材料和试剂

1. TinyLily迷你处理器（TinyCircuits，目录号：ASM2101）

2. TinyLily发光二极管（LED）0402（TinyCircuits，目录号：ASL1001-LR）

3. 10 mAh超轻型锂聚合物（LiPo）电池（PowerStream Technology，目录号：PGEB201212）

4.砝码和浮力材料（例如，不锈钢垫圈和软木塞）

5.牙签（旧价值高的竹牙签，每包1000个）

6.直径254.0μm的铂金棒（AM Systems，目录号：711000）

7.聚丙烯外壳（例如，直径15毫升的Nunc TM锥形离心管的帽盖为2.11厘米，Thermo Scientific TM ，目录号：339650；以及切成相应圆形的聚丙烯塑料片）

8.涂有全氟烷氧基烷烃（PFA）的银线，裸线直径为76.2-μm，涂层直径为139.7-μm（AM Systems，目录号：785500）

9.热胶（例如，大猩猩热胶棒，大猩猩胶）

10.即时海洋®海盐（即时海洋，频谱品牌，目录号：SS15-10，在室温下储存）

设备

烙铁，焊锡，助手工具和镊子
蜡烛或明火
热胶枪（例如，无绳热胶枪，Neu Master，目录号：FQ-009）
羊皮纸（例如Quillon羊皮纸，Uline，目录号：S-19145）
万用表（例如Fluke 115 Field Technicians Digital Multimeter）
亚克力水箱（Envision Acrylics，Inc.，定制设计，尺寸为1.8 m × 0.9 m × 0.9 m）
折光仪（例如，密尔沃基MA871数字糖度折光仪，目录号：MW-MA871）
梯子
渔网（例如，带有手柄的大型鱼网，或定制的鱼网，以匹配水箱底部的尺寸，并带有向上拉动的绳子和手柄）
带盖塑料容器（例如86盎司透明食品储存容器，Basix）
隔热的聚苯乙烯泡沫塑料容器（例如，带泡沫托运器的Thermo Chill隔热纸箱，中号，12英寸× 10英寸× 7英寸，Polar Tech Industries，目录号：227C）
Cyber-shot DSC-RX100（Sony，目录号：DSCRX100 / B）
索尼AX100相机（索尼，目录号：FDR-AX100）
盖茨AX100水下房屋（盖茨水下产品，目录号：AX100）
背景板（例如，黑色泡沫板，36 × 48”，Uline，目录号：S-19381和白色泡沫板20 × 30 × 3/16”或5 mm，海军企鹅）
绳子绑在潜水重物上
拉链领带（例如，红色和黄色的尼龙拉链领带）
潜水设备（例如，面罩，通气管，脚蹼，潜水衣，调节器，压缩空气罐，潜水电脑）

软件

Arduino（Arduino，https：//www.arduino.cc/ ）
MATLAB（MathWorks，https ://www.mathworks.com/ ）
ImageJ（美国国立卫生研究院，https：//imagej.nih.gov/ij/）

程序

建筑微电子游泳控制器
根据制造商的说明，使用Arduino将TinyLily微控制器编程为所需的信号频率，以将代码上传到板上。图2A显示了方波信号，振幅为3.7 V，脉冲宽度为10 ms，并且频率（f ）和周期（T ）可调节。
注意：图2B显示了一个方波波形的Arduino代码示例，脉冲宽度为10 ms。将“ TIME”（以橙色突出显示）替换为所需的以毫秒为单位的周期（T），即，对于0.50 Hz的频率（f），T = 2,000 ms。对于双电极系统，请选择两个刺激针，例如图2B中示例代码所示的针2和3。

图2。电刺激的水母。A.刺激Aurelia aurita月水母中肌肉收缩的方波示意图。信号放大e为3.7 V，脉冲宽度为10 ms。可以根据需要调整信号频率（f）和周期（T）。B.使用两个刺激针，刺激针2和3（与图3B中的黄色针相对应）执行（A）中信号的示例代码。要调整信号频率，请将“ TIME”（橙色突出显示）替换为以毫秒为单位的周期。

要构建一个电极：
将两条涂有PFA的银丝切成10厘米长，或至少是水母直径的一半。
注意：先前实验中使用的动物直径在9.8到19.0厘米之间。

在明火上对银线的两端进行火焰处理，以剥去PFA涂层并露出银尖。
将两根铂金棒切成1厘米长。
我们Ë烙铁，帮助手工具，和镊子来操纵铂棒，银线，和一个LED就位（见图3A供参考）。
注意：使用较高的温度（例如450 °C或更高）以改善焊接过程。

