材料和试剂

1.组织培养皿-3 5毫米（VWR，目录号：10861-656）

2.组织培养皿-60毫米（VWR，目录号：10861-658）

3. ＃1.5厚度圆形玻璃盖（VWR，目录号：72230-01）

4.无菌无菌移液吸管2 ml（Fisher Scientific，目录号：13-675-17）

5.无菌无菌移液吸管5 ml（Fisher Scientific，目录号：13-675-22）

6.无菌无菌移液吸管10 ml（Fisher Scientific，目录号：13-675-17）

7.无菌无菌移液吸管25 ml（Fisher Scientific，目录号：13-675-30）

8.锥形离心管，15毫升（Fisher Scientific，目录号：12-565-269）

9.锥形离心管，每毫升50毫升（Fisher Scientific，目录号：12-565-270）

10.孔径为0.45 µm的无菌注射器过滤器（VWR，目录号：28145-505）

11.无菌瓶的过滤器在0.8微米孔径（Fisher Scientific公司，目录号：09-740-1C）

12. 10毫升无菌注射器（Fisher Scientific，目录号：14-817-54）

13. C57BL / 6新生小鼠（出生后0-1天； P0-P1）

14. Na 2 SO 4 （Fisher，目录号：S421），在室温（RT）下储存

15. K 2 SO 4 （Avantor ，目录号：3282），储存在室温下

16. MgCl 2 （Fisher，目录号：AM9530G），储存在室温下

17. HEPES（Gibco ，目录号：15630080），在4°C下存储

18.葡萄糖（Gibco ，目录号：15023-021），储存在室温下

19. 0.5％酚红（Sigma，目录号：P0290-100ml），在室温下保存

20. NaOH （Fisher，目录号：SS266-1），储存在室温下

21.羟尿酸（Sigma，目录号：K337 5 ），在室温下保存

22.来自小鼠的层粘连蛋白（Corning，目录号：354232），储存在-80°C

23.聚-D-赖氨酸（Gibco ，目录号：A3890401），在4°C下储存

24.钢笔/链球菌（Thermo Fisher，目录号：15140122），存储在-20°C下

25. GlutaMAX （Gibco ，目录号：35050-061），存储在RT

26.牛小牛血清（BCS），热灭活的（Gibco ，目录号：16030074），在-20°C下储存

27. L-（+）-半胱氨酸盐酸盐（Therm o Fisher，目录号：C562-25），保存在室温下

28.木瓜蛋白酶乳胶（沃辛顿生物化学公司，目录号：LS003126），储存在4°C下

29.来自鸡蛋白的胰蛋白酶抑制剂（Mil lipore Sigma，目录号：T2011 ），在4°C下储存

30.基础中型鹰（BME; Gibco ，目录号：21-010-046），在4°C下存储

31. Neurobasal A（Gibco ，目录号：10888022 ），储存在4°C下

32. B27 plus（Gibco ，目录号：17504044 ），在-20°C下存储

33. 70％乙醇（VWR，目录号：97064 -768）

34. ActinS14V.CIB.GFP质粒构建体（Addgene ，质粒＃133620），保存在4°C

35. Cry2PHR-MCH-COF质粒构建体（Addgene公司，质粒＃133619）中，存储在4℃下

36. Lipofectamine 2000 （Thermo Fisher，目录号：12566014），在4°C下储存

37.叠氮化钠（Fisher Scientific，目录号：26628-22-8），在室温下储存

38. 2-脱氧-D-葡萄糖（DDG）（Fisher Scientific，目录号：154-17-6）存储在室温下

39. Opti -MEM（Thermo Fisher，目录号：31985062），存储在4°C下

40.组织培养水（TC水；高压灭菌的Milli- Q水），在室温下储存

41.冰（用于将工作溶液保持在4°C ）

储备溶液（请参阅食谱）

股票解离介质，在4°C下储存
10 × Ky.Mg储备，-20°C储存
储备涂料溶液（PDL储备液，在-20°C下储存，层粘连蛋白储备液在-80°C下）
1½溶液，储存在-20°C
半胱氨酸.HCl储备溶液，储存在-20°C
2.5 M葡萄糖溶液，储存在4°C

