材料和试剂

1. 50 ml Falcon锥形管（Fisher Scientific，目录号：1443222）

2. 15 ml Falcon锥形管（Fisher Scientific，目录号：1495949B）

3. 1.5 ml DNA LoBind试管（Eppendorf，目录号：022431021）

4. 1毫升移液管头

5. 100-200 μl移液管头

6. 100 mm培养皿

7. 0.2μm过滤器

8. 显微镜载玻片（Fisher Scientific，目录号：4951F-001）

9. 22毫米× 50 mm盖玻璃（Fisher Scientific，目录号：12-545E）

10. Parafilm（赛默飞世尔科技公司，目录号：S37440）

11. 铝箔（赛默飞世尔科技，目录号：14-648-236）

12. 哺乳动物细胞的培养。在该方案中，我们使用卵巢癌细胞系OVCAR8和前列腺癌细胞系C4-2B，在RPMI培养基（康宁，目录号：10-040-CV）中培养，并添加10%胎牛血清（赛默飞世尔科技，目录号：26140079）和1%青霉素链霉素（赛默飞世尔科技，目录号：15-140-122）

13. SybrGold染料（Invitrogen，目录号：S11494）

14. 0.5%胰蛋白酶EDTA（赛默飞世尔科技，目录号：15400054）

15. 超纯DNase/RNase游离蒸馏水（赛默飞世尔科技，目录号：10977015）

16. 1 M Tris-HCl，pH 7.5（赛默飞世尔科技公司，目录号：15567027，储存于4°C、保质期：6个月）

17. 5 M NaCl溶液（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9760G，室温储存）

18. 1 M MgCl2溶液（赛默飞世尔科技公司，目录号：AM9530G，室温储存）

19. Dulbecco磷酸盐缓冲盐水或DPBS，不含钙，不含镁（Thermo Fisher/Gibco，目录号：14190144，储存于4°C、保质期：36个月）

20. 10%Nonidet P40替代品（密理博/Sigma-Aldrich，目录号：11332473001，储存于4°C、避光，保质期：24个月）

21. 10%（w/v）吐温-20（密理博/Sigma-Aldrich，目录号：11332465001，储存于4°C在惰性气体下保存，避光，保质期：24个月）

22. 20 mg/ml二甲基亚砜中的洋地黄素（Promega，目录号：G9411，储存于-20°（三）

23. DNA清洁浓缩试剂盒（ZYMO，目录号：D4033）

24. Nextera DNA样品制备试剂盒（Illumina，目录号：FC-121-1030，储存于-20°C）注：此试剂盒已停产，可单独购买：标记DNA

酶/TDE（Illumina，目录号：15027865）和标记DNA缓冲液/TDB（Illumina，目录号：15027866）。

25. Nextera索引工具包，24个索引（Illumina，目录号：15055289，储存于-20°（三）

26. NEBNext高保真2× PCR主混合物（新英格兰生物实验室，目录号：M0541，储存于-20°（三）

27. 磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4（赛默飞世尔科技，目录号：10010023）

