材料和试剂

1. 200 µl PCR管（Biosharp，目录号：BS-02-P）

2. 1.5 ml微量离心管（Biosha rp，目录号：BS-15-M）

3.移液器吸头（Biosharp，目录号s ：BS-10-T，BS-200-T，BS-1000-T）

4.感受态大肠杆菌T1细胞（TransGen，目录号：CD501-02 ）

5. LR克隆酶（网关TM LR克隆酶TM酶混合物，目录号：11791-043）

6. NEB Cutsmart缓冲液（新英格兰生物实验室，目录号：B7204S）

7. NEBuffer 3.1（新英格兰生物实验室，目录号：B7203S）

8. EcoR V（新英格兰生物实验室，目录号：R0195L）

9. Bsa I-HF（新英格兰生物实验室，目录号：R3733L）

10. T4 DNA连接酶（新英格兰生物实验室，目录号：M0202L）

11. PCR SuperMix（TransGen，目录号：AS111-11）

12. KOD FX（Toyobo，目录号：KFX-101）

13. dNTPs混合物（2mM）（Toyobo，目录号： NTP-201）

14.灭菌的双蒸H 2 O（Phygene，目录号：PH0727）

15. DreamTaq或其他等效的DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：K1072）

16.琼脂糖（Biowest，目录号：111860）

17.质粒制备微型试剂盒（OMEGA，目录号：D3350-01）

18.凝胶提取试剂盒（OMEGA，目录号：D2500-01）

19.大观霉素（Sigma-Aldrich，目录号：PHR1441）

20. Tris（Solarb io Life Scientific，目录号：T8060）

21.乙酸（MERCK，目录号：M10006307 ）

22. 0.5 M EDTA（Solarbio Life Scientific，目录号：E1170）

23.胰蛋白Try（类毒素，目录号：LP0042）

24.酵母菌提取物（类毒素，目录号：LP0021）

25.氯化钠（NaCl）（ Sigma-Aldrich，目录号：S5886）

26.溴化乙锭（EB）（Sigma-Aldrich，目录号：E8751）

27.用于PCR筛选的通用引物（见表1）

表1.通用引物

28. PJF997（含有OsU3-sgRNA表达盒的供体载体），PJF999（含有OsU6-sgRNA表达盒的供体载体），PJG090（用于扩增两个间隔子的供体载体），PJG097（一个靶标的目的载体）， PJG112（两个目标的目标向量）。所有的载体都在我们之前的工作中得到了发展（Liu等，2020）。

29. 50 × TAE电泳缓冲液（请参阅“配方” ）

30. LB培养基（请参阅食谱）

31. LB琼脂培养基（请参见食谱）

设备

Pi pettes（Eppendorf）
微量离心机（Eppendorf，型号：Centrifuge 5424）
加热块（杭州奥盛仪器有限公司，型号：MK-20）
热循环仪（赛默飞世尔科技，Applied Biosystems公司TM ，型号：Veriti ® 96孔热循环仪）
水浴锅（上海冰林，型号：BLHH-6N）
纳米滴（赛默飞世尔科技，赛科技TM ，型号：NanoDropTM 2000）
凝胶成像系统（ChemiDoc XRS +系统，BIO-RAD，型号：1708265）

软件

SnapGene（GSL Biotech LLC，https: //www.snapgene.com/ ）
WPS Excel （金山办事处，https://www.wps.cn/）

程序

设计sgRNA引物
使用任何在线工具（例如CRISPR-P （http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR））设计sgRN A间隔子。
注意：sgRNA的转录是由OsU3或OsU6启动子衍生的，它们具有不同的转录起始位点（间隔子的第一个核苷酸）。OsU3启动子的转录起始位点是核苷酸A，而Os U6启动子的是核苷酸G.

要构建带有一个以'A'开头的间隔子的二元载体，请将以下核苷酸添加到有义（SS）和反义（AS）sgRNA间隔子下游的3'处，以获得sgRNA引物：
SS：5 ' -gttttagagctatgctgaaa-3 '

AS：5 ' -tgccacggatcatctgcac-3 '

要构建带有一个以'G'开头的靶标的二元载体，请将以下核苷酸添加到有义（SS）和反义（AS）sgRNA间隔子下游的3'处，以获得sgRNA引物：
SS：5 ' -gttttagagctagaaatag-3 '

AS：5 ' -ggcagccaagccagcaccc-3 '

