材料和试剂
PVC管（Nalgene，¼” ID）
Eppendorf管（Fisher Scientific，目录号：05-408-129）
移液器技巧（Fisher Scientific）
11毫米塑料自动进样器样品瓶（Thermo Scientific，目录号：C4011-13）
紫外线比色皿（Fisher Scientific，目录号：NC0628994）
0.2微米注射器式过滤器，尼龙（Fisherbrand，目录号：13100108）
如先前所述（Luxenhofer et al。，2010）合成聚（2-恶唑啉）三嵌段共聚物（P [MeOx 37 -b-BuOx 23 -b-MeOx 37 ]-哌嗪）
药物购自Adooq Bioscience，Apex Bio或LC实验室，并储存在-20 °C下
乙醇200证明（Fisher Scientific）
生理盐水（Teknova，目录号：S5815）

设备

移液器（Fisher Scientific）
超声仪（Branson 2510超声浴）
Eppendorf加热块（Fisher Scientific，目录号：11-715-1250）
干燥器（LabCorp）
转子真空蒸发器（Buchi）
涡旋混合器（Fisher Scientific，目录号：02215365）
台式微量离心机（Thermo Scientific）
Eppendorf离心机Minispin（Fisher Scientific，目录号：05-090-100）
HPLC（Agilent 1200系列）
Zetasizer（马尔文）

程序

制备载药POx胶束（小，μL规模;适用于载有单药和多药的POx胶束）
在普通溶剂中准备药物和聚合物的储备溶液。
注意：制备POx胶束的常用溶剂是乙醇（200标准标准液），甲醇和丙酮。在某些情况下，可以使用两种溶剂的混合物来溶解药物。储备溶液的浓度取决于药物/聚合物在溶剂中的溶解度。例如，在乙醇中以10 mg / ml的浓度制备紫杉醇储备溶液，在同一溶剂中以10 mg / ml的浓度制备POx储备溶液（POx也以≥10mg / ml的形式溶于丙酮和甲醇中）。您将需要使用超声浴将PTX溶解在乙醇中。
以预定的聚合物/药物比率（w / w）混合聚合物和药物溶液。
注意：聚合物：药物的重量比为10：2是确定聚合物是否可以溶解药物的良好起点。如果薄膜在盐水中的分散性很好（第4步），请按照更高的比例（10：4和10：8）进行操作。例如，对于POx：PTX的负载比为10：4的情况，添加50 μ痘与20升原液μ PTX的L贮备溶液，并混合使用涡旋混合器（设定10;为〜10秒）。

通过将装有药物-聚合物混合物的Eppendorf管放在加热块中并将氮气流吹入管中，从而蒸发掉溶剂。
透明（不浑浊）的薄膜的出现表明最佳的加热条件（参见图2A）。蒸发的最佳温度取决于所用溶剂的物理化学性质（例如，蒸发温度）和药物的物理化学性质（例如，亲脂性，极性等）。值得注意的是，瑞西莫德和PTX的最佳蒸发温度分别为50 °C和45 °C ，其他药物的最佳蒸发温度为40 °C 。 °C至80 °C 。

注意：可以将一次性移液器吸头插入PVC管的末端，然后放低到Eppendorf管中，以促进氮气的缓慢流动。此外，可以通过将薄膜放在干燥器中放置过夜来去除残留的痕量溶剂。

图1. POx胶束制备工作流程（由BioRender.com创建）

请在正文中引用图1。

用生理盐水水合薄膜。
所用盐水的量取决于所需的最终药物浓度。水合的最佳条件因每种药物而异。例如，在室温下孵育10分钟，然后轻轻摇动试管轻轻搅动，足以溶解瑞西莫德的薄膜。相比之下，紫杉醇需要在65°C下孵育20分钟，每5分钟轻轻搅拌一次。对于每种结合了单药和多药的POx胶束，应根据经验优化水合温度。

注意：必须彻底搅拌（使用涡旋混合器或轻轻轻拂试管），才能完全分散聚合物药物薄膜。目视检查是判断水合条件是否有效的主要方法。虽然大多数药物会在10分钟内溶解，但对于某些药物，额外的孵育时间可通过促进药物与聚合物之间的特定相互作用（疏水，氢键等）产生更好的粒径分布（图2C）。

将胶束溶液以10,000 × g离心2-3分钟，以分离未封装的药物（小丸），并将含有载药胶束的上清液转移至新试管中。
根据药物的POx胶束溶液的稳定性，它们可以在4°C下保存长达数周，也可以冷冻干燥以长期保存。POx胶束的冻干制剂可以轻松地重新分散在去离子水中，而不会降低药物载量和活性。

