材料和试剂

1. 15毫升锥形管
2. 2毫升Eppendorf管
3. 1.5毫升Eppendorf管
4. P ipette提示
5. 96孔板（Thermo Scientific，目录号：249935）
6. 10日龄P PAG1 -gPAG1-FM转基因幼苗
7.液氮
8. Tris Base（Fisher Scientific，目录号：BP152-10）
9.十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
10. NaCl （Fisher Scientific，目录号：BP358-10）
11. MgCl 2 （西格玛奥德里奇，目录号：M9272）
12. EDTA（Fisher Scientific，目录号：BP120-1）
13.二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：43817）
14.甘油（Sigma-Aldrich，目录号：V900122）
15. PMSF（Sigma-Aldrich，目录号：78830）
16. Miracloth （Calbiochem ，目录号：475855）
17.抗FLAG ® M2磁珠（Sigma-Aldrich公司，目录号：M8823）
18. 3 × FLAG肽（DYKDDDDK）（Sigma-Aldrich，目录号：F4799）
19.防国旗（Sigma-Aldrich，目录号：F1804）
20.抗Myc （Sigma-Aldrich，目录号：C3956）
21. Anti-SE（Agrisera ，目录号：AS09 532A）
22. DMSO（Sigma-Aldrich，目录编号：D4540）
23. MG132 （Calbiochem ，目录号：474787）
24.琥珀酰-Leu-Leu-Val-Tyr-7-酰胺基-4-甲基香豆素（Suc -LLVY-AMC）（Sigma-Aldrich，目录号：S6510）
25. SilverQuest TM染色试剂盒（Invitrogen，目录号：LC6070）
26. Bradford试剂（Sigma-Aldrich，目录号：B6916）
27. 2 × SDS-PAGE加载缓冲区（请参见食谱）
28.提取缓冲液（请参阅食谱）
29.洗涤缓冲液（请参阅食谱）
30.反应缓冲液（请参见食谱）

设备

-80°C冷冻室
P ipettes
ç entrifuge
Dyna Mag TM -2（Invitrogen，代码：12321D）
PolyATtract ®系统1000磁性分离架（Promega公司制，型号：Z5410）
坚固耐用的转子（Glas -Col，型号：099A RD4512）
Thermomixer R（Eppendorf，型号：022679810）
微板分光光度计（PerkinElmer公司，米Odel等：VICTOR TM X3）
凝胶成像系统（Bio-Rad，型号：Universal Hood II）
涡旋混合器（VWR，型号945300）

程序

注意：请参见图1以获得以下步骤的示意图。

图1.过程示意图

制备10天大的P PAG1 -gPAG1-FM稳定转基因植物（Li等，2020）
变换二元载体pBA002a-P PAG1 -gPAG1-FM成的Col-0中生态型Arabidposis拟南芥通过浸花转化法（张等人，2006 ），以生成P PAG1 -gPAG1-FM稳定的转基因植物。
STER ilize并放置来自表达稳定的转基因系的种子P PAG1 -gPAG1-FM的MS培养基上（张等人。，2006），并通过在4℃下使它们保持在黑暗中3天种子分层。
发芽种子，并在22 °C下12 h光照12 h暗循环下使幼苗生长10天。
收集5 g 1个0天大的幼苗，在液氮中研磨成细粉，并在-80°C下保存。

