材料和试剂

注：建立一个无核糖核酸酶的环境非常重要。因此，只能使用高压灭菌器吸管头，用70%乙醇或核糖核酸酶清洗工作台和工具，并戴上防护手套。

1. RNase Away（赛默飞世尔，目录号：7003PK）或70%乙醇（Julius Hoesch GmbH，目录号：125900）

2. 1.5 ml和2 ml Eppendorf管

3. 含一个或多个5-乙炔基-2'-脱氧尿苷修饰的2.5 nmol干燥RNA寡核苷酸（商业合成并以干燥形式交付，例如，从Metabion或Biomers获得，更多细节见程序），储存于-20℃下°C（注1）

4. 焦碳酸二乙酯（DEPC，Carl Roth，目录号：K028.3）-处理水（见配方）

5. 碘化铜；Carl Roth，目录号：0305.1），在室温和环境条件下储存在常规容器中

6. 二甲基亚砜（DMSO，Carl Roth，目录号：A994.2），室温储存

7. 3.6µl 250 mM三（（1-羟基丙基-1H-1,2,3-三唑-4-基）甲基）胺（THPTA，Sigma，目录号：762342-100MG）二甲基亚砜溶液，储存于-20°C、使用前将溶液旋涡

8. 2µl 100 mM 1,1,3,3-四乙基-5-偶氮异吲哚-2-氧基（Wuebben et al.，2019）或1,1,3,3-四甲基-5-偶氮异吲哚-2-氧基（Kerzhner et al.，2018）二甲基亚砜溶液，储存于-20℃下°C、使用前将溶液旋涡

9. 汉密尔顿注射器，50µ我

10. 缓冲液A，乙腈（Carl Roth，目录号：8825.2），室温保存

11. 缓冲液B，0.1 M醋酸三乙基铵（TEAA）（1 M溶液，Labomedic，目录号：2001741），室温下储存

12. 液相色谱-质谱（LC-MS）：缓冲液C，10 mM三乙胺（默克公司，目录号：90340-2.5L），室温保存

13. 对于LC-MS，缓冲液D，0.1 M六氟异丙醇（默克，目录号：18127-50ML），室温下储存

14. 用于自旋计数和标记效率测定：10µl毛细血管（Hirschmann-Laberger）äte，目录号：L925.1）

15. 氘化乙二醇（EG-d6）作为冷冻保护剂（默克公司，目录号：530549），室温下储存

16. 氘化水（D2O）作为溶剂（氘化水，订单号：00506），室温下储存

17. 移液管和匹配的细长移液管尖端（Sorenson BioScience，200）µ我是µltiFlex圆形，目录号：#28480），将样品转移到EPR管中

18. 对于PELDOR测量：由透明熔融石英（CFQ）制成的外径为3mm的Q波段EPR样品管（Wilmad LabGlass，目录号：G542PN000001470）

19. 轻型纸巾擦拭器（VWR，欧洲目录号：115-0202）

20. 液氮（液态空气）用于冻结样品，液氦（液态空气）用于冷却谐振器中的样品

21. DEPC处理水（见配方）

设备

1. SpeedVac真空浓缩器：Eppendorf concentrator plus（Eppendorf，转子：F-45-48-11）或冷冻干燥机：Alpha 3-4 LSC basic（Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen）

2. 热混合器（Eppendorf）

3. 台式离心机（Eppendorf）

4. Milli-Q超纯水系统（默克密理博）

5. 纳米滴分光光度计（赛默飞世尔）

6. 高效液相色谱（HPLC）系统（安捷伦，1200系列）

7. 反相C18柱，可加热（Zorbax 300SB-C18，4.6× 小于50个核苷酸或Zorbax 300SB-C18，9.4的RNA序列为150 mm× 250 mm柱，用于超过50个核苷酸的RNA序列）

8. 阿米康® 标称分子量限值（NMWL）为3000 Da的Ultra-0.5离心过滤装置（默克，目录号：UFC500396）

9. 液相色谱-质谱（LC-MS）系统（来自Bruker-Daltonics的HTC esquire与HPLC系统组合）。如果您无法访问LC-MS系统，您可以执行分析HPLC运行，然后通过基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱或电喷雾电离（ESI）质谱测定准确质量