制备载药POx胶束（放大，mL刻度；适用于载有单药和多药的POx胶束）
请按照步骤A1到A2。使用玻璃瓶来容纳大量储备溶液，并使用圆底（RB）烧瓶混合药物和聚合物溶液。
使用旋转真空蒸发仪蒸发溶剂。根据需要调整水浴的温度。
完成后，薄膜将在RB烧瓶的下半部形成。
用盐水水合薄膜，并在最佳水合温度下将其浸入水浴中所需的时间-通常为10至15分钟。
可以按照步骤A5的方法将胶束溶液分装成小体积并离心。
将制剂冻干以长期保存。

POx胶束的表征
POx胶束主要使用的物理化学表征技术包括用于确定粒径分布的动态光散射（DLS）和用于载药的反相高效液相色谱法。

用于DLS测量的样品制备
在盐水中将胶束稀释10倍。
注意：用于DLS测量POx胶束的典型稀释度为1：2-1：50，对应于0.1 mg / ml至2 mg / ml的药物浓度。

使用0.2微米的尼龙注射器过滤器分离大颗粒。
将过滤后的溶液转移到干净的比色杯中，不要引入气泡。
将比色皿放在样品架中，平衡至少2分钟后，对每个样品进行3次独立测量。
用于HPLC测量的样品前处理
在50/50乙腈（ACN）：水（v / v）的混合物中将胶束样品稀释50倍。
使用0.2微米的注射器过滤器和转移100过滤器的稀释样品μ升到HPLC自动进样器小瓶中。
获得通过gentl摆脱从自动进样瓶中的气泡的Ÿ将其放置在样品瓶盘前攻。
通过以6.25μg/ ml至200μg / ml的浓度范围连续稀释分析物来制备标准液。
必须针对每种药物优化运行设置。
注意：60/40 ACN：水，1毫克/毫升的流速，和10 μ升注射体积是通常对大多数药物的良好起点。用0.1％三氟乙酸加标流动相溶剂有助于锐化色谱峰。确保用于样品的设置与用于标准的设置相同。

数据分析

DLS分析
zeta粒度仪可测量由纳米粒子的布朗运动引起的散射光强度随时间的波动，以估算纳米粒子的流体动力学尺寸。DLS使用两种算法（即累积量分析和分布分析）分析原始数据。累积量分析报告两个值：Z平均值（是粒度分布的平均值）和多分散指数（PDI），类似于方差。PDI值低于0.2表示单分散颗粒。累积量分析还提供了相关图（相关曲线），该相关图报告了来自样品的信号的衰减率。相关图的幅度代表信噪比。分布分析按数量，体积和强度提供了粒度的高斯分布。样品浓度，大聚集体的存在以及DLS比色杯外部的杂质或痕迹都会影响尺寸分布。有关数据解释的更多信息，请访问https://www.malvernpanalytical.com。

图2.（A，D）薄膜，（B，E）水合薄膜和（C，F）DLS体积分布的代表性图像。上图代表使用最佳条件制备的掺入药物的胶束，如单分散体积分布所示，在27 nm附近有一个峰。底部面板代表次优条件，其由浑浊的薄膜和薄膜的不完全水合指示，导致多分散的粒度分布，其峰值在约105 nm处，聚集体的峰值在微米范围内。

注意：DLS数据是从单独的实验中获得的，并不代表图像中所示胶束的尺寸分布，此处仅用于演示目的。

载药量
选择分析物显示最大吸光度的波长，然后对色谱图中的峰进行积分以获得面积，该面积与样品中药物的浓度相对应。样品的保留时间应与标准样品的保留时间进行比较。一旦从标准曲线确定了样品浓度，就可以从以下方程式获取诸如上样效率和上样能力等参数：

液相色谱

LE

M drug ：胶束中掺入的药物量

M赋形剂：配方中聚合物的用量

M药物添加量：最初投放的药物量

致谢

原始工作（Vinod等，2020）由美国国家癌症研究所（NCI）癌症纳米技术联盟（U54CA198999，卡罗来纳州癌症纳米技术卓越中心）资助。

利益争夺

AVK是与本发明主题相关的专利的共同发明人，而AVK和MSP在DelAqua Pharmaceuticals Inc.的共同创始人中感兴趣，其目的是基于POx的药物制剂的商业开发。其他作者没有竞争利益要报告。

参考

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Vinod，N.，Hwang，D.，Azam，SH，Van Swearingen，AED，Wayne，E.，Fussell，SC，Sokolsky-Papkov，M.，Pecot，CV和Kabanov，AV（2020）。TLR 7/8激动剂的高容量聚（2-恶唑啉）制剂可延长在化学敏感性低的肺腺癌转移模型中的生存期。Sci Adv 6（25）：eaba5542。