材料和试剂

1.5 ml管（Eppendorf），室温
过滤嘴（用于移液器和清液器），室温
96孔板（Eppendorf，目录号：0030128672），室温
无核酸酶的水（Ambion，目录号：AM9937），室温
分子生物学用乙醇
WarmStart比色RT-LAMP 2 ×预混液（New England Biolabs，目录号：M1800），-20°C
如表1所示的用于RT-LAMP分析的10 ×引物混合物（Sigma-Aldrich），-20°C

表1.用于RT-LAMP测定的N基因引物。引物序列由Zhang等人设计。（2020）。

姓名

顺序

集中在

10 ×底漆混合物（µM）

基因N-A-F3

TGGCTACTACCGAAGAGCT

2个

基因N-A-B3

TGCAGCATTGTTAGCAGGAT

2个

基因N-A-FIP

TCTGGCCCAGTTCCTAGGTAGTCCAGACGAATTCGTGGTGG

16

基因N-A-BIP

AGACGGCATCATATGGGTTGCACGGGTGCCAATGTGATCT

16

基因N-A-LF

GGACTGAGATCTCTTTCATTTTACCGT

4

基因N-A-LB

ACTGAGGGAGCCTTGAATACA

4

表2中的LAMP测序引物（Sigma-Aldrich），-20°C

表2. LAMP测序引物。完整的表可作为Dao Thi等人的表S4获得。（2020）。[Phos] =磷酸化，[SpcC3] = C3间隔基，N，X，Y表示碱基之一[GATC]（N是随机碱基，而X和Y分别属于用于复用的内联条形码）。

姓名

顺序

Tn5hY-Rd2-Wat-SC3

[Phos] CTGTCTCTTATACACATCT [SpcC3]

P5-UMI-xi5XXX-ME.fw

CGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNNXXXXXXXXXXXXCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG

P5

AATGATACGGCGACCACCGAGATC

P7nxt-GeneN-A-LBrc

GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTGTATTCAAGGCTCCCTCAGAGT

P7-xi7YYY

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATYYYYYYYYYYYYTCTCGTGGGCTCGGAG

光学透明的密封胶（Kisker Biotech，目录号：GK480-OS），室温
铝箔胶密封（Steinbrenner Laborsysteme，目录号：SL-AM0550），室温
可刺穿的铝箔（布鲁克生命科学，目录号：4ti-0566 / 96），室温
200 ng / µl Tn5 （E54K，L372P）转座酶（根据Hennig等人的方法纯化，2018，-80°C）
0.2％SDS溶液（室温）
AMPureXP磁珠（贝克曼库尔特（Beckman Coulter），目录号：A638 81），4°C
NEBNext Q5 HotStart聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0543），-20°C
核苷销凝胶和PCR净化-向上mini试剂盒（马歇雷-Nagel的，目录号：740609），室温下
NEBNext用于Illumina的文库定量试剂盒（New England Biolabs，目录号：E7630），-20°C
[三（羟甲基）甲基氨基]丙烷磺酸（TAPS）
氯化镁2
二甲基甲酰胺（DMF）
新鲜制备的5 ×标记缓冲液（请参见食谱）
注意：所有从Sigma-Aldrich购买的化学品，除非另有说明。

设备

Pipetman L P2L，0.2-2μl （Gilead，目录号：FA10001M）
移液器L P20L，2-20μl（Gilead，目录号：FA10003M）
移液器L P200L，20-200μl（Gilead，目录号：FA10005M）
移液器大号P1000L，100-1 ，000微升（Gilead公司，目录号：FA10006M）
Pipetman L多通道P8 x 20L，2-20μl （Gilead，目录号：FA10009）
清算96 2-20 μ升（Mettler Toledo的，目录号：LIQ-96-20）
Thermocycle r（Biometra，TAdvanced 96 S）
吸光度读取器（Tec an，型号：Infinite M200 / Spark Cyto）
离心机（Eppendorf，型号：5430 R）
台式离心机（Heraeus，型号：Pico 21）
磁力架（6管磁力架； Ambion，目录号：10055）
NextSeq 550机器（Illumina）