28. Qiagen HiSpeed质粒Midi试剂盒（Qiagen，目录号：12643）

29. 异丙醇（费希尔化学公司，目录号：A516-500）

30. 乙醇（赛默飞世尔科技公司，目录号：A4094）

31. 糖原（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9510）

32. 质粒安全ATP依赖性DNA酶（Lucigen，目录号：E3101K）

33. QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen，目录号：28104）

34. KOD热启动DNA聚合酶（Millipore/Sigma-Aldrich，目录号：71086）

35. 胸苷（Millipore/Sigma-Aldrich，目录号：T1895）

36. PBS中的10 mg/ml KaryoMax Colcemid溶液（赛默飞世尔科技，目录号：15212012）

37. 氯化钾（Millipore/Sigma-Aldrich，目录号：P9541）

38. 甲酰胺（Millipore/Sigma-Aldrich，目录号：47670）

39. 氯化钠（赛默飞世尔科技，目录号：BP358）

40. 柠檬酸钠（密理博/Sigma-Aldrich，目录号：W302600）

41. 带有5-荧光素的BAC FISH探针标签（帝国基因组学，目录号：RP11-732I3和RP11-765O11）

42. 橡胶水泥（埃尔默橡胶水泥，目录号：EPIE904）

43. Nonidet P-40（西格玛，目录号：I8896）

44. 硫酸葡聚糖（赛默飞世尔科学公司，目录号：BP1585）

45. 带DAPI的VectaShield安装介质（Vector Laboratories，目录号：H-1200-10）

46. 指甲油（OPI指甲油）

47. 尼康共聚焦显微镜浸油（赛默飞世尔科学公司，目录号：12-624-66A）

48. 1%（10 mg/ml）洋地黄素（见配方，储存于-20°C作为aliquotes，稳定6个月）

49. ATAC再悬浮缓冲液（见配方）

50. ATAC裂解缓冲液（见配方）

51. ATAC洗涤缓冲液（见配方）

52. ATAC反应母料（见配方）

53. 100 mM胸苷溶液（见配方）

54. 75 mM KCl低渗溶液（见配方）

55. 卡诺氏固定液（见配方）

56. 20× 生理盐水柠檬酸钠（SSC）缓冲液（见配方）

57. 杂交缓冲液（见配方）

58. 鱼变性缓冲液（见配方）

59. 鱼洗缓冲液1（见配方）

60. 鱼洗缓冲液2（见配方）

设备

1. 细胞培养箱

2. 组织培养罩

3. 台式微量离心机（Eppendorf，型号：5424）

4. 热混合器（Thermo Scientific，目录号：13687711）

5. 带加热盖的PCR机（Eppendorf，型号：Mastercycler Pro）

6. 台式离心机（Eppendorf，型号：5804）

7. 水浴（Thermo Fisher Scientific，Isotemp）

8. Coplin jar（当地公司）

9. 杂交室（Thermo Fisher Scientific，Isotemp）

10. 化学通风柜（贝尔科玻璃公司）

11. 布莱特菲尔德显微镜（奥林巴斯）

12. 共焦显微镜（尼康，型号：Ti-E eclipse系列）

13. 数据存储容量高达TB的计算机

软件

1. 圆查找器（github，https://github.com/pk7zuva/Circle_finder/blob/master/circle_finder-pipeline-bwa-mem-samblas 三、上海）；运行Circle\u finder的先决条件安装：bedtools

(https://github.com/arq5x/bedtools2)，samtools公司(http://samtools.sourceforge.net)，平行

(https://www.gnu.org/software/parallel/)，bwa公司(https://github.com/lh3/bwa)，samblaster公司(https://github.com/GregoryFaust/samblaster)

2. 剪切适应(https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)

3. AR Elements软件（尼康，日本）

4. ImageJ（美国国立卫生研究院）

程序

答。培养哺乳动物细胞的ATAC序列

1. 从培养的哺乳动物细胞中分离细胞核

答。将培养中的50000个哺乳动物细胞放入1.5 ml DNA LoBind管中。

注：实验前用台盼蓝染色检查细胞活力，细胞活力至少为95%。请参考原始的ATAC-seq方案（Corces，2017），用DNase处理细胞以去除细胞外DNA，或者如果存活率低于95%，则通过ficoll梯度分离细胞。

b。在500℃下，在冰凉的DPBS中清洗电池两次× g。

c。加50μl将ATAC-LB冷冻至每根管，用100-200移液管上下移液3次μl移液管尖端。在冰上孵育3分钟。

注：我们对几个细胞系使用了3分钟的裂解时间，包括HCT116、OVCAR8和C4-2B。对于特定的难溶细胞系，可能需要延长裂解时间。台盼蓝染色可在显微镜下检查细胞裂解效率（蓝色染色表明裂解成功）。