工作解决方案（请参阅食谱）

工作解离介质（DM / Ky.Mg ）–准备100毫升/培养物
与血清生长培养基（SGM ）-洗涤（制备为50ml /培养物）和电镀（需要小号为2ml /35毫米培养皿）
无血清的Neurobasal A-B27的生长培养基（GM）-需要小号为2ml /35毫米培养皿
的Optimem /葡萄糖-需要小号为50ml /培养
酶（木瓜蛋白酶）溶液-需要小号为10ml /培养
胰蛋白酶抑制剂溶液-需要š为10ml /培养
转染培养基（TM）–需要s 200 µl / 35 mm培养皿
有效的PDL解决方案
层粘连蛋白-PDL涂层溶液

设备

大型金属剪刀（精细科学工具，目录号：14001-18）
小（波恩）剪刀（精细的科学工具，目录号：14184 - 09 ）
Vannas弹簧剪刀（精细科学工具，目录号：15000-00）
镊子（Roboz ，目录号：RS-5050）
弯曲钳（Fine Scientific，目录号：91197-00）
锅铲（精细科学工具，目录号：10090-13）
P20 PIPETMAN（Fisher Scientific，目录号：F123600G）
P200 PIPETMAN（Fisher Scientific，目录号：F123601G）
P1000 PIPETMAN（Fisher Scientific，目录号：F123602G）
Drummond Pipet-Aid（Fisher Scientific，目录号：13-681-08）
4°C冰箱
Laxco Zoom Stereo Zoom Microscop e，0 .67 × 4.5 × z oom （Fisher Scientific，目录号：Z220PLS200L）
Laxco iLED系列LED光源（Fisher Scientific，目录号：AMPSILED22）
水浴，37 °C （V WR，目录号：WB02）
用于水浴的金属珠（VWR，目录号：10158-552）
生物安全柜（Fisher Scientific，目录号：13-261-334）
将水套式CO 2组织培养培养箱设置为5％CO 2和37°C（Fisher Scientific，目录号：11-676-600）
组织培养显微镜，例如EVOS Floid Cell成像站（Fisher Scientific，目录号：4471136）
回转斗式离心机和转子（Fisher Scientific，目录号：75-410-885）
pH计（Fisher Scientific，目录号：13-636-AE153）
Keyence（BZ-X800）数字显微镜，用于活细胞成像
色带（红色，高级医疗设备，目录号：H20130）
灭菌袋（圣克鲁斯生物技术，目录号：SC-363641 ）

软件

斐济（Schindelin等人，2012）配备了Bio - Formats软件包（Linkert等人，2010）
GraphPad Prism （适用于Windows的8.0版，GraphPad软件，美国加利福尼亚州圣迭戈，www.graphpad.com）

程序

提前5-6天准备
保护盖玻璃的清洁和消毒程序：在100％乙醇中将保护盖玻璃清洗2天，然后在Milli- Q水中重复清洗2天；干燥存放在RT上。
通过剪裁红色色带乐队，检查用于斩首的剪刀的锋利度。
高压灭菌器解剖工具分别放在灭菌袋中。

镨epare 24 ħ事先培养制备物
代替4-微盖玻璃ES中的每个组织培养板和涂覆板用层粘连蛋白P d大号在水中使用，并将它们前涂布溶液（使用1毫升/ 35mm培养皿），用于至少24小时（48小时更好）带夹套的CO 2培养箱。
除去包被溶液，并在培养当天用TC水（高压灭菌的Milli- Q水）洗涤平板两次。然后将其在通风橱中干燥（如果制成的培养皿多于培养所需的培养皿；将其包裹在封口膜中，并在涂布后在4°C的冰箱中保存长达一个月）。如果使用先前-存储在4℃的冰箱包被的板，带板，以RT通过将它们放置在生物安全柜; 为了进一步减少污染的可能性，紫外线将生物安全柜中打开的板消毒15分钟。