构建包含两个目标的二进制向量，分别以“ A”和“ G”开头：
甲DD以下个核苷酸至5 A'-开始sgRNAs（A-因组-SS）和'G'-开始sgRNAs（G-因组-AS），以获得因组的引物的反义“的意义上的上游'：
A-因组-SS：5 ' - agGGTCTCAggca -3 '

G-因组-AS：5 ' - agGGTCTCAaaac -3 '

甲DD以下个核苷酸至3 A'-开始sgRNAs（A-因组-SS）和'G'-开始sgRNAs（G-因组-AS）寡核苷酸的反义“的意义上的下游'：
A-因组-SS：5 ' - gttttagagctatgc -3 '

G-因组-AS：5 ' - ggcagccaagccagc -3 '

从任何合格的公司订购底漆。
要构建包含一个靶标的二元载体，请将引物稀释至1μM的工作浓度用无菌双蒸馏水2 ö。
要构建包含两个靶标的二元载体，请使用灭菌的双蒸馏水H 2 O将引物稀释至10μM的工作浓度。
笔记：

当您将sgRNA设计为带有两个靶标的二元载体时，重要但不必要的是排除包含BsaI限制性酶切位点的sgR NA序列。
WPS Excel中的连接功能对于获取正确的sgRNA引物序列非常有用。例如，为了在Excel中获得sgRNA正向引物，请在单元格A1中添加间隔序列，在单元格B1中添加SS序列。设置单元格C1 = CONCATENATE（A1，B1），并且C1是sgRNA正向引物。

准备PCR模板
使用Eco RV线性化供体向量。
PJF997或PJF999 2-3 μ克

10 × Cutsmart缓冲器5微升

EcoR V 1微升

ddH 2 O至50μl

在37°C下孵育3小时

将消化反应产生的两个片段回收到同一EP管中，并根据制造商的说明使用凝胶提取试剂盒一起纯化。
使用NanoDrop测量DNA浓度，然后将DNA产物稀释至3 ng / μl的工作浓度。

构造一个包含一个目标的二进制向量（图1）
建立优化的多重PCR反应：
2 × KOD-FX缓冲器5微升

dNTPs 2微升

KOD-FX 0.2微升

线性化供体载体（3纳克/微升）0.2微升

OJP001（10μM）0.3μL

OJP002（10μM）0.3μL

sgRNA引物F（1μM）0.2μl

sgRNA引物R（1μM）0.2μl

ddH 2 O至10μl

使用以下程序在热循环中运行PCR：
步

温度

时间

初始变性

94°摄氏度

2分钟

98°摄氏度

10秒

40个循环

55°摄氏度

20秒

68°摄氏度

30秒

最终扩展

68°摄氏度

5分钟

抓住

25°摄氏度

负载2 μ升的PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳。
笔记：

PCR产物的大小为774bp（线性化的PJF997作为模板）或872bp（线性化的PJF999作为模板）。
其余的PCR产物无需纯化。
设置LR反应，以将一个sgRNA克隆到目的载体中。
PCR产物0.4微升
LR克隆酶0.4微升

PJG097 0.2微升

ddH 2 O 1微升

在25°C下孵育3小时

注意：有关制备用于LR反应的PJG097的方法，请参见Liu等。（2020）。

将1μl反应产物转化为20μl感受态T1细胞。将转化的细胞铺在含有50μg/ ml大观霉素的LB琼脂平板上。然后，将板在37°C下孵育过夜。
转换步骤：

从-80取出T1化学感受态细胞 °C并迅速插入冰中。约5分钟后，将目标反应产物添加到融化的感受态细胞中并轻轻混合。将感受态细胞在冰中放置25分钟。
将感受态细胞在42 °C的水浴中加热45 s，然后迅速置于冰上2 min。
700微升无抗生素无菌LB培养基加入到离心管中，并摇动以200rpm在37 60分钟℃下。
注意：此步骤需要在无菌条件下进行。

设置菌落PCR反应以验证阳性克隆。从每个板中选择2-4个菌落。每个克隆的一部分直接稀释到PCR混合物中，其余的每个克隆都保留下来。
PCR Supermix 5微升

OJP008 0.3微升

OJP026 0.3微升

ddH 2 O 至10μl

注意：如果将一分子化的PJF999用作多重PCR的模板，请使用OJP065代替OJP008。

菌落PCR条件：
步

温度

时间

初始变性

94°摄氏度

5分钟

94°摄氏度

30秒

35个循环

55°摄氏度

30秒

72°摄氏度

1分钟

最终扩展

72°摄氏度

5分钟

抓住

25°摄氏度

将5μlPCR产物上样至1％琼脂糖凝胶上进行电泳。
从每个转化中选择一到三个阳性菌落，并将其转移到含有50μg/ ml大观霉素的6 ml LB培养基中。然后，在定轨摇床上于37℃在220 rpm下孵育过夜。
根据生产商的说明，使用市售的miniprep试剂盒从过夜培养物中分离质粒DNA。
使用OJP026通过Sanger测序验证质粒。