图3.水母游泳控制器的微电子组件。A.一种电极，包括以下组件：红色TinyLily LED，弯曲成鱼钩状的焊接铂丝头，焊接PFA涂层的银线（如B所示，通过黄色和黑色引脚连接到微控制器），和热熔胶涂层以防水。B. TinyLily微控制器，带有两个标记为黄色的激励引脚（引脚2和3），两个接地引脚分别为黑色和青色以及一个电源引脚为红色。照片来源：Tiny Circuits。C.锂聚合物电池（Powerstream），当连接到B中的红色和蓝色引脚时有效。

将每个铂棒的一端焊接到LED的正极和负极。
将每条银线的裸露一端焊接到LED端子上。
使用热熔胶覆盖LED，以密封焊料连接。
将一条热熔胶直接压在羊皮纸上，然后将LED放在胶水上。羊皮纸不会粘附在粘合剂上。
轻轻将电极按入粘合剂中，以确保覆盖表面。
等待粘合剂变干（大约1分钟），然后用镊子拾起电极，该电极现在已涂在一侧。
将另一条热熔胶条挤压到羊皮纸上。
将电极的另一侧压入粘合剂中，以确保覆盖表面。
等待粘合剂变干，然后根据需要修剪多余的胶水。
确保没有焊料暴露在空气中。
注意：暴露的焊锡将增加电解过程中产生的氢气泡，长时间内可能对水母中胚层造成组织损伤。

使用镊子将铂金棒弯曲成鱼钩状，如图3A所示。
重复步骤A2，建立多个电极。
修剪牙签，去除至少1/3的总长度，并保留其余部分。该剩余部分的长度可以根据水母手掌中组织的深度根据需要进行调整。
使用热熔胶将牙签的钝端连接到圆柱形塑料外壳上，如图1C所示，以供参考。
将连接到电极负极的裸露银线焊接到TinyLily接地引脚上（图3B中黑色标记）。可以将多根导线焊接到该接地引脚上。
将连接到电极正极的裸露银线焊接到TinyLily刺激引脚上（对于两电极示例，将一根导线焊接到引脚2上，另一根焊接到引脚3上，如图3B中的黄色所示）。
注意：使用万用表测试连接。

将LiPo电池的正极和负极（图3C）焊接到Tiny Lily的相应端子上（在图3B中标记为红色和蓝色）。
当信号打开时，LED指示灯将闪烁，以可视方式确认游泳控制器处于活动状态。图1C显示了带有红色LED电极的主动游泳控制器的示例。

注意：焊接时请注意不要使电池短路。一种技术是将收缩包装或其他不导电的材料应用于电池引线。避免使用与步骤A6中相同的接地端子。

可选：将胶带缠绕在微控制器和电池上，以在将所有连接固定到塑料外壳之前将其固定到位。
使用热熔胶将中央电子设备（焊接的微控制器和电池单元）固定到圆柱形塑料外壳（离心机盖）中。确保电极和电极线在外壳外部。
使用热熔胶将扁平的圆形塑料片固定到圆柱形片上，如图4所示。
注意：在安装平板之前，请确保电极线从中央壳体均匀地向外定向。用粘合剂固定外壳后，卸下电子设备将损坏银线，并可能断开与电极的连接。

图4.两电极游泳控制器的侧视图，显示了扁平的聚丙烯片（黑色），带有一个银色垫圈，用于压载系统。比例尺，1厘米。

通过使用垫圈和/或软木塞相应地抵消微电子器件的重量，直到整个微电子系统在所需的盐水中中性漂浮，如图4所示。
注意：组装这些设备之前，确定闲置的游泳控制器上的浮力很有帮助。但是，由于金黄色球菌对浮力的变化敏感，因此应在适当的水条件下（即盐浓度和水温保持中性的浮力）对完全组装的装置进行重新测试。此外，更换游泳控制器的压载物可以确定方向，以改善单向游泳稳定性，即，游泳控制器的设计使其最重，可以向下游泳到水箱的底部（Xu和Dabiri，2020年），以及底部沉重，可以向上游泳到海面（Xu等，2020a）。