在文化的一天做好准备
准备工作解离介质（DM / Ky.Mg ）。每种培养物至少需要60毫升（储存在4°C下）。
制备˚F RESH ģ rowth培养基的血清（SGM起始神经元培养过程之前）。
在开始神经元培养程序之前，准备新鲜的生长培养基（GM）。
在开始培养程序之前，准备酶（木瓜蛋白酶）溶液。
在开始培养程序之前，准备胰蛋白酶抑制剂溶液。

宏观剖析（图1和2）
在生物安全柜中运行紫外线15分钟。
用70％的乙醇擦拭解剖台和解剖显微镜，然后在解剖台上放一个小的生物危害袋和薄纸。
将高压灭菌的解剖工具放在生物安全柜中。
在60 mm培养皿中吸取5 ml DM / Ky.Mg ，并将其放在冰上。
在35毫米培养皿中吸取2毫升DM / Ky.Mg ，并将其放在冰上。
将新生小鼠（出生后0-1天； P0-P1）放入认可的容器中的组织培养室。
注意：用于培养的小鼠数量取决于垫料的大小，实验条件的计划数量和重复次数。

向小鼠喷洒乙醇，然后通过斩首迅速安乐死。
使用手术刀，从鼻骨到枕骨表面切开切口，露出颅骨。
颅骨暴露后，使用剪刀或手术刀沿鼻骨和中线进行T形切割。
从鼻骨两眼之间的起点开始，沿着矢状缝线切开颅骨。
轻轻取出顶叶和interparietal从两侧钳骨头。
然后，大脑应该变得可见。取出骨头时要格外小心，以免损坏脑组织。
我们Ë所述弯曲刮铲到隔离脑，并立即将其放入60毫米陪替氏培养皿用冰冷的DM / Ky.Mg 。

图1.分离大脑的步骤的示意图（宏观解剖）。对新生小鼠断头后，去除皮肤以露出头骨（步骤1）。使用手术刀沿中线切割颅骨（步骤2A），并使用一对细尖的镊子将颅骨部分切除（步骤2B）。用手术刀或刮刀提起完整的大脑（步骤3A），并将其放入装有冰冷解剖培养基（DM / Ky.Mg ）的60 mm培养皿中（步骤3B）。示意图是使用BioRender.com创建的。

图2.宏观解剖过程中拍摄的代表性图像。A.去除皮肤后暴露的颅骨（图1中的步骤1）。B.显示沿中线露出大脑的切口方向的线（图1中的步骤2）。C.暴露完整的大脑（图1中的步骤3A）；A'-小脑; b'-脑半球；c'-眼; d” -olfactory灯泡。使用配备有18MP彩色CMOS显微镜相机的AmScope SM-4TZ-144A三目立体显微镜记录图像。

显微解剖（图s 3和4）
取出小脑并分开两个半球。
将具有大脑的60毫米培养皿置于立体显微镜下的ice d DM / Ky.Mg中，进行以下步骤。
仔细暴露并取出海马体；然后将它们放入35毫米的装有冰冷DM / Ky.Mg的碟子中; 对用于培养的每个大脑重复这些步骤。
如果显微镜不具有冷却功能，可以执行微-在干净的10cm平皿用冰冷的顶夹层; 当对多个大脑执行此过程时，请经常更换冰块。
开始将水珠上的木瓜蛋白酶（酶）溶液预热至37°C。