图1.协议中描述的克隆过程的示意图

构造一个包含两个目标的二进制向量（图1）
设置优化的多重PCR反应。
2 × KOD-FX缓冲液5μl

dNTPs 2微升

KOD-FX 0.2微升

PJG090（3 ng /μl）0.1微升

sgRNA引物F（10μM）0.2μl

sgRNA引物R（10μM）0.2μl

ddH 2 O至10μl

使用以下程序在热循环中运行PCR：
步

温度

时间

初步d enaturation

94°摄氏度

2分钟

98°摄氏度

10秒

40个循环

55°摄氏度

20秒

68°摄氏度

30秒

最终扩展

68°摄氏度

5分钟

抓住

25°摄氏度

将2μlPCR产物加到1％琼脂糖凝胶上进行电泳。
设置金门反应，将两个sgRNA克隆到目的载体中。
非纯化的PCR产物1μl

PJG112 50 ng

Cutsmart缓冲液（NEB）1μl

T4连接酶缓冲液（NEB）0.4μl

BsaI（NEB）5 U

T4 DNA连接酶（NEB）20 U

ddH 2 O至15μl

金门反应条件：

温度

时间

37°摄氏度

10分钟

20个循环

37°摄氏度

2分钟

20°摄氏度

5分钟

37°摄氏度

5分钟

将4μl反应产物转化为20μl感受态T1细胞。将转化细胞铺在含50μg/ ml大观霉素的LB琼脂平板上。然后，将板在37°C下孵育过夜。
注意：此步骤需要在无菌条件下进行。

设置菌落PCR反应以验证阳性克隆。从每个板中选择2-4个菌落。
PCR混合液5μl

OJP008 0.3微升

OJP026 0.3微升

ddH 2 O 4.4微升

菌落PCR条件：
步

温度

时间

初始变性

94°摄氏度

5分钟

94°摄氏度

30秒

35个循环

55°摄氏度

30秒

72°摄氏度

1分钟

最终扩展

72°摄氏度

5分钟

抓住

25°摄氏度

将PCR产物加载到1％琼脂糖凝胶上进行电泳。
从每个转化中选择1-3个阳性菌落，并在无菌条件下将其转移至6 ml含50μg/ ml大观霉素的LB培养基中。然后，在定轨振荡器中于37°C孵育过夜。
根据生产商的说明，使用市售的miniprep试剂盒从过夜培养物中分离质粒DNA。
使用OJP026通过Sanger测序验证质粒。

菜谱

50 × TAE电泳缓冲液
特里斯242克/升

甲cetic酸57.1毫升/ L

0.5 M EDTA（pH 8.0）100毫升/升

LB培养基
Ť ryptone 10g / L的

氯化钠10克/升

Y东提取物5 g / L

在121 °C下高压灭菌15分钟

LB琼脂培养基
Ť ryptone 10g / L的

氯化钠10克/升

Y东提取物5 g / L

琼脂12克/升

在121 °C下进行15分钟的灭菌器灭菌

致谢

感谢阿伯斯威斯大学的路易斯·亚历杭德罗·何塞·穆尔（Luis AlejandroJoséMur）对手稿的批判性阅读和编辑。CF获得了中国国家科学基金（31800250和31960063）的资助。该协议是基于我们先前在PeerJ上发表的研究（Liu等人，2020年）开发的。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

冯ZY，张，BT，丁，文，刘，XD，杨，DL，魏，PL，曹，FQ，朱，SH，张，F.，毛，YF和朱，JK（2013）。使用CRISPR / Cas系统在植物中进行有效的基因组编辑。Cell Res 23（10）：1229-1232。
Liu X.，Zhou，X.，Li，K.，Wang，D.，Ding，Y.，Liu X.，Luo，J. and Fang，C.（2020年）。一个简单，高效的克隆系统，用于水稻中CRISPR / Cas9介导的基因组编辑。PeerJ 8：e8491。
马XL，朱QL，陈YL和刘YG（2016）。用于植物基因组编辑的CRISPR / Cas9平台：开发和应用。分子植物9（7）：961-974。