将游泳控制器插入水母中
将水母近伞状表面向上放置在装有盐水的容器中。
将牙签插入器械，以便将塑料外壳直接放在胃和口腔臂上。确保将整个木针牢固地嵌入水母中。
用一只手牢固地握住海the铃。用另一只手将一个电极嵌入海ly中，然后弯曲动作将鱼钩形的铂金棒尖固定到组织中。
埋入电极应尽可能快地进行，以免动物过度运动，否则可能导致电极拉动组织。
嵌入的最佳位置是从动物的底部朝向边缘。因为边缘组织很薄，所以将电极嵌入边缘（半径R）和中途（半径R / 2）之间的径向距离就足够了。
正确的技术可确保将水母组织牢牢固定，并需要付出额外的努力才能将设备从动物身上移除。如果电极没有很好地嵌入组织中，或者电极掉落在动物身上，请再次重复该过程，直到牢固固定为止。避免直接嵌入同一位置，否则可能导致过度的组织损伤，从而无法正确插入电极。
对多个电极重复步骤B3。确保电极均匀分布，即，对于两电极系统，电极应对称地嵌入动物体内（参见图1A）。

在实验室进行直接自由游动实验
向储罐中注入去离子水。
将速溶海盐混合物添加至所需的盐度（35 ppt）。
要开始添加盐，首先假设没有杂质，首先估算所需的盐混合量（Arain，2020年）。
注意：将盐混合物加入去离子水中。在盐混合物中添加去离子水会形成钙沉淀，这会导致浑浊的水。

使用折光仪测量盐度，并相应地添加更多的盐混合物。
充分混合水，最好使用自动泵将水再循环。
平衡至少几个小时，理想情况下过夜。
使用折光仪测量盐度，并相应地调整盐或水含量。
用毛巾或其他清洁工具清除储罐侧面的气泡。
将水母（无嵌入式游泳控制器）在水中至少放置4小时，最多过夜。这将确保组织密度与周围的水大致保持中性。
可选：在1.8米长的水箱底部放一个网，以收集水母进行实验。
注意：由于这些动物将从水箱顶部开始，然后向下游泳，因此最容易使用一批多只动物进行这些实验。对于连续运行，先前试验中的生物混合型机器人水母将留在水箱底部，直到对所有动物进行测试为止。按照步骤C10至C12所述，使用网将所有动物带到水箱的顶部以将其移出，然后至少等待30分钟以使水恢复到静态状态。

设置的照相机，例如。，1920 ×在对60帧1080分辨率的Cyber-shot DSC-RX100，如在图5中示出以记录动物游泳视频。

图5.垂直游泳实验的实验室设置。用于计算生物混合机器人水母的垂直游泳速度的实验室实验设置包括以下组件：一个1.8米高的丙烯酸水箱，里面装有盐水（35 ppt），背板（黑色或白色）贴在水箱的后面板上，生物混合机器人水母（向下游动，从水箱顶部开始），水箱底部的可选网（便于从实验后移走水母）和摄像头来录制视频。黄色框突出显示了水箱中动物远离水箱侧面，顶部和底部的区域，可以最大程度地减少壁效应的干扰。

将背景板粘贴到水箱后面板的外部，如图5所示。这将确保背景是统一的颜色，并简化了数据分析。
注意：要跟踪游泳控制器，请使用白板，以便通过半透明的动物最大程度地看到游泳控制器的外壳（图8A）。要跟踪整个动物，请使用一块在动物组织上有足够照明的黑色黑板，这看起来是不透明的白色（图8B）。跟踪整个动物可以允许对几何参数进行额外分析，例如整个游泳周期中动物随时间变化的直径或收缩和放松的时间段。

用梯子进入水箱的顶部。按照步骤B所述，将活动的微电子游泳控制器插入水母中，同时将动物放在水箱的顶部。
用两只手将动物放在水箱顶部，等待水变得相对静止，大约2分钟。
慢慢释放动物，注意将水搅动到最小。让动物向下游到水箱底部。
在连续的试验之间至少等待5至15分钟，以使水恢复到静止状态，具体取决于生物混合机器人水母产生的干扰量。
对其他动物重复步骤C7至C10。
一旦所有动物都放在水箱底部，请使用网将所有生物混合型机器人水母捕获到水面，然后从水箱中取出。
对于其他试验，请至少等待30分钟，以使水恢复到静态状态，具体取决于生物混合机器人水母和网产生的干扰量。
重复步骤C7至C13，直到测试所有实验参数（例如，频率从0.25到1.00 Hz以及在0 Hz时没有活动游泳控制器的控制案例），如Xu和Dabiri （2020）所述。完成所有试验后，继续进行程序E的实验后步骤。

进行直接的自由游动原位实验（沿海条件）
准备进行现场实验。
将彩色的扎带以30.5厘米的交替颜色（红色和黄色）连接到潜水绳上。修剪多余的拉链领带材料。附着在绳子上的其余部分用作数据分析的背景标记。
扎潜水重量（例如，2.5公斤）到绳索的一端。
按照步骤B所述，将一个有源微电子游泳控制器插入水母中，将每只动物放在一个装有符合野外条件的盐水的单独塑料容器中（请参见图6C）。
用相应的盖子盖住塑料容器。
注意：请确保塑料容器中充满盐水，以最大程度地减少可能对水母产生不利影响的气泡。