图3.分离海马的步骤的示意图（显微解剖）。我们Ë手术刀以使冠状切口以除去小脑（步骤1A），然后，通过沿中线（步骤1B）矢状切割两个半球分离。在体视显微镜下，转动半球，使内侧表面朝上；然后使用细镊子去除皮层下结构（纹状体，丘脑和脑干）以暴露海马（第2步）。海马表现为位于折叠皮层下方的月牙形结构（第3步）。用一把镊子夹紧，用嗅球将大脑固定住，同时用另一把镊子轻轻剥开海马上方的脑膜。我们è细镊子沿着喀嚓来剖析出海马（步骤3）。将分离的海马收集到带有冰冷的DM / Ky.Mg的35 mm培养皿中，或直接收集到包含10 ml DM / Ky.Mg的50 ml无菌离心管中（步骤4）。示意图是使用BioRender.com创建的。

图4.海马分离过程中拍摄的代表性图像。A.分离的大脑半球（图3中的步骤1）。上部图像：一个” -大脑半球; B” -嗅球。下图显示了一个半球体，其内侧表面朝上（图3中的步骤2）和皮层下结构（c' ）。B.去除皮层下结构（纹状体，丘脑和脑干）后，内侧表面朝上且暴露的海马（HPP）的半球。C.分离的海马体（图3中的第3步）。使用配备有18MP彩色CMOS显微镜相机的AmScope SM-4TZ-144A三目立体显微镜记录图像。

木瓜蛋白酶消化
将分离的海马转移到装有10 ml DM / Ky.Mg的50 ml无菌离心管中。
用移液器辅助液用10 ml冰冷的DM / Ky.Mg将海马洗涤3次；避免用移液器接触海马体。
后3次洗涤后，DM / Ky.Mg应保持在生物安全柜RT 。
向装有海马体的50 ml无菌管中加入5 ml加热的酶溶液，并在37°C的水浴中孵育15分钟。
除去酶溶液，以避免接触到海马和另外5毫升酶溶液加入到管中并进行另外15分钟的温育。
用5 ml的DM / Ky.Mg清洗海马3次。

酶抑制
开始在37 °C水浴中加热胰蛋白酶抑制剂溶液和Optimem /葡萄糖溶液。
将3 ml温暖的胰蛋白酶抑制剂溶液添加到海马体中，并在37°C水浴中孵育3分钟。
用3 ml新鲜的胰蛋白酶抑制剂溶液重复此步骤2次。
除去胰蛋白酶抑制剂溶液，用5 ml sGM清洗海马3次。

磨碎
取出用于洗涤的sGM ，然后加入5 ml新鲜的sGM 。
用5毫升吸管，吸管海马向上和向下大约15-30倍，或直至大块消失和介质变得浑浊。
不要将移液器吸头的开口密封在管子的底部，以免起泡，否则会导致pH值的变化。让未分离的组织沉降（约1分钟）。
将细胞悬浮液转移到装有25毫升温水的50毫升试管中最佳/葡萄糖解决方案。
1毫升FRE添加SH SGM至沉淀，并通过上下移液用1个毫升吸管10-15次进一步解离。
让未解离的组织本身ttle（约1分钟），然后转移的用25毫升的细胞悬浮液到50ml管中的Optimem /葡萄糖溶液。
丢弃未分离的组织，因为它主要包含组织碎片。
在室温下，用转桶式离心机以1,000 × g在Optimem /葡萄糖中离心细胞悬液10分钟。
小心去除上清液，将细胞重悬在预热的sGM中。

电镀
在预热的sGM中以1百万个细胞/ ml的密度重悬沉淀的细胞。
一只新生小鼠或两只海马的产量为500万个细胞；因此，请使用5 ml的sGM /小鼠以100万个细胞/ ml的密度悬浮。
在带有盖玻片的35毫米培养皿中以1百万个细胞/毫升的密度培养平板：使用2毫升悬浮液/ 35毫米培养皿；更高的密度导致更高的存活率和更好的转染效率。
上的第二日在体外（DIV2）替换含血清与GM的Neurobasal-B27加上基于GM平台。

