材料和试剂

1.移液器吸头0.1-10μl，1-200μl和100-1,000μl（Sorenson Bioscience，目录号：70600、70520、70540）
2.无粉手套（Denville Scientific，目录号：G4162）
3. 50 ml锥形管（Denville Scientific，目录号：C1062-P）
4.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Corning，目录号：21-040-CV）
5，甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860-1L-R）

6.氯化钾（氯化钾，密理博，目录号：7447-40-7）
7.二氯甲烷（西格玛奥德里奇，目录号：650463-1L）
8.去离子蒸馏水（ddH 2 O）
9.云母片（电子显微镜科学，目录号：71855-15）
10. 1 M KCl溶液（请参阅配方）

设备

吸管小号0.5-10微升，10-100微升和100-1,000微升仪（Eppendorf，型号：研究® P的LU，可变可调体积移液管）
Milli-Q Advantage A10净水系统（Millipore- S Sigma，目录号：C10117）
玻璃分液漏斗（Southern Labware，型号：3964-3）
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvalis ST16R）
Vortexer（科学工业，型号：200-SI0236）
旋转蒸发仪（Buchi，型号：R-210）
真空泵（Buchi，型号：V-700）
真空控制器（Buchi，型号：V-800）
加热浴（Buchi，型号：B-491）
蒸发瓶（Buchi，目录号：Z402982）
笔记本电脑（ThinkPad，型号：T570）
11。 CoreAFM控制器（Nanosurf，型号：CoreAFM控制器）

12. CoreAFM系统（Nanosurf，型号：CoreAFM系统）
13. Isostage 300控制器（Nanosurf，型号：Isostage 300控制器）
14. CoreAFM工具集（Nanosurf，型号：CoreAFM工具集）

软件

CoreAFM控制软件（版本3.10.0，https: //www.nanosurf.net/en/software/coreafm）

程序

的准备摹LDNP
请参考我们的出版b IO-协议宋等人。（2019年和2020年）。

注意：超速离心（30,000 × g，4°C和45分钟）后，可以富集储存的GLDNP（在1 × PBS中）并除去上清液。

设置AFM（请参阅注释1）
组装Nanosurf CoreAFM系统根据CoreAFM操作说明中的步骤进行操作。组装后的AFM设备如图1所示。

图1.组装 Nanosurf CoreAFM系统。答：根据说明，组装好的Nanosurf CoreAFM系统包含CoreAFM系统，Isostage 300控制器，CoreAFM控制器和便携式计算机。B. CoreAFM工具集（请参阅注释2）。C.处于打开状态的CoreAFM的放大照片。

打开Nanosurf CoreAFM系统（请参阅注释3）。
将Nanosurf Dyn190AI动态模式悬臂插入悬臂支架中，确保尖端没有损坏，并将悬臂支架连接到CoreAFM扫描头底部的磁铁上（请参阅注3）。

载入中用于AFM成像的GLDNP样品
将ddH 2 O中的GLDNP溶液稀释至1 mg / ml。
将2μl纳米颗粒样品沉积到云母片上（图2A）。
注意：作为药物输送工具，精确的剂量反应是必须考虑的因素之一。对于不同的样品，通常将溶液从高浓度稀释到低浓度，同时不断减少溶液的体积。根据成像AFM的效果，最适合溶液的浓度和体积是FINA LLY选择。的浓度GLDNP样品在此过程中用于成像应> 0.01 μ克/米升。

在室温（RT）下干燥样品2小时。
用5μl蒸馏水轻轻冲洗云母片3次（图2B）。
注意：首先，滴蒸馏水轻轻放入云母的中间片使用的p ipette，然后用滤纸从云母的边缘吸收水分片。由于GLDNP样品小号被储存在PBS中，盐颗粒从PBS将影响AFM的成像效果，所以目的克ently RINS我纳克的云母片是去除盐GLDNP样品小号。

再次在室温下干燥样品2小时。
将云母片在室温放置30分钟，直到样品变平。
注意：要判断样品是否干燥并且变平，我们可以将云母片放在垂直位置，如果我们没有观察到样品点有水流的迹象，则通常意味着样品已变平并干燥。在样品上的干燥度和平整度的MI CA片会影响AFM的成像效果。

将云母片固定在标准样品架中央的样品磁体上（图2C）。
关闭CoreAFM扫描头盖，三个扫描头支脚将与相应的样品台支柱对齐。

图2.加载GNDLN样品到所述云母片和它在样品上磁体固定。A.将2μl纳米颗粒样品沉积到云母片上的过程。B.轻轻漂洗过程的云母片用蒸馏水和从边缘吸附水的所述云母片用滤纸。C.将云母片固定在标准样品架的样品磁体上的过程（请参见注释3）。

GLDNP样品的AFM成像
检查激光的位置和质量（请参阅注释3）。
将CoreAFM系统连接到CoreAFM控制器，然后启动设备和软件。
在CoreAFM控制软件中，打开“激光对准”对话框（图3A），然后使用“摄像机”选择器（图3C）将CoreAFM切换到顶视图摄像机（图3B ）。
注意：所述的激光对准对话框显示的当前位置的的AFM激光点上的检测器和所述用过的激光功率。通过单击“采集”选项卡的“准备”组中的“激光对准”按钮，可以打开该对话框。

