材料和试剂

注意：除非另有说明，否则所有均在室温下保存。

1. 24孔细胞培养板（Corning，目录号：3527）

2. 1.5毫升Eppendorf管（Sarstedt，目录号：72706）

3.用于96孔PCR板的密封垫，可重复使用（Bio-Rad ，目录号：2239442）

4. TwinTec PCR板，半裙96个（Eppendorf，目录号：0030128.575）

5.用于PCR和QX100 ddPCR应用的铝箔密封件（Bio-Rad，目录号：181-040）

6. P20机架式屏障LTS尖端（雨淋，目录号：RT-L20F）

7. P200机架式屏障LTS尖端（雨淋，目录号：RT-L200F）

8. HBV-易感细胞，例如，HepG2细胞-NTCP细胞（镍等人，2014）（在37℃培养箱中维持在5％CO 2的供应和95％湿度）

9. HBV基因型D型病毒库存（储存在-80°C）

10. Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（PBS，Sigma-Aldrich，目录号：D8537）

11. Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，生命Ť echnologies，目录号：41965039，保存于4℃）

12.胎牛血清（FBS，Sigma-Aldrich，目录号：S0615，储存在-20°C）

13. L-Glutam INE（生命Ť echnologies，目录号：25030024，保存于-20℃）

14.青霉素（10 ，000 U / ml）的链霉素（10毫克/毫升）（生命Ť echnologies，目录号：15140-122，储存在-20℃）

15.二甲基亚砜（DMSO，默克（Merck），目录号：102950）

16.聚乙二醇（PEG 8000，PBS中的40％溶液，Sigma-Aldrich，目录号：89510）

17.胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T3924，在4 °C下储存）

18. NucleoSpin ® Tissue试剂盒（马歇雷-Nagel的，目录号：740952）

19.多通道移液器（Eppendorf，目录号：3125000036）

20. 10 × Cutsmart缓冲液（NEB，目录号：B7204 ，小号撕在-20 ℃下）

21. HHA I（NEB ，目录号：R0139 ，小号撕在-20 ℃下）

22. PCR-级ħ 2 O（例如，贝朗Melsungen的，用于注射目的的）

23. RecJ ˚F （NEB ，目录号：M0264 ，小号撕在-20 ℃下）

24. T4 DNA连接酶（NEB ，目录号：M0202 ，小号撕在-20 ℃下）

25. 10毫分子级ATP（NEB ，目录号：P0756 ，小号撕在-20 ℃下）

26. XbaI位I（NEB ，目录号：R0145 ，小号撕在-20 ℃下）

27. DNAZap PCR DNA降解溶液（Thermo Scientific ，目录号：AM9890 ，在4 °C时破裂）

28. VIC标记的TaqMan TM拷贝数参考测定对于人核糖核酸酶P基因（Applied Biosystems公司，目录号：4403328 ，小号撕在-20 ℃下）

29. ddPCR超混合液为习题ES（Bio-Rad公司，目录号：1863010 ，小号撕在-20 ℃下）

30.引物/探针的cccDNA检测（从基因组学欧陆有序，小号撕在-20 ℃下）

cccDNA的为：5 ' -CACTCTATGGAAGGCGGGTA-3 '
cccDNA的启：5 ' -ATAAGGGTCGATGTCCATGC-3 '
cccDNA的探针：5 ' -FAM- AACACATAGCGCACCAGCA-BHQ1-3 '
31.引物/探针总HBV DNA（从基因组学欧陆有序，小号撕在-20 ℃下）

HBV总额为：5 ' -GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3 '
总HBV启：5 ' - GACAAACGGGCAACATACCTT-3 '
总HBV探头：5 ' -FAM-TGAGGCATAGCAGCAGGATG-BHQ1-3 “
32. DG8墨盒（伯乐，目录号：186-4008）