用CofActor系统在DIV5上转染原代解离的神经元培养物：
在生物安全柜中无菌条件下制备转染溶液A和B：
答：100 µl Optimem + 6 µg质粒DNA（2 µg肌动蛋白-GFP + 4 µg mCherry-Cofilin ）

B：100 µl Optimem + 12 µl Lipofectamine 2000

混合溶液A和B，并在生物安全柜中于室温下孵育所得的转染混合物（AB）15分钟。
用温转染培养基（TM）替换神经元培养物中的条件培养基（CM）；保存CM。
加入200 µl AB / 35 mm培养皿的转染混合物AB （如果使用其他尺寸的培养皿，则为10％的CM），并在组织培养箱中孵育2小时。
以1,000 × g的速度旋转CM 10分钟，并弃去沉淀；将CM放在培养箱中。
2小时后，将含AB的TM换成CM。
24-48小时后，使用组织培养显微镜检查转染效率；转染的神经元应同时表达两种构建体（绿色和红色通道中的信号）。

活细胞成像和刺激表达CofActor系统的神经元（图5）
1.转染的神经元将被的玻璃盖玻片FAC荷兰国际集团向下进入玻璃底培养皿用PBS和转移到Keyence显微镜。

2.定位转染的神经元，标记自己的位置（x -和y -轴）和刺激前拍摄图像。

用10 µl的10 mM叠氮化物和6 µl的6 mM DDG 处理神经元10分钟，而不会干扰Keyence显微镜中培养皿的位置。

3.在不干扰玻璃底培养皿位置的情况下，用蓝光刺激神经元30 s。

返回到预先标记的位置以对感兴趣的神经元成像，并在刺激后1-10分钟记录它们的反应。

注意：治疗和成像的时间由使用r确定。

图5 。CofActor在原代海马神经元培养物中的验证。与所述转染的初级海马神经元的代表性图像辅因子系统（40 ×放大率），前（A，B ）和之后（A“ B” ）暴露于ATP耗竭和照明序列的条件。

使用粒子计数（肌动蛋白-丝素蛋白棒形成的量化）进行图像分析（图6）
使用斐济随附的Bio - Formats软件包。
使用“分析粒子”功能对粒子进行计数。
将颗粒大小限制为20-200像素，将圆形度限制为0.2 0 -1.00。
在治疗之前，在神经元的图像周围的神经元躯体和神经元过程周围绘制自定义形状，并执行粒子计数。
保存的形状和位置他们对所拍摄的图像的体细胞和神经元过程的相同区域后处理和刺激和进行粒子计数。
报告颗粒计数为平均颗粒数/中子数。
使用GraphPad Prism 8对颗粒计数数据执行配对t检验。

图6.斐济测量肌动蛋白/ cofilin棒形成的步骤。将预光处理图像上传到F iji （A ）。使用多边形输出工具覆盖要测量的神经元区域（B ）。在“斐济”控制面板上选择“分析”>“分析粒子”。选择20-200像素单位的大小并将圆形度限制为0.20-1.00（C ），然后按OK进行分析。在原始光照前处理图像的多边形仍处于轮廓中的情况下，打开光照后处理神经元图像。选中后处理神经元后，按Shift> E ；这将转移在预光处理步骤中制作的多边形。在后期处理步骤（D ）中将其对准相同区域。然后使用与C相同的步骤重新分析后照明处理。