10. 用于自旋计数和标记效率的测定：连续波（cw）EPR光谱仪（Bruker BioSpin，型号：EMXnano）

11. 脉冲EPR光谱仪（Bruker BioSpin，型号：ELEXSYS E580），配备Q波段微波桥（Bruker）和用于PELDOR测量的ER5106-QT2谐振器（Bruker）。当使用X波段谐振器进行连续波操作（如Bruker ER4119HS）时，也可以在该光谱仪上进行自旋计数实验

12. 150W行波管放大器（行波管，应用系统工程，型号：187kA）

13. 液氦低温恒温器（Oxford Instruments，型号：CF935）

14. 温度控制器（Oxford Instruments，型号：iTC503S）

15. 氦传输线（牛津仪器纳米科学公司，型号：LLT600或LLT650）和气体流量控制器（牛津仪器公司）

16. 用于排空低温恒温器的涡轮分子泵（Pfeiffer真空，型号：HiCUBE 80 Eco）

17. 用于维持冷氦气恒定流的膜泵（KNF Neuberger，型号：PM26962–026.1.2）

18. 液氮温度下用于冲击冷冻和处理EPR样品管的杜瓦容器（KGW等温线，00C型，13.5 cm高；3C型，26厘米高）

19. 100 L液氦罐（Cryo-Anlagenbau，型号CS 100 H）

20. 护目镜和防寒手套

21. 与光谱仪一起交付的带Linux的PC

软件

1. Matlab版本R2018a或更高版本（MathWorks公司。，www.mathworks.com). 对于DeerNet，应安装用于Matlab的深度学习工具箱和信号处理工具箱

2. Matlab的DeerAnalysis（例如，DeerAnalysis 2019）工具箱，免费提供（例如。杰施克，https://epr.ethz.ch/software.html)

3. 用于数据分析和绘图的软件，例如Origin（OriginLab Corporation，www.originlab.com)，西戴维斯(http://scidavis.sourceforge.net)，或Excel（Microsoft Corporation，https://products.office.com/excel)

4. Xepr软件，与EPR光谱仪一起提供，用于硬件控制和数据采集（Bruker）

5. 生物信息学自旋标记软件，如mtsslSuite（如。哈格勒肯，www.mtsslsuite.isb.ukbonn.de;

Hagelueken等人，2015年），MMM（G。杰施克，https://epr.ethz.ch/software.html; Polyhach等人，2011）或基于GFN/FF的CREST/MD（S。格里姆，https://github.com/grimme-lab; Spicher等人，2020年）

6. IDT分析工具（IDT，www.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer)

7. 传感器计算器（D。阿卜杜林，https://github.com/dinarabdullin/SnrCalculator)

程序

答。RNA标记

1. 订购修改后的RNA寡核苷酸。对于本协议，使用以下顺序：

5′-GCG GGG ACG ACC CXG C-3′，含X=5-乙炔基-2′-脱氧尿苷

标记位置不应干扰RNA的整体结构或功能；因此，避免在催化活性部位或结合袋处进行标记。为了尽量减少可能的干扰，通过将天然存在的尿苷核苷酸与修饰的5-乙炔基-2′-脱氧尿苷交换来设计修饰的寡核苷酸链。此外，在可能的情况下，最好将修饰整合到双链RNA区域中，因为这促进了窄距离分布。

注意：建立一个无核糖核酸酶的环境：用70%乙醇或核糖核酸酶清洗你的工作台和工具，例如移液管。在整个工作流程中戴上防护手套。

2. 将RNA等分

答。将RNA寡核苷酸溶解在DEPC处理过的水中（见配方）。

b。将2.5 nmol RNA等分放入1.5-ml Eppendorf管中（注1）。

c。在SpeedVac真空浓缩器或冷冻干燥机中干燥RNA寡核苷酸小份。

将干燥的RNA寡核苷酸等分保存在-20°C。

三。建立RNA标记反应

答。将热混合器预热至60℃°C。

b。在4.4中溶解干燥的RNA寡核苷酸µDEPC净化水（见配方）。

c。称取1-2 mg CuI（X）于2-ml Eppendorf管中，并计算二甲基亚砜（Y）的体积，得到50 mM Cu+溶液：

X[毫克]∙ 100g=Y[µ[左]

0.952 [ ]