33. DG8垫片（伯乐，目录号：186-3009）

34.液滴阅读器油（Bio-Rad ，目录号：186-3004）

35.探针的液滴产生油（Bio-Rad ，目录号：186-3005）

36.生长培养基（请参阅食谱）

37.感染介质（请参见食谱）

38.连接组合（请参阅规则）

39.线性化混合（请参阅规则）

设备

用于Rainin P20吸头的移液器（Rainin，目录号：17014392）
用于Rainin P200吸头的多通道移液器（Rainin，目录号：17013805）
热循环仪（Analytik Jena Biometra，FlexCycler 2 ）
QX200 TM液滴发生器（伯乐，目录号：1864002）
PX1 PCR平板封口机（Bio-Rad ，目录号：1814000）
C1000触摸TM热循环仪96 -深井反应模块（Bio-Rad公司，目录号：1851197）
QX200 TM液滴读取器（Bio-Rad ，目录号：1864003）

软件

QuantaSoft（Bio-Rad ）
微软Excel
棱镜（GraphPad）

程序

样品制备
感染前一天，以24孔格式在生长培养基中每孔播种2.5 × 10 5个细胞。
在含有4％PEG 8000感染介质感染细胞与HBV病毒储过夜（镍等人，2014）。
在室温（RT）下用PBS洗涤细胞两次，并保持在感染培养基中直至所需的收获时间。
在室温下用500μlPBS洗涤细胞，并添加100μl胰蛋白酶。
在37°C下孵育直至细胞分离（〜5分钟）。
用900μl冷培养基重悬细胞，然后转移至1.5 ml Eppendorf管中。
在室温下以500 × g离心5分钟，然后除去上清液。
ø ptional：˚F reeze在-20粒料℃下直至进一步使用。

提取使用NucleoSpin细胞沉淀的总DNA ®根据制造商的说明Tissue试剂盒，但洗脱50微升洗脱缓冲液预热至70 ℃。

转化反应
使用DNA Zap溶液清洁硅密封垫，用去离子水冲洗，然后在纸巾上晾干。
制备限制性消化反应在96孔板中含有10微升提取的总DNA的，2微升的10 × Cutsmart缓冲液，0.5微升HHA I，0.25微升RecJ ˚F ，和7.25微升ħ 2 O.
用多通道移液器上下吸移10次进行混合，注意避免产生气泡。
用干净干燥的硅垫密封。
在热循环仪中运行以下程序：3个循环，分别在37 °C下15分钟和42 °C下15分钟，在80 °C下20分钟，并保持在16 °C。
雷莫已经垫Ç arefully并添加10微升的连接混合物。
用多通道移液器上下吸移10次进行混合，注意避免产生气泡。
在热循环仪中于16 °C孵育2小时，在80 °C孵育20分钟，并保持在16°C。
删除了仔细垫，并添加5微升的线性组合的。
用多通道移液器上下吸移10次进行混合，注意避免产生气泡。
在热循环仪中于37 °C孵育60分钟，在80 °C孵育20分钟，并保持在16 °C。
可选：S在-20°C下撕碎样品。

液滴的产生和阅读
通过加入52.5稀释样品2.5倍微升ħ 2 O.
用多通道移液器上下吸移10次进行混合，注意避免产生气泡。
为每个样品准备两个反应：（1）cccDNA和RNaseP细胞对照，以及（2）HBV DNA和RNaseP细胞对照。制备ddPCR混合在一个96孔板（22微升每个反应）（见表1）。

表1.每个反应的ddPCR混合物组成

试剂

专注

微升

ddPCR Supermix探针

2 ×

11

TaqMan TM拷贝数参考测定（VIC标记的RNaseP）

10 ×

1.1

正向引物（cccDNA或总HBV DNA）

100微米

0.033

反向引物（cccDNA或总HBV DNA）

100微米

0.033

FAM标记的探针（cccDNA或总HBV DNA）

100微米

0.033

高氧2

4.5

稀释模板

5.5

使用不含塑料的Rainin吸头。在ddPCR液滴生成器上生成液滴：
将20μl的ddPCR混合物添加到试剂盒的样品室中。
使用多通道移液器在油室内添加70μl液滴产生油。
附上橡胶垫圈，将墨盒放入液滴发生器中，然后运行液滴产生过程。
Gentl ÿ转移42微升使用多通道移液管将所生成的液滴的一个TwinTec 96孔板。
重复小号TEPS Ç 4a至Ç 4d中，直到所有的样本被加载到TwinTec 96孔板。
密封用aluminu板米箔密封使用的板盖。
直接密封后，在深阱PCR机与以下程序运行PCR：10分钟在95 ℃; 在95 °C下10 s，在54 °C下15 s和在68 °C下20 s的40个循环; 在95 °C下放置10分钟，并在12 °C下保持。
将TwinTec 96孔板转移到QX200 Droplet Reader。
使用Quantasoft软件（按照制造商的用户指南）设置模板，使用FAM（通道1）和VIC（通道2）的通道读取墨滴。
根据阳性和阴性对照定义阳性和阴性液滴的阈值，之后该软件将自动量化每个RNaseP的cccDNA值和每个RNaseP的总HBV DNA值。