程序

图1中显示了描述整个实验过程的示意图。

图1.实验程序概述。（a）可以对纯化或未纯化的临床标本进行RT-LAMP测定，然后使用比色法或LAMP测序读数进行分析。（b）LAMP测序文库制备流程图。

RT-LAMP分析
纯化样品的RT-LAMP测定

根据制造商的协议从临床样本中分离RNA。
通过加入6.25装配在1.5ml Eppendorf管RT-LAMP主混合物μ 2的升×主混合物，1.25 μ 10升×引物混合物，和4 μ每个反应升无核酸酶水。
涡旋并旋转下来。
分发11.5 μ主混合物的升成的96孔每孔用多通道移液器板上。
加入1 μ分离的RNA的升与主混合物井。
用光学透明的粘合剂密封的密封板。
短暂地旋转板。
在热循环仪（盖加热到75°C）中于65°C孵育30分钟。

未纯化样品的RT-LAMP测定

对于热拭子至RT-LAMP分析，将50μl临床样品吸移到96孔板中，并用可刺穿的箔密封。
在PCR循环仪中将板在96孔板中于95°C加热5分钟（盖子加热至105°C）。
冷却，短暂旋转，然后将其放在冰上。
通过加入10装配在1.5ml Eppendorf管RT-LAMP主混合物μ 2的升×主混合物，2 μ的10升×引物混合物，和7 μ每个反应升无核酸酶水。
涡旋并旋转下来。
分发19 μ主混合物的升成的96孔每孔用多通道移液器板。
对于直接拭子到RT-LAMP分析，将1μl临床样品直接用预混液吸进孔中。
对于热测定，将1μl准备好的标本（1-3）移入带有预混液的孔中。
用光学透明的粘合剂密封的密封板。
短暂地旋转板。
在热循环仪中（盖加热到75°C）在65°C下孵育30分钟。

RT-LAMP分析
比色读数

将96孔板冷却至4°C，然后短暂旋转。
将96孔板放入吸光度读数器中。
测量在434 nm和560 nm处的吸光度。

LAMP测序

（所有浓度均以反应中的最终浓度给出。）

通过将单个带条形码的适配器（P5-UMI-xi5XXX-ME.fw）与引物Tn5hY-Rd2-Wat-SC3混合，以每个引物的终浓度25μM在5μMTris-HCl（pH 8 .0 ）中制备转座子适配器使用Liquidator在96孔PCR板中扩增。加热至99 °C，持续5分钟，然后使用热循环仪在15分钟内将其冷却至20°C，以使引物缓慢退火。
使用Liquidator在96孔PCR板中的50 mM Tris-HCl（pH 7.5）中，将步骤1中的1.25μM退火接头将转座酶混合至终浓度为100 ng /μl。通过在23°C的热循环仪中将反应孵育1小时来组装转座子。
根据指示的成分新鲜制备5 ×标记缓冲液。
每孔英里×1.2与1.5微升加载的转座，1.12微升5微升RT-LAMP产物（相当于〜200纳克DNA）的× TA gmentation从步骤3和1.8μ缓冲升水组装在96转座子反应带有Liquidator的PCR板。在55°C的热循环仪中将反应孵育10分钟。
通过每孔添加1.13 µl 0.2％SDS终止标记反应，并在室温下孵育10分钟。每个板将反应合并为一个单一反应。
通过使用以下两步AMPure XP珠操作规程（针对从一个板中合并的反应编写），对大约300到600 bp的片段进行大小选择。
将50 µl合并的反应与50 µl的水混合。
通过将55 µl AMPure XP珠粒添加到稀释的样品中来除去较大的碎片。通过移液十次混合，并在室温下孵育5分钟。通过将其放在磁力架上约5分钟，将珠子与上清液分开。使用移液器将上清液转移到新的eppendorf管中，而不转移珠子。
通过向上清液中加入25 µl新鲜的珠子来去除小碎片。通过移液十次混合，并在室温下孵育5分钟。通过将其放在磁力架上约5分钟，将珠子与上清液分开。使用移液器丢弃含有小碎片的上清液，而不会干扰珠粒。
用乙醇洗涤两次，将与小珠结合的DNA洗净。为此，将200 µl乙醇（80％）添加到珠子中，通过移液十次进行混合，然后在室温下孵育5分钟。通过将其放在磁力架上约5分钟，将珠子与乙醇分开。重复此步骤进行第二次清洗。让珠子风干10分钟。
加入10μl5 mM Tris-HCl（pH 8.5），从珠子上洗脱DNA，在室温下孵育5分钟，并在磁力架上分离约5分钟。
使用来自步骤6的1 µl大小选择的洗脱液作为模板，每块板进行一个PCR反应。根据制造商的说明，使用NEBNext Q5 HotStart聚合酶用RT-LAMP特异性和Tn5-adapter特异性引物（P7nxt-GeneN-A-LBrc和P7-xi7YYY，P5.fw）准备PCR反应。使用以下PCR条件通过热循环仪进行扩增：在62°C进行两个循环进行退火和90 s延长，然后在65°C进行两个循环进行退火和90 s延长，然后在72°C进行90 s退火进行13个循环。伸长。
合并所有PCR反应，并对大约400至550 bp的片段进行第二次大小选择：在2％琼脂糖/ Tris-醋酸盐-EDTA凝胶上运行20％的PCR反应，切下泳道的相应部分并使用根据制造商的凝胶纯化套件。
使用例如基于qPCR的文库定量试剂盒对文库进行定量。
根据制造商的说明，在NextSeq 550机器上执行自定义Illumina测序，使用20％phiX尖峰和136个循环进行首次读取，使用11个循环读取11 nt长的板索引（i7）和20循环读取11 nt长的阱指数（i5）和9 nt长的UMI。

