材料和试剂

1. 15 -毫升聚苯乙烯试管（体外技术，隼，目录号：FAL352095）

2.移液器，血清移液管，和枪头

3. 10 -毫升无菌无框玻璃试管（热-费希尔，Youlyy ，目录号：LBSDCT13100）

4.线环

5. 10 -毫升注射器用可拆卸的针（麦克法兰，泰尔茂，目录号：19046TE）

6. 0.2 - μ米过滤器，附接至注射器（帕尔，目录号：4612）

7.噬菌体进行测试，高滴度ř裂解物（≥ 10 6噬斑形成单位[PFU] /毫升）

注意：有关噬菌体分离和纯化的方案，请参见Bonilla等人，2016年。

8. 1 ×磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（Merck Australia，OmniPur ，目录号：US16506）

9. Bacto TM Tryptone （Gibco ，目录号：211705）

10. ģ ranulated Ý东提取物（Merck公司澳大利亚，Millipore公司，目录号：1037530500）

11. NaCl（澳大利亚默克公司，Supelco，目录号：1064040500）

12.琼脂粉（澳大利亚默克公司，密理博，目录号：05040）

13.在噬菌体细菌宿主的LB中过夜培养（请参阅有关LB培养基的食谱）

14. LB中顶琼脂（请参阅食谱）

15. LB中型琼脂平板（请参阅食谱）

注意：可以替换13-15中的生长培养基，以满足细菌宿主的生长需求。

设备

Microwav e（Panasonic，型号：32 L不锈钢，目录号：NN-ST67JSQPQ）
37 ℃下我ncubator
摇动平台（热科学，型号：CO 2 -耐振动筛，目录号：88881102）
本生灯
台式Ç entrifuge（EP pendorf南太平洋，型号：5810 R，目录号：5811000487）
高压灭菌器（Tuttnauer，型号：立式110L，货号：5050ELV-D）

程序

噬菌体和细菌宿主的共孵育（斑点测定）
注意：对E stimated时间来完成此部分是在45分钟钳工接着温育过夜。

在无菌玻璃试管中，将1 ml细菌培养物与3 ml熔融的顶部琼脂混合。
注意：顶部琼脂可以用微波炉液化。小心：太热了一顶琼脂的温度会杀死细菌群，从而在一个贫穷的草坪。顶部琼脂应为液体，但触感宜温暖（约50 °C ）。

倒混合TURE到室温LB琼脂平板上，并允许以固化。
准备在PBS中的两滴或三滴高滴度噬菌体裂解液的系列稀释液（〜1 ml ）。
注意：我们建议使用至少两种浓度的噬菌体，例如10 8和10 6 PFU / ml 。

点10 - μ大号每个噬菌体裂解滴稀释到所制备的板的表面上。
注意：可以将更多稀释液的斑点或相同稀释液的复制品添加到同一板中。

离开板，盖子部分上，靠近本生灯直到斑点是完全干燥; Ť他可能需要长达30分钟。可替代地，板Ç一个留在生物安全橱中干燥。
孵育在37 ℃下进行长达4天，每天检查以评估“台面”（图的形成URE 1A）（教皇等人，2013年）。
注意：台面是在裂解点中心汇合的细菌生长区域。在台地上生长的细菌可能已经（但不是唯一地）由于同种免疫而对噬菌体产生抗性。在检查台面时，还应考虑由于长时间孵育而导致琼脂脱水，这可能会阻碍细菌的生存能力。通过将板与湿纸巾在密封容器中孵育，可以进一步避免干燥，从而形成一个潮湿的腔室。

使用无菌线环，刮去一个铂环量BACT的erial生长从台面，并使用它作为在新鲜LB条纹平板琼脂初级接种物（见图形一bstract）。对每个台面重复上述步骤。
在37 °C下孵育过夜。评估明显分离的菌落的生长。
注意：这些殖民地中的任何一个都可能包含整合的预言。我们通常从至少两个台面中分别获取10个菌落，总共至少20个菌落。