20S蛋白酶体的亲和纯化（Book等，2010 ）
将5 g粉末样品重悬于8 ml提取缓冲液中。
保持所述样品在冰上为8分钟，并同时均匀它以及与涡旋混合器2-3次。
离心在4℃下15分钟，完全溶解蛋白提取物在21 ，00 0 ×克和则f ILTER蛋白质提取物通过的预先润湿的一个层的Miracloth 。
过滤后，在4℃下再次离心清除蛋白提取物在15分钟21 ，00 0 ×克。
收集的上清液小号TEP B4到预-冷却的15毫升锥形管中并保持在冰上。
准备抗-FLAG珠，在离心步骤中进行免疫沉淀。加入200微升床体积抗FLAG ® M2磁珠（对于5克植物组织）到一个新的2毫升Eppendorf管中于冰上。
用600μl的0.1 M甘氨酸HCl （pH 3.0）洗涤磁性Flag-beads以去除未结合的抗体。
轻轻颠倒试管，将混合物留在试管中1.5分钟。
立即重新平衡的抗Flag ® M2的磁珠用1毫升缓冲液（50米的Tris -盐酸，150毫氯化钠，pH 8.0）中。
除去平衡缓冲液，然后使用DynaMag TM -2用1 ml提取缓冲液洗涤磁珠3次。
完全除去提取缓冲液，然后向管中添加200μl新的提取缓冲液，以重新悬浮珠子。
将200μl平衡的磁珠添加到样品中。
然后使用坚固的旋转器将15 ml试管在4°C下旋转30分钟。
在的端小号TEP B13，制备3 × ˚F LAG用于从所述的Flag-4Myc标记的PAG1的洗脱肽溶液抗FLAG ® M2磁珠。
添加35微升3 × ˚F LAG洗脱缓冲液原液（4毫克/毫升）到245微升的提取缓冲液，使最终浓度为500ng /μ升3 × ˚F LAG pepti德。拌匀，放在冰上。
步骤B13完成后，加载上的15ml管中PolyATtract ®系统1000磁性分离架几秒钟，然后慢慢倒入上清至垃圾桶。
用6 ml洗涤缓冲液重悬珠子，并将所有珠子转移到新的干净的预冷1 5 ml管中。
在4°C下用6 ml洗涤缓冲液洗涤磁珠3次，每次3次，每次使用坚固的旋转器，持续5分钟。
洗涤3次后，将2 ml提取缓冲液添加到15 ml管中，以重新悬浮珠子。
小心地将所有珠子转移到干净的2 ml Eppendorf管中。
将2 ml试管装入DynaMag TM -2，然后除去提取缓冲液。
加入250微升3 × FLAG在4℃下的洗脱缓冲液进2毫升管，孵育管30分钟与1 ，使用Thermomixer中R. 200rpm振荡
将2 ml试管装入DynaMag TM -2。转移ELU一个TES到1.5毫升Eppendorf管并储存于- 80℃。

纯化蛋白酶体的银染
加入20微升2 × SDS - PAGE上样缓冲液到20微升的洗脱样品中，并在95煮沸℃8分钟。
负载20微升洗脱的样品到两个10％SDS-PAGE凝胶上并受到电泳2.5小时，在80 V.
使用SilverQue st TM染色试剂盒对其中一种凝胶进行染色（图2）。

˚F igure的2.代表银染色图像免疫沉淀的PAG1 -含FM-20S在SDS解决- PAGE。使用进行了免疫沉淀的抗FLAG ® M2磁珠从制备的蛋白提取物P PAG1 - gPAG1 - FM转基因幼苗（gPAG1-FM分别从）或Col-0中（对照）。括号表示20S核心蛋白酶体（CP）的亚基。

做W¯¯西部时代印迹分析使用抗其他凝胶的Myc或抗Flag抗体。
使用gel成像文档系统拍摄银染凝胶的照片。

蛋白酶体活性测定（Yang等，2004 ; Han等，2019 ）
制备含有50反应缓冲液μM的Suc -LLVY-AMC底物，其被广泛用作荧光底物用于测定胰凝乳蛋白酶 –类似于20S蛋白酶体的活性（Reidlinger等，1997）。
将10μl洗脱的样品添加到90μl反应缓冲液中，充分混合并添加到96孔板中。
将10μl提取缓冲液添加到90μl反应缓冲液中作为空白对照，并将每个反应重复3次。
孵育反应混合物在37℃下为20，4 0，60，80，100，120分钟。
使用Microplate分光光度计，通过380 nm激发波长和440 nm发射波长的荧光监测所指示时间释放的AMC的荧光读数。
使用游离AMC作为标准品，以每1μl反应混合物的相对荧光单位绘制蛋白酶体活性。
注意：您还可以使用其他表示形式来显示数据，例如每10μl洗脱样品的相对荧光单位。