数据分析

在Quantasoft软件中，我们使用2D图形绘制HBV DNA和RNaseP阳性液滴的阈值（图1）。所有HBV DNA总量和所有cccDNA测定的阈值分别设定。对于数据表示，我们使用每个样品的总HBV DNA / RNaseP和cccDNA / RNaseP比率，并具有PoissonRatioMin和PoissonRatioMax值，可得出ddPCR技术误差的95％置信区间。

图1.使用QuantaSoft进行数据分析。荧光强度用于分离含有扩增子的液滴，检测基于FM荧光（y轴）的HBV cccDNA（左）或HBV DNA总数（右）；和RNaseP，基于VIC荧光（x轴）。基于阳性和阴性对照反应确定阳性信号（pin k）的阈值。（转自Tu等人，2020年a ）。

笔记

我们已将该协议用于从以12孔至96孔板状感染的细胞中提取的DNA提取的DNA。在12孔板中，我们建议以ELUT Ë在两倍体积的DNA。
对于倒置，我们建议输入总DNA提取物<2 µg。如果总DNA输入小于200 ng，我们还建议添加200 ng载体DNA（例如无关的质粒DNA）。
我们通常以200个病毒基因组当量进行HBV感染。但是，由于该检测方法足够灵敏，可以检测到极少量的被感染细胞，因此也可以用较小的接种量进行感染（Tu等人，2020a ）。
该协议也可用于基于Taqman的qPCR而不是ddPCR。
该测定仅与大多数体外HBV感染测定中使用的基因型D的HBV序列兼容。不幸的是，由于Hha I限制性位点的变化，它不适用于其他基因型。HBV的大多数体外测定都是使用D型基因株进行的，该缺点无法分析临床样品。
推荐的用于优化和质量控制的控件：
阳性对照以显示检测效率（总HBV DNA定量应与cccDNA定量相近）：HBV circDNA （Mutz et al。，2018）或HBV 1.1超长质粒掺入未感染细胞提取的DNA中。
阴性对照显示cccDNA的选择性定量：从肝素纯化的病毒中提取的DNA （Seitz等，2016）掺入未感染细胞提取的DNA中。
阴性对照细胞感染期间确定来自病毒接种信号：细胞治疗进入抑制剂（例如，Myrcludex B）之前，HBV感染（Donkers等人，2017）。
没有模板对照和未感染的细胞对照来确定非特异性扩增的水平。

菜谱

生长培养基
500毫升的DMEM

50毫升的FBS

5毫升的L-谷氨酰胺

5毫升的青霉素（10 ，000 U / ml）的和链霉素（10毫克/毫升）

感染培养基
49毫升的生长培养基

1毫升的DMSO

连接混合物（10每个样品微升）
3微升的10毫摩尔ATP
1微升的10 × NEB缓冲Cutsmart

0.5微升的T4连接酶

5微升H 2 O

线性化混合物（每个样品5 µl）
0.5 µl的10 × Cutsmart缓冲液

0.5微升的XbaI位我

4微升H 2 O

致谢

该协议已在Tu等人中发表。（2020一）。Thi的工作获得了以下资金的资助：Deutsche Forschungsgemeinschaft（DFG，德国研究基金会）项目编号240245660 – SFB 1129（BZ和SU）；德国感染研究中心（DZIF）TTU肝炎项目5.816和5.704（SU和TT）；以及澳大利亚艾滋病毒和肝炎病毒学研究中心（TT）。感谢KathleenBörner博士对使用ddPCR设备的培训和支持。

利益争夺

斯蒂芬城市是共同申请人和共同发明人关于专利保护HBV的preS-衍生脂肽（bulevirtide / Hepcludex ® ，以前Myrcludex B）为IR使用作为HBV / HDV进入抑制剂。这项研究的其他作者宣称没有利益冲突。

参考

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