我

继续之前，请阅读注释2！

d。在Y中溶解CuIµl二甲基亚砜，并立即通过混合制备Cu+络合物：

20µ二甲基亚砜

8µl前一步的50 mM Cu+溶液

3.6µl 250 mM THPTA/DMSO溶液

旋涡混合物并在室温下培养5分钟

e。通过将以下溶液移液到含有溶解RNA的1.5-ml Eppendorf管中来建立标记反应（步骤A3b）：

2µl自旋标签/DMSO溶液，取自100 mM储备溶液

4.6µl THPTA Cu+溶液（步骤A3d）

旋涡反应混合物并在300转/分和60转/分的转速下培养反应°C持续30分钟（注3）

4. 脱盐RNA寡核苷酸，并通过Amicon超离心过滤装置去除Cu+

答。加480µ将处理过的水排放到每个反应管中，并将每个溶液转移到反应器中

Amicon Ultra-0.5过滤器，先前插入Amicon收集管。

b。在14000转并浓缩30分钟× g和室温。

c。加500µl DEPC将处理过的水送入Amicon过滤装置，在室温和14000℃下再次旋转30分钟× g、丢弃流通管。

d。再次重复步骤A4c。

e。对于RNA回收，转动Amicon过滤装置并将其插入干净的Amicon收集管中。在室温和14000℃下旋转2分钟× g。

f。移液管50µ将l Milli-Q水注入Amicon过滤装置中，通过上下移液或旋转方式清洗膜。然后，将过滤装置再次倒置，在室温和14000℃下旋转2分钟× g。

g。如步骤A4f所述，再次清洗滤膜两次以上。样本量现在应该在200左右µl。

h。使用NanoDrop测定RNA寡核苷酸（nRNA）的量：用70%乙醇清洁NanoDrop测量底座，使用轻型纸巾擦拭器。用移液管转移1µ将处理过的水排放到测量基座上，并进行空白测量作为参考。用轻型纸巾擦拭器、移液管1清洁底座µ将RNA溶液置于测量基座上，在260 nm处测量吸光度

（Abs260nm）。然后用消光系数计算nRNA(), 由供应商提供或使用在线工具（如IDT寡核苷酸分析工具）计算，并使用以下方法计算RNA寡核苷酸样品（VRNA）的体积：核糖核酸

1

[绝对值260nm][厘米

我∙ VRNA[L]=nRNA[mol]ε核糖核酸∙ 摩尔

用SpeedVac真空浓缩器或冷冻干燥机蒸发RNA寡核苷酸样品中的多余水分，直到获得的体积不超过HPLC回路容量的一半。如果使用100µl注入回路，例如，注入30-50体积µl。

5. 反相高效液相色谱纯化

答。从反相柱的平衡开始。因此，将色谱柱重新缓冲至8%缓冲液A（乙腈）和92%缓冲液B（0.1 M醋酸三乙酯铵）。

b。在纯化样品之前，先进行空白试验，检查柱的纯度：装载30-50µ用汉密尔顿注射器将l Milli-Q水注入注射回路，并开始HPLC运行。空白运行使用与RNA样品纯化运行相同的操作参数。一般来说，您需要为每个新的RNA序列微调HPLC运行。但是，您可以使用以下设置作为小于50个核苷酸的RNA序列的起点：用8%的梯度洗脱→ 25%缓冲液A，流速为1.5 ml/min，持续20 min。然后，将柱平衡至8%缓冲液A。对于短RNA序列，使用分析的Zorbax 300SB-C18，4.6× 150 mm柱，但对于超过50个核苷酸的序列，使用制备的Zorbax 300SB-C18，9.4 x 250 mm柱。制备柱的洗脱曲线为：用8%乙腈洗脱10min，然后施加8%的梯度→ 23%缓冲液A 55分钟，恒定流速为2 ml/min。最后，将柱平衡至8%缓冲液A。加热HPLC柱以避免三级RNA结构的形成很重要（图2）。把柱子加热到60度°C，也在空白运行期间，保证相同的条件。

图2。不同柱温下未标记RNA的标准化HPLC色谱图。柱加热后，三级结构的形成受到抑制，从而产生单峰（黑色色谱图）。

c。把你的RNA样本注入循环。不要注射超过2.5 nmol RNA，以避免柱过载。但是，您应该检查制造商说明中所使用的特定列的容量和特性。

d。运行HPLC方法。

e。分别收集未标记和标记RNA的部分。采集可以手动进行，如果您的HPLC配备了馏分采集器，则可以自动进行。如果你使用一个分数收集器，你可以设置一个限制来收集所有超过吸光度的东西，例如，15毫安。

