材料和试剂

1.小纱布垫

2. C57BL6J小鼠（8-15周）

3.超级债券C＆B（Sun医疗）

4. GC UNIFAST Trad（日本爱知县GC牙科产品公司）

5.公头（VRSP 6）和母头（VRF6）塑料Leur接头（美国诺信医疗公司）

6.聚氨酯制人用耳塞（明尼苏达州3M公司）

设备

4.7T水平MRI Avance IIII系统（德国布鲁克）
鼠标头定位器（定制）
用于发射/接收射频信号的专用鼠标体积线圈（直径为30 mm），与用于鼠标床的半圆形丙烯酸透明塑料管相结合（高岛制作所有限公司）
呼吸/心率监测系统（美国纽约州石溪的SA Instruments，M odel 1025）

程序

颅骨整形手术
外科手术
我们用异氟烷（1.5％的空气）麻醉小鼠。
我们去除了头皮并暴露了颅骨。
我们用一个装有生理盐水的小纱布垫小心地抛光了颅骨的表面。
我们在头骨上放置了一个高级债券（超级债券C和B）。
我们安装Ç ranioplastic丙烯酸水泥（GC UNIFAST岛）上superbond有阳塑料路厄配件（图URE 1）。
小鼠在手术后可能会恢复一周以上的时间。我们仔细地检查一天天nimal体重和行为。

图1 。颅骨整形手术。在颅骨上放置一层薄薄的超级粘结层。然后将Luer接头用颅塑料丙烯酸水泥快速固定。

适应训练
恢复期间的鼠标处理
在恢复过程中，我们继续处理了至少1周。该处理程序与解除杯状手小鼠和大约30秒（图举行的动物URE 2）。
我们确认老鼠在搬运过程中没有小便，也没有从杯形手跳下。
一旦体重与手术前体重相比增加，我们将在功能磁共振成像实验之前训练小鼠适应清醒的功能磁共振成像条件。

图2 。用手心处理。照片显示了将Luer配件植入颅骨中的代表性鼠标的处理方式。

适应训练
在功能磁共振成像实验之前，我们训练小鼠4天以适应清醒的功能磁共振成像条件。我们每天（10：00-18：00）在同一时间训练他们，以最大程度地降低昼夜节律变化的影响。
在最初的2天中，我们使用了由非磁铁孔和头部定位器组成的伪MRI系统（图3和图4）。丙烯酸棒紧密地装有弹性管。然后我们在接下来的2天中在MRI孔中训练了小鼠。

图3.用定制的头部定位器固定头部。固定头的照片（左）和头固定系统的示意图。头部固定系统是定制的。

图4 。伪MRI头部定位器进行适应训练

我们使用2％异氟烷与空气在麻醉室内麻醉小鼠。
一旦小鼠麻醉，我们停止异氟醚和迅速，紧紧固定其与非MRI头部固定系统（图头URE 3）。
切下耳塞以适合老鼠的耳朵，并用镊子将其插入老鼠的耳道（图5D）。专用耳塞的尺寸应大于耳道，以免与耳道形成间隙。
我们用纸巾或纱布轻轻包裹身体，以便小鼠可以在纸巾（或纱布）盖内移动其四肢（图4）。
通常，小鼠在停止异氟烷递送后10分钟内醒来。使用脑电图证实了这一点（Tsurugizawa等，2020b ）。
小鼠在第一天停留在伪MRI设备中30分钟，第二天停留90分钟。
在训练过程中，我们监测了呼吸频率和心率。用手术胶带将一个小的气动枕头连接到动物的腹部，以此来测量呼吸。心电图电极（ECG）插入皮肤下。
唤醒功能磁共振成像
在磁铁外进行了2天的训练后，我们开始了对磁孔的适应训练。
我们用2％异氟烷与空气在麻醉室内麻醉小鼠。
在安装过程中，我们通过面罩（空气中1.5％）继续进行异氟烷麻醉。
我们用头部定位器将动物的头部固定在专用的体积线圈中，然后将动物的身体放置在床上（图5A）。我们使用了与图3相同的头部定位器。专用耳塞的尺寸应大于耳道，以免与耳道形成间隙。
我们将专用的耳塞（切成5毫米长）插入了鼠标耳道（图5D）。

图5.专用音量线圈，头部固定系统和eay插头。一。专用鼠标音量线圈和床。乙。鼠标头固定示意图。Ç 。容积线圈和床的示意图。d 。左：用于人类的耳塞和（用于D中心的）专用于鼠标的耳塞。d 。右：带有专用耳塞的鼠标耳。图片和示意图来自Tsurugizawa等人。（2020b ）。

我们用纸巾或纱布轻轻包裹身体，以便它们的四肢在纸巾（或纱布）盖内移动。
我们调整了基本频率，磁场均匀性，参考脉冲增益和接收器增益。该调整是由布鲁克系统自动执行的。
我们获取与快速采集弛豫增强（RARE）序列的解剖学图像以下使用以下参数的异氟醚的停止：重复的时间，2 ，500毫秒; 有效回波时间，60毫秒；稀有系数8; 采集矩阵128×128; 视野16毫米×16毫米; 切片厚度1毫米；15片和4个平均值。
我们开始获取fMRI数据使用以下参数麻醉停止后10分钟：重复的时间，2 ，000毫秒; 回声时间21毫秒; 采集矩阵，80×80；视野16毫米×16毫米; 切片厚度1毫米；15片和4个平均值。
我们在MRI实验（1025型，SA仪器）中监测了呼吸频率和心率。
我们进行的fMRI训练（3次和第4次使用相同的协议作为功能磁共振成像实验天）。
我们完成牛逼，他的适应训练时，心脏和呼吸率分别降至标称水平（图URE 6）。如果它们没有减少，我们将继续进行适应训练。

图6.适应训练期间的心率和呼吸率。（A）心率和（B）呼吸率在训练结束时降至名义水平（n = 15）。* P <0.05，通过Tukey-Kramer多重比较测试。数据来自Tsurugizawa等人。（2020b ）。

致谢

这项工作是根据我们以前发表在工作科学进展（Tsurugizawa等人湖年，2020年b ）。这项工作得到了KAKENHI青年科学家，科学研究和创新领域科学研究的资助（16H06316、16H06463、24700380），JST CREST以及澳大利亚武田科学基金会和吸烟科学基金会的支持国家卫生与医学研究理事会（NHMRC）高级研究奖学金B（ID：1136649）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

在本研究中的所有动物实验过程由动物伦理委员会的机构审查委员会谁跟随机构准则批准AIST（2020-0365-A）的伦理委员会和RIKEN脑科学研究所的伦理委员会（W2019-2-042 ）。

参考

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