d。立即稀释50μl在试管中加入1毫升冰镇ATAC-WB进行裂解。将试管倒置3次混合。以500转× g，4分钟时持续10分钟°C。

e。先用1毫升移液管头，然后用100-200毫升移液管小心地除去上清液（含有细胞质部分*）-μl移液管尖端。现在小球中含有原子核，应立即用于标记反应。

*注：细胞质部分可以保存，以便以后提取RNA。

2. 换位/标记反应和清除

答。在50分钟内重新悬浮核弹μ上下移液6次。在温度为37℃的热混合器中培养°C在1000转/分的恒定搅拌下搅拌30分钟。

b。加250μl DNA结合缓冲液（来自Zymo DNA清洁和浓缩试剂盒）各50μl ATAC反应，上下移液3次搅拌均匀。转移300μ在收集管（来自Zymo DNA Clean和浓缩器试剂盒）上的每一个柱中加入混合物，转速为15000× g持续30 s，并丢弃收集管中的液体。

c。带200的洗涤柱μl DNA洗涤缓冲液（来自Zymo DNA清洁和浓缩试剂盒），转速降到15000× g持续30秒。

注意：确保按照制造商的指南将乙醇添加到清洗缓冲液中。

d。重复200次清洗μDNA清洗缓冲液。转速降到15000× g（或最大速度）2分钟，以确保有效拆除所有缓冲器。

e。丢弃先前的收集管。小心地将色谱柱移入1.5毫升的新试管中。加21μl ddH2O到柱中心，在15000转下× g（或最大速度）30 s，以收集洗脱的DNA。标记的DNA可以储存在-20°C（在低DNA结合管中）此时如果不立即进行下一步。

三。DNA文库PCR扩增与纯化

答。在冰上的0.2毫升PCR试管中设置PCR反应：

20μ我洗提了DNA

2.5μ我25岁μM Nextera i5引物（来自Nextera索引工具包）

2.5μ我25岁μM Nextera i7引物（来自Nextera索引工具包）

25μl 2X NEB下一主混音

注：如果将多个样本合并用于测序，则需要对每个样本使用不同的i5和i7索引引物组合。关于指数组合的选择建议，请参考具体的NGS测序平台。有关使用Nextera索引进行Illumina测序的信息，请参阅Illumina索引适配器池指南。

b。用以下PCR循环程序进行10个循环的PCR扩增（lid设置为105°C）地址：

第一步。72°C、 5分钟

第二步。98°C、 30秒

第三步。98°C、 10秒

第四步。63°C、 30秒

第五步。72°C、 1分钟

（重复步骤3-5，共5-10个循环）

第六步。4°C暂停

注：每个特定细胞系的最佳PCR周期数需要优化，以确保有足够的最终产物，同时避免过度扩增。循环数可以通过使用标记DNA的一小部分测试一系列不同的循环数（最低5个循环，以确保序列适配器连接到DNA片段）来优化。扩增可通过qPCR监测或在琼脂糖凝胶上运行（图2）。

图2。用qPCR方法优化ATAC-seq-PCR循环数的实例。这里显示的是一个使用qPCR来确定C4-2细胞中ATAC-seq文库制备的最佳PCR周期数的示例。与实际的ATAC-seq反应平行地建立具有相同起始材料数量的单独ATAC反应，并且完成步骤A2。qPCR反应的建立与步骤A3a相似，添加1:400稀释的SybrGold染料（Invitrogen S11494），并在qPCR兼容板中建立。qPCR程序的设置与步骤A3b相同，具有总共20个周期的实时荧光读数。完成qPCR后，根据循环数绘制Rn（标准化报告器）值，并根据该图确定饱和点（由蓝色虚线表示）。从Rn循环图中，当循环数达到饱和信号的1/3（由红色虚线表示）时，选择循环数。在该具体实施例中，选择PCR循环数6。如果不打算进行单独的ATAC反应，则步骤A2之后的反应的一小部分（例如，1/16）可以用作qPCR反应的输入；剩余反应可用于最终PCR扩增。

c。清理50μl使用ZYMO DNA清洁浓缩试剂盒进行PCR反应（同上）。在15分钟内洗脱μl水。使用生物分析仪HS DNA芯片确认扩增文库的大小分布（图3）。

d。提交ATAC序列库以进行配对末端测序。

4用圆搜索算法识别潜在的eccDNA基因组坐标

答。使用具有以下参数的cutadapt程序（Martin，2011）删除适配器序列：cutadapt-a ADAPT1-a ADAPT2-o out1.fastq-p out2.fastq in1.fastq in2.fastq。