将塑料容器放在绝缘的盒子中以携带到现场（图6B）。确保将容器固定好，并且不要在包装箱内移动；如果容器可自由移动，请使用填充物或其他填充材料。
注意：将额外的游泳控制器（嵌入泡沫中以提供保护），动物，电池供电的烙铁，剪刀和其他有用的工具带到现场。

将摄像机放在防水塑料外壳中，例如，将Gates AX100水下机壳中的Sony AX100摄像机。
如图6A所示，让两名SCUBA潜水员准备好装备并入水（标记为“ Divers 1 and 2”）。
如图6A所示，允许一个人呆在岸上或码头上，并带有生物混合机器人水母和其他实验材料和设备（标为“岸上人”）。

图6.在马萨诸塞州伍兹霍尔的沿海条件下进行的野外实验。A.在马萨诸塞州沿海水域进行游泳实验需要两名SCUBA潜水员和一名岸上人员。岸上的人可以将绳索绑在码头柱子上，并将生物杂交机器人水母操纵给一个潜水员（D所示），后者可以将水母放到绳索附近的海底作为背景特征。第二位潜水员可以录制生物混合机器人水母的视频。B.将生物混合自动水母装入塑料容器中，并存放在隔热的聚苯乙烯泡沫塑料盒中，并在泡沫中嵌入额外的游泳控制器。C.在塑料容器中的一种生物混合机器人水母的图像。D.潜水员拿着装有生物混合机器人水母的容器，准备进行垂直游泳实验。请注意，带有红色和黄色标记的绳索是可见的，固定在木制码头柱上。

潜水员1：将绳索的加重端放在海底上以进行沿海实验，如图7所示。

图7.垂直游泳实验的现场设置。用于在沿海条件下进行原位实验以计算生物混合机器人水母的垂直游泳速度的装置包括以下组件：带有红色和黄色标记交替的绳索，其重心位于海底并牢固地固定在水面；一名潜水员，带有水下摄像头，可以记录试验视频；第二个潜水员使用容器将动物操纵到海底的初始位置；和生物混合机器人水母向上游泳。

上岸人员：将绳索的另一端系到船坞或其他表面结构上，确保绳索拉紧以最大程度地减少绳索的运动。绳索应该在录制的视频的背景中可见以进行数据分析（30 fps时为1,920 × 1,080分辨率）。
上岸人员：取下盖子，将装有生物混合机器人水母之一的塑料容器交给Diver 2，如图6D所示。
潜水员2：将塑料容器轻轻浸入水中，注意确保微电子系统仍完全嵌入水母中。将容器移到背景绳附近的海底。轻轻释放生物混合型机器人水母，并确保动物正确定向以进行向前游泳。
潜水员1：录制生物混合机器人水母的视频，注意尽量减少潜水员和照相机的运动，并使绳索标记在背景中可见。尽可能跟踪海底到海面（1.6 m）的水母，并在相机的深度轴上（图像平面内外）以最小的运动。
潜水员2：一旦动物到达海面，就将生物混合型机器人水母捕获在塑料容器中，然后将容器交还给岸上的人。
岸上人士：要获得控制箱，请切断电极丝，并注意确保所有微电子器件仍牢固地嵌入动物体内。将生物混合型机器人水母放入塑料容器中，送回Diver 2。
对照案例被定义为试验，其中嵌入了游泳控制器，但是无效（0 Hz）来确定每只动物的基线游泳频率和速度。
潜水员1和2：重复步骤D7至D9。
对其他动物重复步骤D6至D11 。完成所有试验后，继续进行程序E的实验后步骤。

进行实验后程序
轻轻跟随鱼钩状铂金棒的曲率，从动物身上取下电极，以最大程度地减少组织损伤。
轻轻地将木销从操作架中拉出，以卸下塑料外壳。
将动物放回其居住环境。
喂动物（例如与无节制无节幼体）以促进恢复。

数据分析

用MATLAB计算生物混合机器人水母的单向游泳速度和增强因子。
将视频转换为图像。
使用ImageJ获取动物的直径，游泳控制器外壳以及其他相关几何参数（如果需要）（以像素为单位）。（动物和房屋的直径以厘米为单位的已知数量。）
找到所有帧（时间t）的水母游泳控制器（图8A）的（x，y）重心，以像素为单位：（cap x，t ，cap y，t ）
注意：如果使用彩色图像，请将图像分为红色，绿色和蓝色分量，然后过滤以适合游泳控制器外壳的大小和颜色，即图8A中的蓝色。如果在实验室实验中使用深色背景，请找到水母的（x，y）重心，过滤明亮像素以获得不透明的白色组织（图8B）。

