材料和试剂

1.如Ramirez- R ios等人已充分描述的那样，制备微管蛋白，Atto-5 65标记的微管蛋白和生物素化的微管蛋白。（2017年）。在液氮中储存长达1年

2.盖玻片26 × 76 mm＃1（VWR ，目录号：630-2910）

3.双面胶带预切为70μm厚，宽3毫米（LIMA ç ompany，目录号码：0000P70PC3003）

4.西里贡蜡板（VWR，MODU140013）

5. 1.5毫升Eppendorf管（Fisher Scientific，目录号：11558232）

6. 0.5毫升Eppendorf管（Fisher Scientific，目录号：10318661）

7.培养皿（Greiner Bio-One，目录号：663102）

8.聚碳酸酯离心管（贝克曼，目录号：343775）

9. 0.22 µm过滤器（Merck Millipore SLGP033RS）

10.硅烷-PEG（MW 30k）（Creative PEG-Works ，目录号：PSB-2014）

11.硅烷-PEG-生物素（MW 3,400）（LaysanBio ，目录号：BIOTIN-PEF-SIL，MW 3,400）

12. NeutrAvidin（T hermoScientific，目录号：31000）

13. PLL20K-G35-PEG2K（PLL-g-PEG）（詹肯，目录号：13022755）

14. Pluronic F-127（Sigma- A ldrich，目录号：P2443）

15.牛血清白蛋白（BSA）（Sigma- A ldrich，目录号：A7030）

16.丙酮100％（VWR，目录号：20066.321）

17. 96％乙醇（VWR，目录号：20823362）

18. Hellmanex III（Sigma - Aldrich，目录号：Z805939-1EA）

19.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma - Aldrich，目录号：P4417）

20. 1,4-哌嗪二乙烷磺酸（PIPES）（Sigma - Aldrich，目录号：P6757）

21.氢氧化钾（KOH）（Sigma - Aldrich，目录号：484016）

22.氯化钾（KCl）（Sigma - Aldrich，目录号：P9541）

23.乙二醇-双（2-氨基乙基醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（Sigma - Aldrich，目录号：E3889）