注：ADAPT1=CTGTCTTATACACATCTCCGAGCCAGAAC，ADAPT2=

CTGTCTTATACACTGACGCTGCCGACGA公司。in1.fastq和in2.fastq是在移除适配器之前输入的fastq文件。取出适配器后，out1.fastq和out2.fastq是成对的端部fastq文件。

b。Circle_finder管道首先使用bwa aligner（bwa mem）将成对末端读取（读取长度应大于75碱基长）映射到基因组（在本例中为hg38基因组构建）（Li，2013）。当将成对末端读取映射到基因组时，Circle\ U finder收集那些成对末端读取，其中一个读取以连续方式映射，而伙伴读取以非连续（拆分读取）方式映射，假设一端映射到环状DNA的主体上，另一端映射到环状DNA连接连接处。返回到唯一映射到基因组中三个位点（一个连续映射的读取和两个位置，用于以拆分读取方式映射的读取）的成对末端id的列表，管道识别成对末端id，其中连续映射的读取位于两个拆分读取之间和相反链上（图1A）。第一次拆分读取的开始和第二次读取的结束被注释为eccDNA的开始和结束。我们的GitHub页面提供了一个管道（一个脚本-见下一步），用于从任何长度的特定位点（非嵌合体eccDNA）读取长度大于75碱基的成对末端测序数据中识别eccDNA（请参阅软件部分）。

c。生成基因组索引文件：对于特定的基因组，只需生成一次。例如，为人类基因组hg38生成索引文件的命令：bwa index hg38.fa。

注：hg38.fa是感兴趣的基因组的fasta文件（本例中为hg38）。这将以与文件名相同的名称生成索引。

d。按以下逻辑使用bash脚本：#用法：bash脚本#name“Number of processors”“/path of whole genome file/hg38.fa”“paired end fastq file 1”“paired end fastq

文件2“minNonOverlap between two split reads”“Sample name”“genome build”。此处显示了一个示例脚本（代码为单行）：

#bash/path of script/directory/microDNA-pipeline-bwa-mem-samblaster.sh 16/path of script directory/hg38.fa S1\u R1.fastq S1\u R2.fastq 10 S1 hg38注1：管道包含以下七个参数。

参数1=“处理器数量”；

参数2=“文件”例如“hg38.fa”；

参数3=“成对结束fastq文件1”；

参数4=“成对结束fastq文件2”；

参数5=“两次拆分读取之间的MinNoOverlap”，例如10；

参数6=“样本名称”，用户可以为其样本选择任何名称；

参数7=“基因组构建”，用户可以选择自己的基因组构建，如hg38。

注2：识别eccDNA的机会取决于足够的测序深度和读取长度，以覆盖eccDNA特异性连接序列。在Illumina HiSeq平台上，我们使用了大约1亿个读取对，读取长度为150 bp。
e。“circle\u finder”的输出文件将是一个名为“microDNA JT.txt”的文件，其中包含染色体编号、eccDNA坐标的起始位置、eccDNA坐标的结束位置和连接标签的数量四列。