菜谱

储备溶液
葡萄糖储备液（2.5 M; 500 ml）
葡萄糖225.2克

H 2 O可达500 m l

混合直至完全溶解；然后过滤器的无菌IZE在4°C和存储

库存d关联介质（库存DM）
储备液F或250毫升

1 M Na 2 SO 4 20.45毫升

0.5 MK 2 SO 4 15毫升

1 M氯化镁2 1.45毫升

100毫米CaCl 2 0.63毫升

1 M HEPES 0.25毫升

2.5 M葡萄糖2毫升

0.5％酚红0 .5毫升

0.1 N NaOH 0.4-0.5毫升

TC H 2 O 209 .72毫升

滤波器小号teril IZE ，并在4℃下存储最多1个月

用铝箔盖住以避光

10 × Ky.Mg储备液（10 mM尿酸100 mM MgCl 2 ）（500 ml）
ħ 2 ö 340米升

犬尿酸757毫克

0.5％酚红2毫升

搅拌下滴入约3.5 ml的1 N NaOH

搅拌直至溶解（可能需要2-3个小时），然后添加：

1 M HEPES 2毫升

1 M氯化镁2 40毫升

H 2 O约400毫升

滤波器小号teril IZE在-20商店和℃下在15分毫升的等分试样

库存涂料解决方案
在TC水中准备1 mg / ml聚D-赖氨酸（PDL）储备液
制成10毫升PDL储备溶液的等分试样，并储存在-20°C下
在TC水中准备1 mg / ml层粘连蛋白储备溶液
分装层粘连蛋白原液，分装50或100 µl，并储存在-80°C
1½溶液（48毫升）
2.5 M葡萄糖28毫升

GlutaMAX 10毫升

笔/链球菌10毫升

分装到15 ml无菌离心管中的5 ml等分试样中，并储存在-20°C

Cysteine.HC升
在BME中以45 mg / ml的浓度稀释半胱氨酸.HCl （可选：过滤器灭菌）
分装成100 µl等分试样并储存在-20°C
用一份等分试样溶解10毫升酶溶液

工作解决方案
工作解离介质（DM / Ky.Mg ）（100 ml）
储备DM（离解培养基）90毫升

10 × Ky.Mg 10毫升

含血清（100 ml）的生长培养基（GM）用于电镀
BME 87.6毫升

BCS 10.0毫升

1½2.4毫升

产后神经元的Neurobasal A-B27生长培养基（20毫升）
Neurobasal A 19.2毫升

GlutaMAX 0.2毫升

钢笔/链球菌0.2毫升

B27加0.4毫升

最佳/葡萄糖
最佳500毫升

2.5 M葡萄糖4毫升

酶（木瓜蛋白酶）溶液
DM / Ky.Mg 9.7毫升

1 N NaOH 22-25 µl

木瓜乳胶100单位

半胱氨酸HCl储备溶液100 µl（等分1份）

向冰冷的DM / Ky.Mg中添加半胱氨酸.HCl ；然后用NaOH调节pH到7.4
加入木瓜蛋白酶乳胶并在37 °C下孵育5分钟
无菌过滤器，放在冰上直至需要
在培养神经元之前先热身
胰蛋白酶抑制剂溶液
DM / Ky.Mg 9.7毫升

胰蛋白酶抑制剂100毫克

1 N NaOH 22-25 µl

充分混合溶解
用NaOH调节pH值到7.4 ，然后用无菌过滤器过滤。
保持冰直到需要
在培养神经元之前先热身
转染培养基（TM）
˚F reshly制备GM不含抗生素

有效的PDL解决方案
50 µg / ml PDL，用TC水配制

大号aminin -PDL涂层溶液
在工作的PDL溶液中2 µg / ml层粘连蛋白

致谢

作者感谢东卡罗来纳大学的资金支持；致Denys Bashtovyy以及Szatmari和Hughes实验室的成员阅读手稿并提供建设性反馈；向希瑟·索伦森（Heather Sorenson）提供实验室管理支持；感谢詹妮弗·林恩·约翰逊（Jennifer Lynn Johnson）和ECU比较医学系的成员，以提供支持和同情的动物护理，并感谢Azeez Aileru （ECU牙科医学院）共享用于这项工作的仪器。该协议改编自Szatmari等。（2005 ）和Kaech and Banker （2006 ）并发表在Salem等。（2020年）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

伦理

所有小鼠均饲养在符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南的东卡罗来纳大学（ECU）的动物资源设施中。所有动物实验均获得ECU IACUC批准（AUP＃P105）。