数据分析

比色RT-LAMP分析
比色RT-LAMP测定的结果可以用肉眼判断。在65°C下孵育30分钟后，从粉红色变为橙色或黄色的明显颜色变化被认为是SARS-CoV-2阳性 ℃。30分钟后的颜色变化可能是由虚假的扩增产物引起的，因此被评为阴性。为了进一步验证，RT-LAMP产物可通过凝胶电泳进行分析，并应产生如先前所述的独特的条带模式（Dao Thi等人，2020，请参见此处的图1）。

用酶标仪分析测定值时，从434 nm（ΔOD）中减去560 nm的吸光度。在65 °C孵育30分钟后，将ΔOD值> 0.3视为SARS-CoV-2阳性。对于热拭子到RT-LAMP的检测，可以通过减去在65 °C下孵育30分钟和10分钟的时间点ΔOD值之间的差异来改善此读数。

LAMP测序分析
首先需要使用工作流将原始NGS结果（单端fastq文件）转换为计数表，该工作流可从GitHub（https://github.com/anders-biostat/LAMP-Paper-Figures/tree/master下载）/ LAMP-sequencing_raw_read_processing）。此处总结了运行此工作流程的所有必需软件。各个处理步骤可以顺序地从该目录内的脚本00 -run_workflow.sh”运行我们编的用于说明的示例文件‘LAMP-sequencing_raw_sample100k.fastq.gz’。为了使用不同的数据集运行工作流，需要相应地修改“ 00-run_workflow.sh”中的路径名。结果为两个文件（“ counts.tsv”和“ counts.Rda”），可用于后续分析。例如，此GitHub存储库中还提供了用于为我们的RT-LAMP研究生成相应数字的计数表（Dao Thi等人，2020年）。

笔记

应对SARS-CoV-2原始临床标本进行的所有工作均应在生物安全等级为2的机柜中进行，直至灭活。我们发现，纯化和未纯化的咽拭子标本以及唾液标本均与RT-LAMP分析兼容。其他类型的标本也必须进行测试。

为了避免污染和RNA降解，所有步骤均使用滤嘴和戴手套进行。另外，尽可能将临床标本放在冰上以防止RNA降解。应当在不同的工作场所使用不同的移液器吸取预混液和测试样品。理想情况下，执行方案的人员应具有分子生物学经验。使用RT-LAMP试剂时的其他重要注意事项在我们先前发表的工作的补充材料中列出（Dao Thi等人，2020年）。

菜谱

5 ×标签缓冲
（总是准备新鲜。）

1体积的10 × TAPS缓冲液（100 mM [三（羟甲基）甲基氨基]丙烷磺酸（TAPS）（pH 8.5），50 mM MgCl 2 ）

1体积的100％（v / v）二甲基甲酰胺（DMF）

致谢

该协议是根据我们先前发布的原始方法（Dao Thi等人，2020）修改而来的。KH由Deutsche Forschungsgemeinschaft（DFG；授权号KN498 / 11-1）对MKVLDT的资助提供支持，并得到Chica和Heinz Schaller基金会的支持。我们要感谢用于生产Tn5酶的EMBL蛋白表达和纯化工具。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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