图3。代表性的ATAC序列库大小分布。对卵母细胞8核进行ATAC-seq。由于核小体在染色质上的排列，生物分析仪检测到一种典型的梯形分布。

B。反向PCR法验证选择性eccDNA

注意：EccDNA应小心处理。EccDNA在低浓度下冷冻、涡流或长期保存时容易发生剪切和降解。

1. 培养和收获细胞

答。用胰蛋白酶法将107-108个人癌细胞收集到15ml试管中。

b。300℃离心× g、 4个°C持续5分钟，通过抽吸除去介质。

c。用10ml冰磷酸盐缓冲盐水（PBS）复苏细胞。

d。300℃离心× 5分钟。

e。小心抽吸去除PBS。

f。重复洗涤步骤共两次，立即进行下一步。

2. 质粒柱分离EccDNA

答。从Qiagen HiSpeed质粒Midi试剂盒将细胞重新悬浮在6 ml缓冲液P1中。

注：实验前向缓冲液P1中加入核糖核酸酶A溶液，保存于4°C。

b。从Qiagen HiSpeed质粒Midi试剂盒中加入6 ml缓冲液P2，轻轻反转4-6次混合。

c。在工作台上室温孵育5分钟。

d。从Qiagen HiSpeed质粒Midi试剂盒中加入6毫升预冷缓冲液P3，轻轻反转4-6次混合。

e。从Qiagen HiSpeed Plasmid Midi工具包中设置Qiagen过滤器滤筒，方法是取下出口喷嘴盖，将滤筒放在废物容器（如50 ml锥形烧瓶）顶部。将细胞裂解液（总共18毫升）加入带盖的滤筒中。在室温下培养10分钟。

f。等待时，将HiSpeed Midi探针从Qiagen质粒Midi试剂盒中置于废物容器（如50 ml锥形瓶）顶部，并用4 ml缓冲液QBT平衡。

g。从滤筒上取下盖子，轻轻地将柱塞插入滤筒中，将细胞裂解物过滤到HiSpeed尖端。

h。待细胞裂解液通过HiSpeed尖端后，加入10mL缓冲液QC。

一。缓冲液QC通过HiSpeed尖端后，将其移到干净的50 ml锥形管中。

j。加入5毫升缓冲液QF从HiSpeed尖端洗脱DNA。

k。加入3.5毫升异丙醇，倒置轻轻搅拌，室温下孵育5分钟。

l。从注射器中取出柱塞后，将Qiagen HiSpeed质粒Midi试剂盒中的沉淀器模块连接到20 ml注射器上。

m。将步骤B2k中的DNA异丙醇溶液添加到注射器中，并轻轻地将溶液通过沉淀器模块推入废物容器中。

n。从QIA沉淀器模块上取下20毫升注射器，拔出柱塞，将20毫升注射器重新连接到QIA沉淀器模块上，向注射器中加入20毫升70%乙醇，轻轻推动柱塞以清洗QIA沉淀器模块。

o。通过多次将空气推入除尘器模块，干燥除尘器模块，直到不再有液体排出。用吸水纸（如kimwipes）擦干除尘器模块出口。

第。从20毫升注射器上取下模块。将一个新的5毫升注射器（不带柱塞）连接到除尘器模块上。

问。从Qiagen HiSpeed质粒Midi试剂盒中加入1 ml缓冲液TE至注射器中，并用柱塞将Qiagen沉淀器模块推入1.5 ml Eppendorf管中。

r。进行乙醇沉淀：将1000μ把DNA溶液稀释到500μl在两个1.5毫升的Eppendorf试管之间。加1000μl 100%乙醇和1μg糖原到每根管子。用移液管轻轻上下混合。在台式离心机中以13000 rpm离心30分钟。

s。尽可能多地用1000去除上清液μl和100μl移液管尖端不移动DNA颗粒。颗粒应该在管的底部可见。风干5分钟。

t。在20分钟内将每个试管中的DNA重新悬浮μl从Qiagen HiSpeed质粒Midi试剂盒中缓冲TE，并合并到一个试管（40μl体积）。

3. DNA酶切去除线状DNA进一步富集eccdna

答。到40μDNA，加128μl ddH2O，8μl 25毫米ATP，20毫米μ长10× 反应缓冲液（来自质粒安全的ATP依赖性DNA酶试剂盒）和4μ质粒安全ATP依赖性DNA酶。

37℃孵育°C过夜（10-12小时）。

b。使用快速PCR纯化试剂盒，通过添加5体积的缓冲液PB纯化DNA

(1,000 μl）稀释至1体积的消化DNA溶液（200μl）轻轻地倒转。将混合物加入快速旋转柱中，在17900下离心1分钟× g。

c。丢弃流通管，用750清洗快速旋转柱μl在17900下离心1分钟，缓冲PE（含乙醇）× g。重复清洗步骤，共清洗两次。

d。用50%洗脱DNAμ从快速PCR纯化试剂盒中提取EB缓冲液。

e。重复消化和纯化步骤，直到DNA浓度不再降低。

浓度开始高（>500ng/μl）应降低至低水平（<20 ng/μl）是的。注：本方案共进行2轮消化纯化。为了优化每个特定细胞系所需的消化/纯化轮数，应在每轮消化/纯化前后用量子位测量DNA浓度。经过一定数量的消化/纯化循环后，浓度将停止下降，表明污染线性DNA已被成功去除。