24.氯化镁（MgCl 2 ）（Sigma - Aldrich，目录号：2670）

25.氢氧化钠（Carlo Erba，目录号：480507）

26. DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma - Aldrich，目录号：D0632）

27.鸟苷5'-三磷酸（GTP）（Sigma - Aldrich，目录号：G8877）

28.甲基纤维素1,500 cP（Sigma - Aldrich，目录号：M0387）

29. GMPCPP（Euromedex，JE-NU-405S）

30. HEPES（Sigma - Aldric h ，目录号：H3375）

31.葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）

32.葡萄糖氧化酶（Sigma-Aldrich，目录号：G6766-10KU）

33.过氧化氢酶（Sigma-Aldrich，目录号：C9322-1G）

34.钻石铅笔（琼脂小号系统求解，目录号：甲GT5347）

35.戊二醛溶液25％（Sigma - Aldrich，目录号：G5882）

36.清洁氮气流（液化空气）

37.液氮（液化空气）

38. 5 × BRB80（请参阅食谱）

39. BSA 10％（请参阅食谱）

40.中性核苷（参见食谱）

41. DTT ，200 mM （请参阅食谱）

42. KCl ，500 mM （请参阅食谱）

43. PLL-PEG （请参阅食谱）

44.硅烷-PEG或硅烷-PEG-生物素（请参见食谱）

45. GTP ，20 mM （请参阅食谱）

46.葡萄糖，450毫克/毫升（请参阅食谱）

47.脱氧混合物（过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶）（请参阅食谱）

48. NaOH ，1M （请参阅食谱）

49. BSA 1％/ BRB80 （请参阅食谱）

50.甲基纤维素1 ，500厘泊（见配方）

51. HEPES ，10 mM （请参阅食谱）

52.普朗尼克F27 ，10％（见配方）

53. PBS （请参阅食谱）

54.中性亲和素储备溶液（请参阅食谱）

55.红色微管蛋白混合物（请参阅食谱）

56.成像缓冲液（请参见食谱）

设备

带有PSF聚焦的Eclipse Ti倒置显微镜（Nikon）
带加热物镜（Okolab）的Apochromat 100 ×/ 1.49 NA油浸物镜（Nikon）
温度室（Technico Plast）
Ilas2 TIRF系统（Roper Scientific）
冷却的带电耦合设备相机（Evolve 512，光度法）
温度平台控制器（Linkam Scientific）
LSM 710共焦（蔡司）Airyscan
Plan Apochromat 100 × /1.4 NA油浸物镜（Zeiss）
超速离心机（Bekman Coulter Optima，型号Max-XP，目录号：393315）
转子（Bekman ，型号：TLA100-1 ，目录号：343837）
等离子清洁剂FEMTO Diener Electric（德国）与真空泵Trivac D2.5E Oerliken（德国）连接
超声仪（Elmasonic S30，埃尔马，德国）
玻璃染色皿和托盘（VWR，目录号：MARI4200004）
玻璃显微镜用塑料盒（任何品牌）
钻石笔（牛津仪器（Oxford Instruments），目录号：T5347）
镊子（D utscher ，目录号s ：076100和005093）
无粉手套（任何品牌）
水浴（任何品牌）

软件

7.8.5的MetaMorph软件（Molecular d evices，https://www.moleculardevices.com）
Zen Black 2.1（蔡司）

程序

流动室准备
注意：此程序改编自Portran等。（2013 ）和L esli e等。（2013年）。盖玻片用于制作灌注腔的两侧。用气流吹干时，用镊子或用边缘未磨细的手套用手操作防护玻璃，以免损坏其表面超过1厘米。

玻璃清洁
将盖玻片浸入装有200-250 ml丙酮的干净玻璃染色皿（105 × 85 × 70 mm）中，并在扫频模式下超声处理30分钟。
注意：制作10个流通室需要6个防护玻璃罩，但是在操作过程中可能会发生玻璃破损的情况，因此建议您多加一些防护玻璃罩。

更换丙酮，并在轨道摇动（80 rpm）下再孵育30分钟。
注意：第二个浴槽中的丙酮可在下一个清洁程序的第一个浴槽中回收。

用乙醇孵育15分钟，然后用去离子滤水冲洗10次。
孵育2小时在预热（60 ℃）2％（V / V）Hellmanex在定轨振荡器（80 RPM），吨母鸡漂洗10次与去离子过滤水。
在1 M NaOH溶液中超声处理15分钟。
用去离子过滤水冲洗10次。
在乙醇中超声处理15分钟，然后在大量（2 × 2 L）去离子过滤水中冲洗每张盖玻片10次。
用干净的空气流（氮气）干燥防护玻璃。
将玻璃粉分配到两个干净，干燥的玻璃染色托盘中，以进行活化和硅烷化（请参阅下面的下一章）。
注意：使用5个硅烷-PEG-生物素涂层玻璃和1个硅烷-PEG涂层玻璃制备10个灌注室（请参阅下面的第3段）。

玻璃活化和硅烷化
等离子在0.7毫巴的压力下以最大功率的80％激活眼镜3分钟。
将玻璃杯快速浸入硅烷-PEG-生物素或硅烷-PEG溶液中，并在定轨振荡器上孵育过夜。
注意：确定含有硅烷-PEG-生物素或硅烷-PEG的玻璃染色皿，以免出错。

恢复的涂层溶液（它们可以被重复使用好几个月，只要它们保持清洁），并用乙醇（图替换它们URE 1A）。
清洗每个涂层载玻片在含有乙醇的烧杯中（图10倍URE 1B）和10倍大的体积（2 ×水（图2L）URE 1C，1 d）。
注意：我们建议先洗硅烷-PEG玻片，然后再洗涤硅烷-PEG-生物素，以避免潜在的硅烷-PEG-生物素与硅烷-PEG玻片结合。

图1.清洗带涂层的载玻片。在A中，我们将载玻片涂在乙醇中。B含有乙醇。C和D含有去离子过滤水。含有去离子过滤水的E用于干燥前保持漂洗过的载玻片。

用氮气流干燥防护玻璃。
将硅烷化的层状胶条在4°C的塑料盒中保存，最多可保存一周。
流动室的构造
注意：在处理硅烷化的盖玻片时，请确保腔室内的表面保持清洁且未触碰。

传送1个硅烷-PEG-生物素涂覆的滑动到一个干净的培养皿中，并使用金刚石笔，切玻璃分为四个部分（约19/26毫米）（图URE小号2A，2 B）。
注意：用金刚石铅笔切割时，培养皿的底部弯曲会导致滑动断裂。为了避免THI S，我们使用一个薄的塑料，我们把培养皿（图下URE 2A）。

