活性的完整切割底物。在该底物中，从DNA上切下两个修饰的碱基（8-oxoG），并切割DNA的糖-磷酸主链。在位置2处标记的峰代表具有AP位点的底物，其中该酶的N-糖基化酶功能已经具有活性，而AP裂解酶则没有。在位置3处有未切割的底物，其中糖基化酶和连接酶功能均未激活。根据较大峰的位置，可以对hOGG1各个酶促步骤的活性做出说明（图2B）。
数据可以用分析的GraphPad Prism，8.2.1版（格拉夫派得软件® ）。值以平均值±SEM或单个值表示。建议每种方法重复三次。

代表数据

根据进行的步骤测量分离的线粒体裂解物中hOGG1的碱基切除修复活性（图3）。然而在这种情况，为了测试在hOGG1基因，一个泛醇制剂的酶活性辅酶Q10的效果（QuinoMit ® Q10-流体-泛醇，MSE Pharmazeutika）和载体控制（CC）（QuinoMit ® -载波控制，MSE Pharmazeutika）被附加地添加到不同的测量之前直接接近。这样做是因为怀疑与其他依赖氧化还原的转录因子一样，hOGG1受到抗氧化剂的氧化还原活性特性的积极调控。完全按照QuinoMit®Q10-Fluid所述的方法进行载体对照的给药。QuinoMit®Q10-流体和载波控制是磷脂纳米颗粒（30乳液- 90纳米）。两者始终都是新鲜称量的，并用超纯水稀释。这些测试化合物的确切组成可以在下表2中找到。

图3。泛醇对从线粒体分离的hOGG1酶活性的影响。不同浓度的加成（10 - 1 ，ubiquino的000μM）升和载波控制（CC），以从线粒体裂解物报道寡核苷酸和hOGG1基因，从3.0分离× 10 6人成纤维细胞。作为阴性对照（NC），包括一种使用测试溶液和报告寡核苷酸但不使用hOGG1的方法。用LightCycler ？480在483和533 nm之间的波长范围内记录荧光信号。显示了基于hOGG1活性的消化的报告寡核苷酸的荧光信号（n = 3，平均值 ± SEM，采用Bonferroni多重比较测试的单向方差分析，* P <0.05）。标准化为阳性对照的值（PC =没有测试溶液的所有测定成分）。PC对应于1.0。从Schniertshauer等获得的数据。（2020年）。

表2 。的确切组成QuinoMit ® Q10-流体和载体控制

辅酶Q10配方和载体控制

QuinoMit ® Q10-液

泛醇（红色）

运营商控制

甘油

+

+

泛醇

+

--

去离子水

+

+

大豆卵磷脂

+

+

烟酰胺

+

+

笔记

我们在此描述的分离的线粒体裂解物中的碱基切除修复活性的测量具有很高的重现性。
需要柠檬酸三钠来防止细胞裂解物中所含的DNase对报告寡核苷酸的非特异性消化。确定了抑制DNase的柠檬酸三钠二水合物的最佳浓度，适用于成纤维细胞，并且可以适应于其他细胞系的使用。
此处介绍的测定法解决了修复酶hOGG1的活性。对BER的其他修复酶的适应性应该是可能的，并取决于所使用的报道寡核苷酸。
此处使用的报告基因寡核苷酸不是可商购的，而是由Sigma Aldrich设计并代表客户生成的。
此方法是在原发性纤维上开发的，但根据初步发现，它也适用于PBMC的裂解物。首先必须建立更多的细胞系。
如此处所述的测量是在光循环仪中进行的，但可以适用于任何其他RT-PCR系统。
基于所使用的荧光标记（6-FAM； Ex 465 nm / Em 510 nm），在483至533之间的波长范围内测量荧光信号。
应在冷袋（PCR-Cooler）上进行96孔板中方法的准备，以尽可能避免酶的过早活性。
实时图像中的荧光的增加引起-如上所述-通过切开的片段。对于报告寡核苷酸，这些片段的解链温度为约36℃，而未切割的寡核苷酸的解链温度为约52℃。
从皮肤活检组织中分离出人成纤维细胞，所述皮肤活检组织是从德国普通外科部门Kreiskrankenhaus Sigmaringen获得的。来自德国整形外科部门Constance Aesthetic Perfection Lake Constance；或来自德国罗伊特林根的Fuhrer博士，H。Nonnenmacher博士，Astfalk博士和Fauser博士。所有实验均根据赫尔辛基宣言进行，并经德国巴登-符腾堡州医学协会国家伦理委员会批准（187-03）。事先通知患者，并书面同意使用他们的样品。如Burger等人所述分离细胞。（2010年）。

菜谱

1 × PBS
8克氯化钠

0.20克氯化钾

2.88克Na 2 HPO 4· 12H 2 O

1.24克KH 2 PO 4

甲djust到1升的DDH 2 O，pH 7.4的

2 M柠檬酸三钠二水合物
5.882 g柠檬酸三钠二水合物

甲djust到10毫升的DDH 2 ö

载波控制（10 mM）
0 。904克QuinoMit ® -载体控制

甲djust至5 ml的的DDH 2 O，pH 7.4的

CHAPS缓冲区
1.25毫升甘油（80％）

1毫升CHAPS（5％）

100 µl Tris-HCl（1 M）

100 µl EGTA（0.1 M）

10 µl MgCl 2 （1 M）

5 µl苄am （0.2 M）

3.52 µl 2-巯基乙醇（14.19 M）

甲djust到10毫升的DDH 2 O，pH 7.4的

甲DD一个片剂完整TM迷你蛋白酶抑制剂混合物

用于成纤维细胞的DMEM
500毫升DMEM

50毫升FBS

2.5毫升庆大霉素（50微克/毫升）

反应缓冲液
320微升DMSO

160 µl NEBuffer TM 2

16 µl BSA（20 µg / µl）

752微升ddH 2 O

泛醇配方（10毫米）
0 。904克QuinoMit ® Q10-液

甲djust至5 ml的的DDH 2 O，pH 7.4的

致谢

作者感谢Franz Enzmann博士和AlexanderBürkle博士的科学建议。这项研究得到了BMBFFHprofUnt2012 “ MitoFunk ” （03FH022PX2）和巴登-符腾堡州科学，研究与艺术部的支持。

利益争夺

JörgBergemann与德国巴特洪堡的MSE Pharmazeutika GmbH和德国汉堡的Beiersdorf AG签订了咨询合同。

参考

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