隔板板筛
注意：对E stimated的时间来完成这一部分为30的分钳工和多个过夜温育。

将两个LB琼脂平板贴上标签并将其分成一个网格，该网格具有与要筛选的菌落一样多的部分。将两个板上的部分编号从1到20相同。
注意：一个平板可以舒适地容纳20个菌落。

按照步骤A1和A2，用细菌宿主的草坪准备其中一个板。无需另外准备即可使用另一块板。
使用无菌钢丝环，一次性吸管tip或无菌牙签，从条纹板中取一个随机菌落（在步骤A7中准备），轻轻地将其贴在LB板的第1部分上，然后贴在LB板的相应部分上LB板和细菌宿主草坪（步骤B2）。
注意：执行修补程序时，避免撕裂精致的琼脂。

重复S B重复B3，并根据需要添加尽可能多的菌落。
将平板在37 °C下孵育最多2天，并每天进行解释性检查。
要解释该测试，请仔细观察板与宿主草坪。阳性菌落（可能带有噬菌体的菌落）在其周围的草坪上会出现裂解迹象（噬菌斑，晕圈，浊度损失），这是由于噬菌体的自发释放引起的（图1B）。
注意：如果所有筛选的菌落均对斑片试验均呈阴性，则可以得出结论，噬菌体无法裂解宿主（见表1）。这里假阳性结果是可能的，因为结转从台面的噬菌体颗粒的直径：n要条纹板（步骤A7 ）。

对于每个阳性菌落，在没有寄主草坪的情况下返回LB平板（在步骤B3-B4中准备），用金属丝环拾取一部分补片，然后将其涂在新鲜的LB平板上。
在37 °C下孵育过夜。
挑选一个带有线环的菌落，然后重新铺在新鲜的LB平板上。
在37 °C下孵育过夜。
注意：您现在已经执行了两次单菌落纯化。使用来自该板的菌落（B9），重复步骤B（图1C）并执行测试C和D以确认溶原性行为。

液体培养试验中的自发噬菌体释放（上清液测定）
注意：对E stimated时间来完成此部分是在45分钟钳工接着温育过夜。

以下PURIF的ication与两个连续的条纹感兴趣的菌落板，接种菌落成10 -毫升Falcon管中含有约4毫升LB.
于37 °C曝气下孵育过夜。
注意：通气是通过在试管中留有足够的顶部空间，并在振荡平台上以150 rpm的速度进行孵育来实现的，这是本例中所用宿主的最佳生长所必需的。可以修改生长条件以适应不同的宿主。

将培养物以3500 × g离心10分钟。
使用10收集上清液-毫升注射器。
附加一个0.2 - μ微米的过滤器到注射器并小心压下柱塞到上清液过滤到新的管中。
注意：此步骤是可选的。如果未执行ed ，我们建议重复步骤C3和C4。

执行斑点测定（P rocedure A），与从该C5过滤的上清液更换噬菌体裂解物。
对于测试的解释，外观为当场测定裂解的迹象引起的自发释放的噬菌体从溶源到液体培养物（图1的上清液URE 1D）。

免疫测定
注：电子stimated的时间来完成这部分是15分的钳工，然后过夜培养。

执行点检（步骤A），将原始细菌宿主替换为在步骤B9中纯化的候选溶原菌。
为了进行测试解释，请检查是否没有由于同质免疫引起的裂解（在细菌性草坪上没有清除，斑块或浑浊的损失）（图1E）。
注：表示对原始噬菌体抗性的免疫测定法中，没有阳性发现的溶原上过程B和C，则提示的噬菌体的替代机制电阻。相反，确认溶源将在程序B，C试验阳性，和D.对于一个扩展说明关于的程序解释，参见图1和表1。