4. 反向PCR检测特异性eccDNA的研究

答。使用KOD热启动PCR试剂盒对靶向eccDNA连接序列的引物进行PCR。

b。加25μ超级缓冲器，10μdNTPs（2个μM（每个），1.5μl每个底漆（10 pmol/μl），1个μl KOD Xtreme热启动聚合酶，200 ng纯化DNA，足够的ddH2O使最终溶液为50μl。

c。使用带加热盖的PCR机进行PCR扩增（盖设置为105°C）地址：

第一步。94°C、 2分钟

第二步。98°C、 10秒

第三步。68°C、 1分钟/kb

（重复步骤2-3，共30个循环）

d。然后可以在琼脂糖凝胶上观察PCR产物，并用用于PCR扩增的引物进行Sanger测序（图4）。

图4。从ATAC-seq文库中鉴定具有代表性的eccDNA，并通过反向PCR在OVCAR8细胞中进行验证。答。eccdna用反向PCR引物扩增（蓝色框中显示），凝胶纯化，并通过Sanger测序验证连接序列的存在。Sanger测序结果示例可在原始手稿的图3D中找到（Kumar等人，2020）。B。该表用坐标表示了eccDNA在不同染色体上的分布及其预期PCR产物大小；数字代表凝胶上的不同通道。C。作为阴性对照，用同样的反向PCR引物从U2OS细胞中纯化eccdna（lane1-8）。作为阳性对照，在eccdna上使用针对线粒体DNA的反向PCR引物（车道9-10）。

C。特异性环状dna的中期扩散和FISH检测

1准备细胞进行中期扩散

答。种子5× 胸腺嘧啶核苷阻断前24小时，在5个100 mm培养皿中各放置105个细胞。

注：起始细胞数对获得足够的有丝分裂细胞进行eccDNA检测很重要。

b。向每个100 mM平板中添加100 mM胸腺嘧啶核苷溶液至最终浓度2 mM，持续16 h。用不含胸腺嘧啶核苷溶液的常规培养基代替，释放细胞9小时。重复另一次胸腺嘧啶核苷阻滞（终浓度2 mM，16 h），使细胞停留在G1-S边界，并在常规培养基中释放细胞3 h。

c。添加0.1μg/ml终浓度秋水仙碱9小时收集有丝分裂细胞。

注：显微镜下检查细胞，确认为圆形有丝分裂细胞。

d。轻轻摇掉培养皿中漂浮的有丝分裂细胞，在300℃下离心，收集到15ml的Falcon管中× g保持5分钟，并用冷PBS洗涤颗粒两次。注意：有丝分裂细胞是脆弱的，所以在离心过程中使用低速是非常重要的。

e。在5 ml 75 mM KCl低渗溶液中轻轻地重新悬浮颗粒，并在37℃下培养°C在水浴中放置30分钟。每10分钟轻轻翻转一次试管，以确保细胞处于悬浮状态。用1000毫升的试剂滴加1毫升卡诺固定液到细胞悬液中μl移液管尖端，缓慢翻转试管混合，以保持中期染色体完整。