使用CoreAFM系统随附的激光对准工具以顺时针或逆时针方向旋转螺钉（图3C）。最佳对准的激光将产生图3A。
注意：CoreAFM系统在扫描头的顶盖上带有4个孔，可用来接近激光和检测器对准螺钉，从而改变了激光束光路的不同方面（图3C）。将扫描头盖打开到大约30°的角度，现在您应该在样品架或样品架平台上的某个位置看到红色激光点（图3C）。

图3.检查激光器的位置和质量。答：菜单的CoreAFM控制软件应用程序和校对完成激光校准对话框。该图形区域显示偏转的激光束撞击光电二极管检测器的位置。虚线框包围的区域内的任何地方都有绿点，表示悬臂挠度检测系统（由激光，悬臂和检测器组成）已正确对齐。如果激光光斑落在该区域之外，它将变成红色，这意味着对准不允许进行正确的测量。B.悬臂及其芯片结构的俯视图。C. CoreAFM扫描头和样品架的物理照片。

配置CoreAFM的测量参数（请参见注释3）。
在CoreAFM控制软件的菜单中，单击“空气”以从“测量环境”下拉菜单中选择测量环境（图4A）。
单击“静态力”以从“操作模式”下拉菜单中选择所需的操作模式（图4B）。
单击“ ACL-A”，从“悬臂选择器”下拉菜单中选择所需的悬臂类型（图4C）。
单击“频率扫描”按钮，将打开“振动频率搜索”对话框。单击此对话框中的“查找振动频率”按钮（图4D）。单击“确定”退出对话框。
注意：自动频率搜索完成后，您应该看到一条清晰的共振曲线和一个显示振动频率的标记。

图4.配置Core AFM的测量参数。交流电将测量环境设置为“空气”（A），将操作模式设置为“静态力”（B），然后在“悬臂选择器” （C）中选择“ ACL-A”作为悬臂。D. CoreAFM控制软件应用程序的菜单和校对完成的“振动频率搜索”对话框。

接近荷兰国际集团的GLDNP样本（见注3）。
在侧视图中观察吸头和样品之间的距离（图5A）。
在观察吸头样品距离的同时，单击并按住“采集”选项卡的“进路”组中的“前进”按钮，直到吸头足够靠近样品为止（图5B）。
单击“获取”选项卡的“进场”组中的“进场”按钮（图5B）。单击“确定”按钮（图5C）。
注意：在最后一步中，此样本将自动接近吸头，直到达到给定的设定值。

图5.接近GNDLN样本。A.悬臂的侧视图图像。B. “前进”和“进场”，但在“获取”选项卡的“进场”组中占很多。C.达到设定点时，显示“已完成处理”消息。

开始测量（请参阅注释3）。
在“成像”对话框中选择初始扫描参数，如下所示（图6A）：
图像扫描尺寸= 10.00μm

时间/线= 0.78 s

点/线= 256

注意：在主面板上的其他值是在完成探针调优后仪器自动填写的值。因此，不需要更改这些值。

点击“开始”按钮，在成像组的的取样选项卡并开始扫描，持续1分钟，以稳定悬臂和仪器调整到周围环境vibrati组件（图6B）。
注意：手动降低“设定值”值，直到表面特征开始出现在高度图像上。可以通过调整“设定值”，“ P增益”和“ I增益”值来实现成像优化（请参见注4）。最后，可以将“图像扫描尺寸”减小到5.00μm或4.00μm以调整图像的扫描尺寸，并且“点/线”可以增加到512或什至1,024（见注5）f个或更多像素。因此，每个图像中的图像质量都得到了提高。

对图像质量满意后，单击“开始”按钮，然后使用优化的参数重新开始扫描。扫描后，单击“采集”选项卡的“成像”组中的“停止”按钮（图6B）。
注意：调整CoreAFM系统的定位螺钉（请参见图1C），以使每个样品的悬臂可以放置在云母片表面的不同位置。然后单击“采集”选项卡的“成像”组中的“ Prescan ”按钮（图6B）。通过预扫描找到所需位置后，单击“开始”按钮进行扫描。

图6.挑动克和存储在所述的测量GLDNP样品。答：选择初始扫描参数并调整“设定值”，“ P增益”和“ I增益”值以提高“成像”对话框中的图像质量。B. “采集”选项卡的“成像”组中的“预扫描” ，“开始”和“停止”按钮。C.在“捕获”按钮中的成像工具栏。