同样，将涂有硅烷PEG的玻片转移到另一个培养皿中，并将其切成7个约11毫米宽的部分。丢弃这两个端部和切断其余的一半，使14 11 × 13毫米件（图URES 2C，2 d）。

图2.切割镀膜的幻灯片。一。˚F ROM从左到右，金刚石铅笔，塑料，以避免破坏含硅烷的PEG-生物素滑动，镊子，陪替氏培养皿。乙。Ť他幻灯片是切四个等份。Ç 。将硅烷-PEG玻片切成7份。d 。Ë ACH部分被削减了一半。

地方的两片双面粘合带，除了5mm时，在一块硅烷-PEG-生物素涂覆的盖玻片（图的中心URE 3A）。
带一条PEG-硅烷涂布的胶带（该腔室的体积为约5μl）（图2的两片上述带状URE 3B）。
注意：小心地将胶带上的硅烷-PEG涂层条按在胶带上，以确保正确密封。你

可能轻轻除去过量的胶带（图URE 3D）。

图3.流动槽的构造。一。将一块硅烷-PEG-生物素放入培养皿中。乙。一个dhesive胶带粘在幻灯片。Ç 。P rotective塑料胶带以上被去除，硅烷-PEG滑动的一个片放置在磁带上。d 。Ë XC essive带切断除去。

GMPCCP种子的制备
注意：GMPCPP种子倾向于在低温下解聚，请在整个过程中尽量使其变热。

1.以1：1的摩尔比制备新鲜融化的ATTO-565微管蛋白和生物素化微管蛋白的混合物，使BRB80中的终浓度为10 µM微管蛋白，并添加0.5 mM GMPCPP。

注意：通常，至少500次实验需要300 µl种子。

2.将混合物在35℃的水浴中放置1小时以允许聚合。

3.使用TLA 100转子在35°C下旋转5分钟，使GMPCPP种子旋转t 130,000 × g 。

4.弃去上清液，并用2 × 100 µl预热的BRB80轻轻冲洗。

注意：离心后，沉淀物中可见红色种子。避免在洗涤步骤中重悬沉淀。

5.轻轻地将沉淀重悬在预热的含有1 mM GMPCPP的BR B80中。

注意：重悬可能需要一些时间。对于300 µl的聚合溶液，将沉淀重新悬浮在500 µl中。

6.在0.5 ml Eppendorf中以1-2 µl等分，然后在液氮中快速冷冻。

7.储存在液氮中最多一年。

微管聚合和固定
注意：灌注是通过将溶液加载到腔室的一侧，同时用一张纸擦拭另一侧来进行的（图4）。

图4.流动室中的灌注。从A到D是将所需溶液灌注到流动室中的顺序图像。

GMPCPP种子固定在流动室中
在流动室中灌注10 µl Neutravidin（25 µg / ml，在1％（w / v）BSA / BRB80中的溶液中），等待2分钟。
灌注30 µl PLL-PEG（在10 mM HEPES中，0.1 mg / ml，pH 7.4）并等待30 s。
通过在1％（w / v）BSA / BRB80中灌注60 µl 1％（w / v）普朗尼克来洗涤。
通过用70 µl 1％（w / v）BSA / BRB80灌注2次进行洗涤。
快速解冻GMPCPP种子，并用1％（w / v）BSA / BRB80稀释。
注意：根据需要调整种子稀释度，通常从1/100到1/500稀释度开始。

灌注30 µl稀释的GMPCPP种子，使其在室温下粘附5分钟。
用70 µl 1％（w / v）BSA / BRB80将未结合的种子洗涤3次。
微管聚合和固定
灌注新鲜制备的聚合混合物（配方19）。
注意：如果需要，可调整微管蛋白/相关蛋白的浓度。它取决于相关目的蛋白的亲和力和作用。对于微管蛋白，浓度从5到20 µM是一个好的开始，而从5 nM到500 nM的相关蛋白应该是有益的。