f。在300℃下离心分离细胞× g保持5分钟，并小心地吸取大部分KCl溶液，留下约300μl。轻轻敲击试管，使细胞颗粒重新悬浮。

g。用1000毫升的试剂滴加5毫升冰镇卡诺固定液，固定再悬浮的细胞μl移液管尖端并缓慢翻转试管以混合细胞。

注意：缓慢翻转试管以避免有丝分裂染色体断裂是很重要的。

注：在这个阶段，固定单元可以存储在4°好几个月了。

h。在300℃下离心分离细胞× g静置5分钟，然后在1-2 ml卡诺氏固定液中轻轻地重新悬浮颗粒。

一。把载玻片加湿，放在55的盒子里°C倾斜45度，从载玻片上方15-20厘米处滴入几滴固定细胞悬液。

注：湿化玻片对核膜的适当破坏非常重要，从上述高度滴下固定细胞悬液对有丝分裂染色体的适当扩散也非常重要。

j。室温避光干燥玻片，用含DAPI的VectaShield贴装培养基染色，显微镜下观察有丝分裂染色体的扩散。含有有丝分裂扩散的干载玻片可在4℃保存°好几个月了。

2. 含中期DNA载玻片的变性

答。在73℃下预热100毫升鱼变性缓冲液°C持续5分钟。

b。将含有中间相的玻片浸入含有预热鱼变性缓冲液的Coplin罐中5分钟。

c。将载玻片浸入一个装有1× PBS，pH7.4，5分钟。

d。将载玻片分别浸入70%、85%和100%乙醇中2分钟，连续脱水。

e。将载玻片风干，直到乙醇全部蒸发。

3. 探针变性和杂交

注意：保持FISH探头不受光线照射很重要。铝箔用于覆盖载玻片或杂交室。

答。在杂交缓冲液（19）中变性FISH探针μl缓冲液+1μl标记探针）73°冷却5分钟，然后立即在冰上冷却。

b。将探针混合物涂抹在预先制备的风干中期铺展玻片上，并用盖玻片盖住。用橡胶胶密封盖玻片，将玻片放入加湿盒中，并在37℃下混合°在杂交室过夜。加湿箱的密封采用Parafilm。

c。杂交后，将载玻片浸入1× PBS，并轻轻取出橡胶粘合剂和盖玻片。

d。将载玻片放入Coplin罐中，在73℃下用预热的鱼类清洗缓冲液1清洗°C持续5分钟。

e。在室温下用鱼肉洗涤缓冲液2洗涤载玻片5分钟。

f。载玻片在室温下于黑暗中风干，用VectorShield DAPI介质安装，并用指甲油密封。

4. 图像和数据分析

在共焦显微镜下用63× 油浸物镜。将激光功率设置为输出40%，并获取具有完整感兴趣区域（512）的图像× 512）暴露时间为300 ms。为了检测eccDNA，我们检测了OVCAR8（实验细胞系）和C4-2（阴性对照细胞系，我们没有看到任何染色体外信号）的eccDNA位点Chr2:238136071-238170279或

Chr10:103457331-103528085（图5）。潜在的eccDNA信号（红色箭头所示）位于主染色体之外，而染色体信号与主染色体重叠，通常表现为双峰信号（黄色箭头所示）。

图5。中期FISH法检测卵巢癌细胞eccDNA的研究。染色体进行中期扩散，FISH鉴定eccdna。代表性eccDNA位点Chr2:238136071-238170279（顶行–探针1）或

Chr10:103457331-103528085（底行-探针2）从OVCAR8 ATAC序列中鉴定，并用于特定的BAC探针设计。左侧C4-2B细胞的中期扩散未显示染色体外环状DNA（阴性对照），而右侧OVCAR8细胞的扩散证实存在染色体外eccDNA信号（绿色：BAC探针，蓝色：DAPI）。红色箭头表示eccDNA信号（由于eccDNA的复制，可以是单重态或双重态）。黄色箭头标记染色体DNA信号（通常是双峰，但也可以是单峰，因为信号只能从单个染色单体看到）。

数据分析

1. OVCAR8和C4-2B ATAC-seq数据已保存在基因表达综合数据库中（登录号：GSE145409）。根据圆查找算法，可以在同一地理位置下的补充文件中找到已识别的eccDNA坐标输出。从这个数据集中发现了数百个潜在的eccdna，包括小于1kb的小圆圈和包含多个基因的400kb的大圆圈[参考原始手稿中的图3（Kumar等人，2020）]。