图1.筛选噬菌体øCO01 （Gordillo Altamirano等，2021）对宿主菌株鲍曼不动杆菌A9844 （Peleg等，2008）和噬菌体øFG- VRE（未发表）在宿主菌株肠球菌粪肠球菌ST796 （Buultjens等）的溶原行为等人，2017）。A.斑点法用10的液滴8和10 6 PFU / ml的后噬菌体裂解一个48 -小时的温育。黑星表示台面。B.使用带有和不带有细菌宿主的板的平板进行第一次斑块测定。黑色箭头（菌落9,13 ，和15上A.杆菌和集落11上E.屎肠球菌）示出了与周围的裂解，表明噬菌体的存在，可能从释放细菌生长溶素原。变焦编部分被提供作为阳性和阴性菌落例子。为A.杆菌，面板仅示出了总筛选菌落（18/36）的一半。C.第二补丁板，经过两轮单集落的纯化的菌落9,13 ，和15（A.杆菌）和集落11（E.屎肠球菌），无噬菌体存在的指示时贴在板小号含有细菌宿主草坪s 。D.用来自假定的溶原菌落的培养物的过滤的上清液进行斑点测定，没有自发噬菌体释放的迹象。菌落9和13（的E.免疫测定法A.杆菌）和集落11（E.屎肠球菌）表示灵敏度到其各自的噬菌体，从而排除homoimmunity ; 对于第15菌落（A. baumannii ），该试验证明对噬菌体具有抗性，最有可能是由于除同质免疫以外的其他机制所致（有关解释，请参见表1）。总之，试验证明噬菌体无力øCO01和OFG -VRE到lysogenize宿主菌株A.杆菌A9844和E.屎肠球菌ST796，分别。对于测定法E.屎肠球菌，LB用BHI（脑心脏浸液）培养基替换。比例尺= 0.5厘米。

数据分析

结果的最频繁的组合的总结我n各自的四个描述的过程和引导到它们的解释被包括在表1中。简单地说，噬菌体的溶原行为可以安全地排除当从至少两个至少20个宿主菌落不同台面是负我n中的斑贴试验（方法B）。此外，要确认宿主菌群具有该噬菌体，必须对其进行两次单菌落纯化，然后在步骤B，C和D中测试呈阳性。

表1.解释指南。最常见的结果组合及其解释。

*筛选出至少20个菌落，从2个不同的台面中各筛选10个菌落。+：阳性测试。-：阴性测试。

菜谱

LB培养基
10克Bacto TM胰蛋白p

10克颗粒状酵母提取物

5克氯化钠

500毫升去离子水

注意：高压灭菌，冷却并在室温下保存。

LB琼脂板
7.5克琼脂粉

500 ml无菌LB培养基

注意：高压灭菌器，冷却，倒入每个培养皿约20 ml ，使其固化，并在4 °C下储存。

LB顶级琼脂
1.5克琼脂粉

200 ml无菌LB培养基

注意：高压灭菌，冷却并在室温下保存。W¯¯需要母鸡，在〜3分钟的微波热身。

致谢

费尔南多·戈迪略·阿尔塔米拉诺（Fernando L. Gordillo Altamirano）感谢莫纳什大学通过莫纳什研究生研究奖学金为他的博士研究提供的支持。这项工作包括杰里米·巴尔（Jeremy J. Barr）的努力，由澳大利亚研究委员会（ARC），发现早期职业研究者奖（DECRA）（DE170100525），国家卫生与医学研究委员会（NHMRC：1156588）和永久基金会资助。澳大利亚受托人奖（2018HIG00007）。

我们感谢安东教授Y.法勒和教授蒂姆·P. Stinear提供在次使用的细菌菌株E存在研究。该协议源自Broussard等人（2013年）和Pope等人（2013年）的先前工作。，2013和被预先在概括形式所描述戈迪略阿尔塔米拉诺等人。，202 1 。

利益争夺

作者宣称没有任何利益冲突。

参考

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