将流动室放置在水饱和的温暖环境中（32-35°C），以避免MT聚合干燥（通常至少30分钟）。
聚合后，通过轻轻甲基灌注大约30微升0.1％的MT修复纤维素1 ，500厘泊，0.5％（V / V）戊二醛/ BRB80。
注意：关键步骤是快速灌注会改变MT结构。把室内insid E中的切赫我d ISH（你可以用胶带，以防止其移动）。然后，稍微倾斜培养皿，并逐滴添加位于腔室顶部的固定缓冲液。溶液将缓慢流向腔室。您可以使用吸墨纸清洁多余的液体。固定缓冲液应在腔室内至少3分钟以正确固定。即使固定发生迅速，稀释也可能引起MT解聚。为了克服此问题，使用MT稳定如紫杉酚化合物（紫杉醇影响小号MT持续长度）或生长MT更长。

用50μl0.1％洗涤固定缓冲液（V / V）甲基纤维素1 ，500厘泊/ BRB80。
灌注成像缓冲液（BRB80补充有0.1％甲基纤维素1 ，500厘泊，2mg / ml的葡萄糖，1mg / ml的葡萄糖氧化酶和150微克/毫升过氧化氢酶）。
用硅蜡密封流室。
注意：应在一周之内对腔室进行成像。

微管成像
对照固定：TIRF显微镜
注意：要估计固定过程对样品的影响，有必要在固定之前/之后比较样品。

将流动室放在倒置显微镜上。
注意：对于在固定之前进行成像，请将载物台的温度设置为35°C，以避免MT发生解聚。

调整激光强度，曝光和聚焦以观察微管。
获取图像两者之前（图URE 5A）和固定后（图URE 5B）的样品。

图5.固定过程不会改变螺旋微管的结构。固定前（A）和之后（B）的螺旋MT的TIRFM图像。MTs从含有12 µM微管蛋白（9：1非标记微管蛋白：ATTO-565标记微管蛋白）和200 nM MAP6-N-GFP的GMPCPP种子中生长。在该浓度下，MAP6-N-GFP诱导小号微管卷取。比例尺：5 µm。

使用Airyscan处理的共焦成像
将腔室放置在物镜上方。
调整聚焦和激光强度以观察MT。
执行采集（z堆栈系列使用220 nm步长）。
使用Zen内置的Airyscan处理。借助Airyscan处理螺旋MT的TIRF与共聚焦成像，请参见图6。图7显示了在具有特定形状的MT上执行z堆栈的优势。
使用Zen Blue分析图像。

图6.使用TIRFM或共聚焦Airescan观察螺旋MT。MT的生长如图URE 5和使用所描述的协议固定的。A.使用TIRF显微镜观察到的固定螺旋MT。B.使用共聚焦显微镜观察到的固定螺旋MT的z投影，然后进行Airyscan处理。比例尺：5 µm。

图7.使用共焦成像和Airyscan处理观察到的螺旋MT的z- stack。相同的MT的Z堆叠图像如在图6乙，用的各平面之间220nm处的步骤。比例尺：5 µm。

菜谱

除非另有说明，否则所有溶液均在指定的温度下保存，并且随时间推移没有任何可观察到的劣化。等分大多数溶液以避免冻融循环。

5 × BRB80
36.28克PIPES

1.5 ml的MgCl 2 （1 M ）

570.6毫克EGTA

溶于250毫升去离子水中，并用KOH调节pH到6.85

添加去离子水至300 ml，滤液，等分试样（1 ml和50 ml）并储存在-20°C

注意：5 × BRB80用于制备BRB80溶液，并将反应的最终浓度调整为1 × BRB80。稀释5倍后，pH降至6.75。

BSA 10％
在20 ml PBS中溶解2 g BSA

过滤并在-20°C下储存长达1年

中性苷
将10 mg Neutravidine溶于10 ml H 2 O，等分试样（5和100 µl）中，并储存在-20°C下

实验前，用195 µl 1％BSA / BRB80（终浓度25 µg / ml）预先稀释5 µl。

DTT ，200毫米
将617 mg DTT粉末溶于4 ml去离子H 2 O中，滤液，等分试样并储存在-20°C下

使用当天，用H 2 O或BRB80稀释1/5 。每天使用后丢弃等分试样

氯化钾，500mM的
将1 g KCl溶于50 ml去离子H 2 O（-20°C）滤液中，等分并保存在-20°C

锁相环
在氩气中分装已知重量的粉末（20-30毫克），并储存在-20°C下。
要制成储备溶液，请将粉末以1 mg / ml的浓度溶于10 mM HEPES （pH 7.4 ）中，制成50 µl等分试样并在-20°C下储存。
使用当天，用450 µl的10 mM HEPES （pH 7.4 ）稀释一份50 µl的等分试样。稀释的PLL-PEG可以在4 °C下保存1周。
硅烷-PEG或硅烷-PEG-生物素
笔记：