f。分别汇集每个HPLC峰，并在SpeedVac真空浓缩器中浓缩溶液，直到获得约500的体积µ我为每一个峰。

g。完成HPLC运行后，继续纯化下一个样品或储存HPLC柱。列的存储是通过将其重新缓冲到80%的缓冲区A来实现的。

6. 用Amicon超离心过滤装置对标记RNA进行脱盐

答。如上文步骤A4a-A4h中所述，使用Amicon超离心过滤装置将RNA样品脱盐。

b。脱盐后的RNA样品，集中在真空浓缩机，直到你达到所需的浓度。相对于RNA的起始量，通常获得50-70%的产率；损失主要来自净化步骤。

标记本身是定量的，如HPLC色谱图所示（图3）。

图3。不同HPLC运行的标准化色谱图。答。通过注入水获得的色谱图（空白运行）。B。通过注射未标记的RNA获得的色谱图。C。从标记反应中注入RNA得到的色谱图。从标记的RNA（C）的色谱图可以推断，反应混合物中几乎没有未标记的RNA，因为在~2min的保留时间内只得到一个可忽略的峰。为了进一步纯化，只收集并使用保留时间为10分钟的峰。

7. 通过LC-MS（或分别采用HPLC和质谱法）测定标记RNA序列的纯度

答。对未标记的RNA进行LC-MS测量，作为参考。该程序类似于HPLC运行（用缓冲液C平衡色谱柱、进样、运行和储存）。使用5%的渐变→ 20%缓冲液D，20分钟，恒定流速为

0.4毫升/分钟。

b。对标记的RNA样品进行LC-MS测量；使用步骤A7a中指定的梯度。成功的标记可以通过确定特定LC峰中存在的物种的确切质量来检查。

c。如果您无法使用LC-MS系统，请执行分析HPLC运行，并对含有RNA的部分进行ESI-MS或MALDI-MS以确定准确的质量。

8. 测定自旋标记效率

答。测定标记RNA的浓度(𝑐𝑅𝑁𝐴) 使用纳米滴（步骤A4h）。

b。准备10µ我25岁µM RNA溶液，如果每个RNA链都单独标记。如果RNA链是双重标记的，则将RNA浓度减半。

c。将溶液倒入10号罐中µ我是毛细血管。

d。按照EMXnano光谱仪用户手册中的说明进行cw EPR测量。使用Bruker的“自旋计数”程序来确定自旋浓度(𝑐𝑠𝑝𝑖𝑛). 确定自旋浓度的另一种方法是对cw-EPR谱进行双重积分，并将此二重积分值与已知自旋浓度的参考样品的二重积分值联系起来。两种自旋定量方法的误差在10-20%之间。

e。计算贴标效率。对于单标记RNA序列，效率由下式给出：

cspin公司

∙ 100=标记效率[%]cRNA

对于双标记序列，使用：

cspin公司

∙ 100=标记效率[%]2cRNA

f。请记住，虽然LC-MS显示几乎定量标记，但由于纯化过程中的损失，相对于起始RNA，标记RNA的产率为50-70%。

9. 准备PELDOR样品

答。对于单个标记的RNA，将2.0 nmol转移到Eppendorf管中，并在SpeedVac真空浓缩器或冷冻干燥机中干燥。将双标RNA的数量减半。

b。将RNA溶解在64中µ重水。加16µl EG-d6作为低温保护剂，在Eppendorf管中小心混合溶液。这就产生了80个样本µ自旋浓度为25µM含20%v/v EG-d6（注4）。在PELDOR测量期间，谐振器应完全充满样品；因此，即使你的RNA数量很少，也要避免制备体积小于60的样本µl。

c。填满整个80µl放入外径为3 mm的Q波段EPR管中，用Eppendorf移液管使用加长移液管尖端。小心摇动EPR管，使样品在底部聚集。

d。通过小心地将EPR管浸入带有液氮的杜瓦容器中来冷冻样品。由于EPR管在冷冻过程中可能会破裂，因此在处理液氮时，应佩戴安全护目镜和防寒手套。将试管放入装有液氮的杜瓦容器中。