2. 为了验证潜在的eccdna，对来自OVCAR8的11个eccdna和来自C4-2B的6个eccdna进行了基于PCR的验证。引物是根据ATAC-seq的连接序列设计的，可以特异性地扩增eccDNA而不是基因组DNA（除非串联重复）。总的来说，17个eccdna中有13个通过这种方法进行了验证[参考原始手稿中的图3（Kumar等人，2020）]。

3. 中期扩散上的FISH可用于直观地验证选择性eccdna的存在，但优先使用大圆圈。在这里，我们能够在OVCAR8细胞中检测到与34 kb和71 kb ECCDNA相对应的染色体上的FISH信号（图5）。为了了解eccDNA信号在细胞群中的一般分布，我们对20多个细胞中的eccDNA-FISH信号进行了计数，发现每个受检细胞中有0到4个eccDNA-FISH信号的分布[参考原始手稿中的图4（Kumar等人，2020）]。

食谱

1. 1%（10mg/ml）洋地黄素

40μl 20 mg/ml二甲基亚砜中的洋地黄素储备液

40μl ddH2O

存储在-20°C等分，稳定6个月

2. ATAC再悬浮缓冲液（ATAC-RSB）（50毫升）

500μl 1 M Tris-HCl，pH 7.4（10 mM最终浓度）

100μl 5 M NaCl（10 mM最终浓度）

150μl 1 M MgCl2（3 mM最终浓度）

49.25毫升ddH2O

3. ATAC裂解缓冲液（ATAC-LB）（500μl代表8个反应）

5μl 10%Nonidet P40替代品（0.1%最终浓度）

5μl 10%吐温-20（0.1%最终浓度）

5μl 1%洋地黄素（0.01%终浓度）

485μl ATAC-RSB公司

准备新鲜的，放在冰上

4. ATAC洗涤缓冲液（ATAC-WB）（10毫升用于8个反应）

100μl 10%吐温-20（0.1%最终浓度）

9.9毫升ATAC-RSB

准备新鲜的，放在冰上

5. ATAC反应母料（ATAC-RM）（450μl代表8个反应）

225μl 2级× TDB缓冲液（来自Nextera kit，25μl每反应）

22.5μl TDE转座酶（来自Nextera试剂盒，2.5μl每反应）

148.5μl DPBS公司

4.5μl 1%洋地黄素（0.01%终浓度）

4.5μl 10%吐温-20（0.1%最终浓度）

45μl水

准备新鲜的，放在冰上

6. 100 mM胸苷溶液

将242 mg胸腺嘧啶核苷粉末溶解于10 ml细胞培养级水中，并通过0.2%的滤池过滤-μm过滤器

7. 75mmkcl低渗溶液

将559 mg KCl溶解于100 ml细胞培养级水中，并通过0.2%的滤池过滤-μm过滤器

8. 卡诺固定液

在25 ml冰醋酸（v/v）中加入75 ml甲醇，在化学通风柜下制备100 ml固定液

9. 20× SSC缓冲器

在400 ml水中混合87.5 g NaCl和44.1 g柠檬酸钠，并用几滴12 N盐酸将pH调节至7.0

用水将体积调节至500 ml，并通过0.2%的过滤器过滤-μm过滤器

10. 杂交缓冲液

10毫升20× SSC缓冲液pH 7.0

50毫升100%甲酰胺溶液

10 g硫酸葡聚糖

用水将体积调节到100毫升

在化学通风柜下准备

11. 鱼变性缓冲液

70毫升100%甲酰胺溶液

10毫升20× SSC缓冲器

20毫升无菌水

在化学通风柜下准备

12. 洗鱼缓冲液1

2 20毫升× SSC缓冲器

3 10%NP-40毫升

95毫升水

13. 鱼洗缓冲液2

10毫升20× SSC缓冲器

1毫升10%NP-40

89毫升水

致谢

这项工作得到了R01 CA060499和P30 CA044579对AD和T32 CA009109（PI:Amy Bouton）对TP癌症培训补助金的支持。我们感谢杜塔实验室的所有成员进行了许多有益的讨论。

相互竞争的利益相互竞争的利益

作者声明没有相互竞争的利益。

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