体外20S蛋白酶体降解试验（Hsieh等，2015 ）
准备用于测试的纯化蛋白。
通过Bradford方法估算了纯化的蛋白酶体和测试蛋白的浓度（Bradford，1976）。（Mothod ：https : //www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/b6916bul.pdf）。
如下在冰上制备体外20S蛋白酶体-衰变反应混合物（表1）：

Ť能够1.我Ñ体外20蛋白酶体降解反应系统

注意：Ť他相当于在反应混合物中的纯化的20S蛋白酶和测试蛋白质的只是一个参考，该反应条件需要小号为不同的蛋白质进行优化。

然后将混合物均匀分配到5个PCR或1.5 ml试管中，并在22 °C下孵育。
该反应将通过添加40停止微升2 × SDS-PAG在随后所指示的时间（0，5，10，20，30分钟）电子样缓冲液W¯¯西部时代印迹分析（图3）。

˚F igure的3.一种代表性图像体外20S蛋白酶体介导的蛋白质降解测定。重组的6xHis - SUMO - SE蛋白与PAG1孵育- FM免疫沉淀从P PAG1 - gPAG1 - FM的转基因植物或对照IP，分别从Col-0中。以指定的时间间隔停止反应混合物。用抗SE抗体探测6xHis-SE的Western印迹法。

数据分析

银染色和体外20S蛋白酶体降解试验的代表性图像也可以参考Li等人的图4c和4d 。（2020 ）。蛋白酶体活性的代表性数据可以参考Li等人的扩展数据图7b 。（2020年）。

笔记

在STE p乙，全部为纯化所需的缓冲液和管应预先-在使用之前冷却到4℃。
在步骤B中，Miracloth被提取缓冲液预湿。
在步骤B中，将最终洗脱样品分成几支试管，以避免将来使用时冻融样品，因为冻融样品会影响蛋白酶体的活性。
在步骤E中，根据测试蛋白质优化体外降解条件，包括pH，降解时间，降解温度以及20S蛋白酶体和测试蛋白质的浓度。
在步骤E中，快速准备反应混合物并将其均匀分布并保持在冰上。确保所有时间点都开始同时做出反应。

菜谱

2 × SDS-PAGE加载缓冲区
0.125 mM的Tris-HCl ，pH 6.8

20％甘油

4％SDS

20万DTT

0.02％溴酚蓝

提取缓冲液
50 mM的Tris-HCl ，pH 7.5

25毫米氯化钠

2毫米氯化镁2

1毫米EDTA

5％甘油

2 mM PMSF（在使用前添加）

洗涤缓冲液
50 mM的Tris-HCl ，pH 7.5

800毫米氯化钠

2毫米氯化镁2

1毫米EDTA

5％甘油

2 mM PMSF（在使用前添加）

反应缓冲液
50 mM的Tris-HCl ，pH 7.5

25毫米氯化钠

2毫米氯化镁2

1毫米EDTA

2 mM二硫苏糖醇（DTT）

5％甘油

50 μM的Suc -LLVY-AMC底物

致谢

NIH（授予GM127742）对XZ的资助支持了这项工作。此处介绍的协议是根据以前的出版物（Yang等，2004；Zhang等，2006 ；Book等，2010 ；Hsieh等）开发的。。，2015年;汉等人，2019 ），并在我们最近的工作优化（李等人，2020 ）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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Han，JJ，Yang，X.，Wang，Q.，Tang，L.，Yu，F.，Huang，X.，et al。（2019）。β5亚基对于完整的26S蛋白酶体组装对于在盐胁迫下特异性促进植物自养生长至关重要。新植物221 （3）：1359-1368。
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