参考

1. Anoop ，A.，Singh，PK，Jacob，RS和Maji ，SK（2010年）。用于阿尔茨海默氏病诊断的CSF生物标志物。Int J Alzheimers Dis 2010。

2.班堡，JR和伯恩斯坦，BW（2016）。阿尔茨海默氏病中的肌动蛋白动力学和cofilin-actin棒。细胞骨架（Hoboken）73（9）：477-497。

3. Blennow ，K.和Zetterberg，H.（2009）。脑脊髓液生物标志物，用于阿尔茨海默氏病。J Alzheimers Dis 18（2）：413-417。

4. Ganesh，HVS，Chow，AM和Kerman，K。（2016年）。用于神经退行性疾病检测的生物传感器的最新进展。TrAC-Trends Anal Chem 79：363-370。

5. Halliwell ，B.和Whiteman，M.（2004）。测量体内和细胞培养中的反应性物种和氧化损伤：您应该如何做，结果意味着什么？Br Pharmacol 142（2）：231-255。

6. Johansson，P.，Mattsson，N.，Hansson，O.，Wallin，A.，Johansson，JO，Andreasson，U.，Zetterberg，H.，Blennow，K.和Svensson，J.（2011）。阿尔茨海默氏病的脑脊液生物标志物：在同质单中心人群中的诊断性能。J Alzheimers Dis 24（3）：537-546。

7. Kaech ，S.和Banker，G.（2006）。培养海马神经元。纳特Protoc 1（5）：2406至2415年。

8. Kalyanaraman ，B.，Darley- Usmar ，V.，Davies，KJ，Dennery ，PA，Forman，HJ，Grisham，MB，Mann，GE，Moore，K.，Roberts，LJ，2nd和Ischiropoulos ，H。 2012）。用荧光探针测量活性氧和氮的种类：挑战和局限。Free Radic Biol Med 52（1）：1-6。

9.金泽，I。（2001）。神经元如何在神经退行性疾病中死亡？趋势Mol Med 7（8）：339-344。

10. Kim，JS，Huang，TY和Bokoch ，GM（2009）。活性氧调节弹弓纤维蛋白激活通路。分子生物学细胞20（11）：2650-2660。

11. Y.北村，R. Usami ，S. Ichihara，Kida，H.，Satoh，M.，Tomimoto ，H.，Murata，M.和Oikawa，S.（2017）。血浆蛋白谱分析在阿尔茨海默氏病的早期诊断中可能的生物标志物。Neurol Res 39（3）：231-238。

12. Laske ，C.，Sohrabi ，HR，Frost，SM，Lopez-de- Ipina ，K.，Garrard，P.，Buscema ，M.，Dauwels ，J.，Soekadar ，SR，Mueller，S.，Linnemann ， C.，Bridenbaugh ，SA，Kanagasingam ，Y.，Martins，RN和O'Bryant ，SE（2015）。用于早期发现阿尔茨海默氏病的创新诊断工具。阿尔茨海默氏德门11（5）：561-578。

13. Lee，VM，Goedert，M.和Trojanowski，JQ（2001）。神经退行性病变。神经病学年鉴（Annu Rev Neurosci）24：1121-159。

14. M·林克特，M·鲁登，阿伦·C，伯勒尔·J，摩尔·W，帕特森·A，洛朗厄尔·B，摩尔·J。，内维斯·C。，麦克唐纳·D ，Tarkowska ，A.，Sticco ，C.，Hill，E.，Rossner ，M.，Eliceiri ，K。和Swedlow ，J。，（2010）。元数据很重要：访问现实世界中的图像数据。Journal of Cell Biology ，189（5），第777-782页。