图8.实验室条件的代表性图像。A.一种生物混合型机器人水母（红色圆圈）在水箱中向下游泳。请注意，半透明的水母组织与白色背景融合在一起，使游泳控制器可见以进行跟踪。B.一种生物混合的机器人水母（红色圆圈）在水箱中向下游泳。请注意，在黑色背景下，水母组织是白色的，这可以跟踪动物的铃铛和形态参数。为了清楚起见，还可以看到储罐的反射和其他方面，包括侧面端口（最右侧）。比例尺，10厘米。

在照相机静止的情况下，为实验室实验计算垂直位移：
计算每帧的垂直位移（质心与初始起始质心之间的距离）：d t = cap y，t – cap y，0
通过使用图像中的已知比例（例如游泳控制器外壳的直径（2.11厘米）或照相机校准的其他方法），将像素的位移转换为厘米。
注意：选择视频片段，其中动物位于水箱的中心，并仅跟踪水箱中部的垂直位移（请参见图5中的黄色框）。这将最小化因动物游泳太靠近水箱的侧面或底部而造成的壁效应，以及由于初始化实验或先前实验中其他动物在水箱底部发出脉动而在水箱顶部和底部造成的水干扰。

计算原位实验的垂直位移，其中摄像机运动不为零：
在背景中找到绳索标记的（x，y）重心，以像素为单位：（标记x，t ，标记y，t ）。
注意：使用与上述相同的技术，过滤出合适的绳索标记的大小和颜色，即图9中的红色和黄色。

图9.来自原位实验的代表性图像。野外条件下的生物混合型机器人水母，可见在绳子上的背景标记（红色和黄色）。

确定水母相对于背景绳索标记的（x，y）重心：（norm_cap x，t ，norm_cap y，t ）。
注意：由于MATLAB的图像原点定义为左上角，因此方程式应为norm_cap x，t = cap x，t – x分量的标记x，t和norm_cap y，t =标记y，t – cap y ，t为y分量。

计算每帧的垂直位移（质心与初始起始质心之间的距离）：d t = norm_ cap y，t – norm_ cap y，0 。
通过使用图像中的已知比例（例如，后续绳索标记之间的距离（30.5厘米）或其他照相机校准方法），将像素的位移转换为厘米。
如果可见多个绳索标记，请计算后续绳索标记之间的距离（以像素为单位）。如果看不到多个绳索标记，请将距离标记为非数字（NaN）。
在距离之间进行插值以填充NaN值。
注意：请选择视频片段，其中动物要朝向海洋深处的中间，避免进入海底和海面（请参阅上述第4步中的注释）。

使用每对后续时间步长之间的距离（d t + 1 – d t ）乘以相机帧速率（例如，在实验室实验中为60 fps，在野外实验中为30 fps ），计算出不同的游泳速度。
计算平均游泳速度（v ）。
可选：计算归一化的游泳速度，或熟练程度，通过由动物（的直径除以绝对游泳速度d ）：v范数= V / d 。
通过将平均游泳速度（如前所述，用绝对或标准化的速度）除以基线游泳速度（对照例的游泳速度，以不活动的游泳控制器启动动物为0 Hz）来计算增强因子。
注意：Xu和Dabiri （2020 ）中的实验室实验以及Xu等人的现场实验描述了其他信息。（2020a ）。

致谢

我们非常感谢Cabrillo海洋水族馆提供的Aurelia aurita medusae，感谢Angela Fan展示了与该手稿有关的科学艺术品。这项工作得到了美国国家自然科学基金会研究生研究奖学金的部分支持，该研究项目的奖学金编号为DGE-1147470，该奖项于2015年授予NWX。方案附有原始手稿Xu和Dabiri（2020）以及Xu等人的补充。（2020a）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

极光无脊椎动物是不具有大脑，中枢神经系统，疼痛感受器或伤害感受器的无脊椎动物，因此不需要协议的审查或机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。但是，我们根据预防和最小化原则减少了所用动物的数量，并完善了程序以最大程度地减少了潜在的困扰，以确保这些动物的利益为重。我们还监控了水母和微电子系统，以确保我们不会在海洋中引入其他电子废物或其他材料。有关我们的道德观点的更多信息，请参见Xu等。（2020b）。

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