称重硅烷-PEG或硅烷-PEG-生物素粉末，并在氩气下在每支eppendorf管中以200mg等分。将试管用石蜡膜密封，并在-20°C下保存。
硅烷-PEG和硅烷-PEG-生物素溶液必须保持无水且在黑暗中。
在200毫升溶解200毫克粉末的96％乙醇加0.4毫升的37％的HCl 。
要溶解硅烷-PEG溶液，请在水浴中加热至50 °C。将溶液保存在玻璃瓶中。
硅烷-PEG和硅烷-PEG-生物素溶液在室温下于黑暗中保存长达4个月或约15次涂层。如果实验在背景中看起来很脏，请使用新鲜制备的涂料溶液。
GTP 20毫米
将250 mg GTP溶于5 ml H 2 O

分装并储存在-20°C

使用前，将原液在H 2 O或BRB80中稀释至20 mM

葡萄糖450 mg / ml
将2.250克葡萄糖溶解在5毫升BRB80中

滤液，等分试样并储存在-80°C

使用当天在BRB80中稀释1/10并保持在冰上

脱氧混合物（过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶）
将35 mg过氧化氢酶和250 mg葡萄糖氧化酶溶解在10 ml BRB80中

过滤，制成25 µl等分试样，在液氮中冷冻并储存于-80°C

每天使用后丢弃解冻的等分试样

的NaOH ，1M的
将8 g NaOH溶于200 ml去离子水中

每次使用后丢弃

BSA 1％/ BRB80
用1 ml的BRB80 5 ×在3.5 ml的过滤去离子水中稀释500 µl的10％BSA。

甲基纤维素1 ，500厘泊
溶解100毫克甲基纤维素1 ，500厘泊在10毫升prewarm（60℃）去离子水的

在旋转轮上轻轻摇动30分钟

存放在4°C下两周

HEPES ，10mM的
将477 mg溶于200 ml去离子水

用KOH调节pH值至7.4

分装在-20°C下

普朗尼克F27 ，10％
将100毫克溶于1毫升去离子水中

储存在4 °C最多2个月

PBS
将1片药片溶于200毫升去离子水中

储存在-20°C

中性亲和素储备液
将中性亲和素以1 mg / ml的最终浓度溶于去离子水中

储存在-20 °C

红微管蛋白混合
在BRB80中以9：1的摩尔比稀释纯化的未标记和ATTO-565微管蛋白

使用TLA100转子以100,000 × g （4 °C）的转速旋转骨料

通过测量OD 280nm （1OD 280nm = 1 mg / ml = 10 µM微管蛋白）来估计微管蛋白浓度。

等分试样，迅速冷冻并储存在液氮中长达1年

聚合混合物
BRB80补充：

50毫米氯化钾

1％牛血清白蛋白

4毫米DTT

1毫米GTP

1 mM葡萄糖

0.05％甲基纤维素1 ，500厘泊

1/50脱氧混合物（70 µg / ml过氧化氢酶，500 µg / ml葡萄糖氧化酶，1 mg / ml葡萄糖）

12 µM红色微管蛋白混合物

200 nM MAP6-N-GFP

致谢

资金来源：这项工作得到了法国国家医学研究所和法国国家原子能研究中心（INSERM），欧洲原子能研究中心（CEA），法国科学技术中心（CNRS），格勒诺布尔阿尔卑斯大学的资助，并得到了法新社的资助。国家研究中心的ANR MAMAs 2017-CE11-0026，NR-15-IDEX-02 NeuroCoG，在“研究投资”计划的框架下，并获得了法国国家研究与发展部的资助。GIN是格勒诺布尔神经变性卓越中心（GREEN）的成员。格勒诺布尔研究所神经科学研究所的光子成像中心（格勒诺布尔阿尔卑斯大学– Inserm U1216）是ISdV核心设施的一部分，并获得了IBiSA标签的认证。

该协议源自Cuveillier等。（2020年）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

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