15. C.López-Otín，麻萨诸塞州布拉斯科，L。帕特里奇，M。Serrano和G. Kroemer（2013）。衰老的标志。单元格153（6）：1194-1217。

16. McKhann ，GM，Knopman ，DS，Chertkow ，H.，Hyman，BT，Jack，CR，Jr.，Kawas ，CH，Klunk ，WE，Koroshetz ，WJ，Manly，JJ，Mayeux ，R.，Mohs，RC ，莫里斯，JC，罗索，明尼苏达州，Scheltens ，P。，卡里略，MC，蒂斯，B。，温特劳布，S。和菲尔普斯，CH（2011）。由阿尔茨海默氏病引起的痴呆症的诊断：美国国家老龄化-阿尔茨海默氏症协会工作组对阿尔茨海默氏病诊断指南的建议。阿尔茨海默氏德门7（3）：263-269。

17. Mi ，J.，Shaw，AE，Pak，CW，Walsh，KP，Minamide ，LS，Bernstein，BW，Kuhn，TB和Bamburg ，JR（2013年）。遗传编码的报告基因，用于实时成像活神经元中的cofilin-actin棒。PLoS One 8（12）：e83609。

18.南出，LS，梅蒂，S.，博伊尔，JA，戴维斯，RC，科平杰，JA，宝，Y.，黄，TY，耶茨，J.，Bokoch ，GM和距班，JR（2010）。细胞质cofilin-actin棒的分离和表征。Ĵ生物学化学285（8）：5450-5460。

19. NIA，NIH，美国卫生与公共服务部。（2015）。2014-2015年阿尔茨海默氏病进展报告：促进治愈的研究。

20. E. Owusu-Ansah，A。Yavari和U. Banerjee（2008）。用于体内检测活性氧的方案。Protoc Exch doi ：10.1038 / nprot.2008.23。

21. Polidori ，MC，Griffiths，HR，Mariani ，E.和Mecocci ，P.（2007）。神经退行性疾病中蛋白质氧化损伤的标志：关注阿尔茨海默氏病。氨基酸32（4）：553-559。

22.塞勒姆，FB，邦纳，WP，普拉布，VV，科亚特，AB，奥布莱恩特，CT，穆拉索夫，AK，萨塔马里，EM和休斯，RM（2020年）。CofActor：一种光和应力门控的光遗传学聚类工具，用于研究活细胞中与疾病相关的细胞骨架动力学。Ĵ生物学化学295（32）：11231-11245。

23. Schindelin ，J.，阿尔甘-Carreras，I.，雄犬，E.，Kaynig ，V.，Longair ，M.，Pietzsch ，T.，Preibisch ，S.，Rueden酒店，C.，萨尔费尔德，S.，施密德，B.，Tinevez ，J.-Y.，White，DJ，Hartenstein，V.，Eliceiri ，K.，Tomancak ，P。和Cardona，A。（2012年）。斐济：一个用于生物图像分析的开源平台。自然方法，9（7），第676–82页。

24. Sweeney，P.，Park，H.，Baumann，M.，Dunlop，J.，Frydman ，J.，Kopito ，R.，McCampbell ，A.，Leblanc，G.，Venkateswaran ，A.，Nurmi ，A 。和Hodgson，R.（2017年）。神经退行性疾病中的蛋白质错误折叠：影响和策略。Transl Neurodegener 6：6。

25. Szatmari，E.，Habas，A.，Yang，P.，Zheng，JJ，Hagg，T.和Hetman，M.（2005）。刺激前脑神经元中的NR2B NMDA受体后，糖原合酶激酶3β和蛋白磷酸酶1之间的正反馈环。生物化学杂志280（45）：37526-37535。

26. Wang X，Fang，H.，Huang，Z.，Shang，W.，Hou ，T.，Cheng，A。和Cheng，H。（2013）。在细胞和动物中对ROS信号进行成像。Ĵ分子医学（贝尔）91（8）：917-927。

27.杨青。，柯Y.，罗健。和唐Y.（2017）。培养成熟的混合神经元培养物支持的低密度纯大鼠海马神经元的协议。J Neurosci Methods 277：38-45。