存储测量值并使用文档。
默认情况下，每个完成的测量都会自动（临时）存储在您的计算机上，以便以后使用。您还可以通过单击“捕获”按钮来拍摄仍在进行的测量的快照（图6C）。
Ť他获取的文档将保持打开在CoreAFM控制软件（图7A）的文件空间。添加或删除图表或设置图表参数全部在“图表属性”对话框中执行（图7B）。
点击（“+“添加图表”按钮中的”图7B），以创建当前所选或活性图表的副本，并将其在添加到活动窗口的最后位置。点击“删除图表”按钮（图7B），以删除当前激活的图表。
选择的图表类型（线图，颜色映射，3维视图，XY线图，或力曲线图），以用于将测量数据从“类型”显示的图表参数（图7B）。图7A示出了3个不同图表TY PES 的所述GLDNP样品。
使用图表属性对话框来设置相应的图表的类型的各种参数的GLDNP样品
设置完成后，单击“关闭”按钮（图7B），以ç失去图表属性对话框，然后单击“ Ş AVE图标”（图7A）保存文档。

图7. d ifferent图表类型的GLDNP样品和所述图表属性对话框。一种。（ⅰ）颜色图，（ⅱ）3D视图和（iii）次的线图ë GLDNP样品，和（IV ）的“图表属性”按钮。B.图表属性对话框用于设置所有图表属性，这些属性会影响相应图表的数据显示。

数据分析

我们使用上述方法来执行的原子力显微镜成像GLDNP样品（图小号8A - 8 C）。
在“成像”对话框中为GLDNP选择最终扫描参数，如下所示：

图像扫描尺寸= 5 .00μm

时间/线= 0.78 s

点/线= 256

我Ñ Figu重新小号8A- 8 C，AFM图像显示，GLDNP小号是纳米尺寸的颗粒和具有一球形形状，并且提出了一个大小均质的外观。

我们制备的合成材料P聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）系纳米颗粒，然后使用上述方法和设置相同的参数，以获得样品PLGA（图的AFM图像小号8D- 8 F）和与GLDNP进行了比较。通过图像比较，我们可以观察到PLGA纳米颗粒也是球形的，具有尺寸均一的外观，并且其粒径略小于GLDNP。与GLDNP相比，PLGA纳米颗粒在云母片上显示出一定程度的聚集。

图8 。的AFM表征吨他GLDNP样品和聚乳酸-共-乙醇酸（PLGA）的样品（作为对照）。交流电彩色图（A），3D视图（B）和图像扫描的数据信息（C），用于GLDNP的AFM表征。DF。彩色图（D），3D视图（E）和用于PLGA的AFM表征的图像扫描（F）的数据信息。

笔记

这里描述了Nanosurf CoreAFM系统的所有过程。对于AFM的不同型号和品牌，将需要根据协议对协议进行调整。制造商的说明。
工具集的内容取决于用户订单中包含的选项。它至少包含以下各项：
接地线

悬臂镊子：（103A CA ）

悬臂交换工具

激光对准工具：内六角扳手1.5毫米（球形六角头），带螺丝刀手柄

5毫米内六角扳手：用于CoreAFM运输锁

标准样品架

钙ntilever支架液体-空气平

准备并操作使用CoreAFM系统并测量该系统的简要程序。V IDEO是可以在产品官方网站（ https://www.nanosurf.net/en/products/coreafm-the-essence-of-atomic-force-microscopy）。准备用于AFM成像的负载纳米粒子的云母片大约需要4小时30分钟，而用于AFM调试和照相则需要15-20分钟。因此，可以在5小时内完成不包括数据分析的AFM成像。我Ñ特别，它应当指出的是的主要限制在一个波夫过程是，AFM成像只能在干燥样品来进行在室内空气的环境中，并制备的样品的原子力显微镜成像（装载在云母片），通常需要是在有限的时间内（不超过6小时）完成。另外，通过CoreAFM系统，样品的最小可分辨粒度为约10nm 。
使用低“P增益”的d在开始“I增益”，以保护悬臂。这些值可以在以后的扫描中提高，以获得更好的图像质量。
“积分/线”确定小号的像素点数量小号上的每个线和所述图像中的扫描线的数量。在大多数情况下，该值应保持不变。

菜谱

1 M KCl溶液
将0.745 g氯化钾（KCl）溶解在10 ml的ddH 2 O中，并充分混合

致谢

这项工作得到了美国糖尿病，消化与肾脏疾病研究所的支持（DM的RO1-DK-116306和RO1-DK-107739），退伍军人事务部（DM的优异奖BX002526）以及克罗恩氏和结肠炎基金会的支持美国。D. L.是美国克罗恩氏和结肠炎基金会（Research Fellowship Award）的获得者（奖号＃689659）。DM是退伍军人事务部（BX004476）颁发的“高级研究职业科学家奖”的获得者。该协议基于我们先前发表的研究（Yang等，2020）。

利益争夺

作者声明该作品内无利益冲突。

参考

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莫里斯（VJ），柯比（Kirby）和加宁（AP）（2010）。生物学家用的原子力显微镜。第二版银行足球比赛。帝国大学出版社，ISBN-10：184816467X。
Sung，J.，Yang，C.，Viennois，E.，Zhang，M.和Merlin，D.（2019）。姜的根茎生姜中的生姜纳米颗粒（GDNP）的分离，纯化和表征。生物- p rotoc醇9（19）：e3390。
Sung，J.，Yang，C.，Collins，JF和Merlin，D.（2020年）。结肠靶向siRNA递送的生姜脂质纳米颗粒的制备和表征。生物- p rotoc醇10（14）：e3685。
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