B。PELDOR测量

1准备用于PELDOR测量的ELEXSYS E580 Q波段EPR光谱仪（Bruker BioSpin）：

由于电子顺磁共振光谱仪是一种敏感设备，在操作员出错时可能会损坏，因此请遵守本协议和仪器用户手册中的说明。如有疑问，请向更有经验的同事寻求建议。

答。将涡轮分子泵连接至低温恒温器，打开泵，并将低温恒温器排空至约10-4 mbar的减压。通宵排空可能有助于达到所需的真空条件。

b。打开光谱仪的热交换器，检查流入和回流的温度。根据环境温度，前者应在10-15左右°C，后者不应超过25-30°C。如果分光计有一个封闭的冷却回路，检查系统中的水位，必要时重新加注。

c。打开光谱仪控制台、磁铁电源和行波管放大器。保持行波管处于待机状态是防止探测系统损坏的重要措施。在开始测量前，给系统预热1小时，以确保光谱仪的电子稳定性。

d。将氦气罐的溢流阀连接到氦气回收系统（如果您的设备有）。确保流经管道的气流没有阻塞（例如，由于弯曲），并打开氦气罐上的溢流阀以防止压力积聚。

e。从这一步开始，戴上防寒手套和护目镜！打开氦气输送管上的针阀。缓慢地（整个过程约3分钟）将输送管插入氦罐。当输送管线进入液氦时，煤气表将显示气流，偶尔可以听到嘶嘶声。如果氦气直接从上部开口流出油箱，首先用手拧紧环绕传输线的螺母，然后在传输线完全插入油箱后用扳手将其固定。

f。将传输线的喷枪浸入乙醇中，检查气流。用纸巾擦拭气体出口，并将喷枪连接到光谱仪的低温恒温器上。

g。用空样品棒关闭低温恒温器，以防止低温恒温器内的空气冷凝。

h。将膜泵连接到输送管上的端口。打开输油管上的针阀约¼ 打开膜泵以保持冷氦气流。使用低温恒温器的气体流量控制器，将氦气流量调节至~1 L/h。打开iTC503S温度控制器并将目标温度设置为50K。将低温恒温器从环境温度冷却到50K通常需要20-30分钟（注

5).

一。从液氮杜瓦容器中取出EPR管，用纸巾快速擦拭，以去除潜在的污染物和冰。但是，确保不要将EPR管在液氮外保持太长时间，以防止样品升温。如果液氮在管内凝结，加热管可能导致样品喷出，甚至管破裂。

j。将EPR管插入紧密配合的样品架中，调整其位置，使样品位于谐振器的EPR有源区。对于ER5106-QT2谐振器，样品的中心应低于管座下端38 mm。

k。将插入EPR管的样品架拧入样品杆。

l。确保光谱仪处于待机模式。停止薄膜泵，等待气体流量控制器的指针降至零，然后从低温恒温器中取出空样品棒。快速，但也要小心和笔直，插入样品棒，与电子顺磁共振管安装，尽可能地去。不要让低温恒温器长时间打开，以防止空气凝结（注6）。在进行下一步之前，至少等待20分钟，以使样品达到热平衡。

2. 光谱仪调谐和安全检查

答。通过分光计手册熟悉Xepr软件的基本功能和操作窗口。尤其要查找“脉冲表”、“脉冲像素”、“SpecJet”、“FT-EPR参数”、“FT桥”、“微波桥调谐对话框”和“采集触发器”等关键字。如果需要进一步解释，请向经验更丰富的EPR同事咨询。在下面的步骤中，您应该在特定步骤中使用的Xepr软件中的按钮、输入框和菜单栏用引号设置。

b。通过在“Acquisition”（采集）菜单中选择“Connect to spectrometer”（连接到光谱仪），将Xepr软件连接到光谱仪，并打开“微波桥调谐对话框”。进入

“调谐”模式并将“衰减”设置为10 dB。将微波（MW）频率设置为~33.7 GHz。

c。对谐振器进行过耦合（注7）。ER5106-QT2谐振器有两个螺钉用于调整腔长（右螺钉）和腔耦合（左螺钉）。调整谐振腔长度，使谐振器调谐倾角在“微波桥调谐”对话框中可见。注意，ER5106-QT2谐振器有两个调谐倾角，一个“真”倾角和一个“假”倾角。这些可以区分为“假”下降明显移动时，耦合螺钉

是旋转的，而“真正的”倾斜保持在原地。改变腔长可以同时移动两个凹陷。

调整空腔耦合和空腔长度，以使“实际”倾斜度位于

调整对话框，并且“假”倾斜度的最小值在窗口的右侧。

d。按照仪器手册中的说明对分光计的检测系统进行安全检查。注意：如果没有防御脉冲，不要试图将行波管切换到工作模式，因为这会损坏检测电路。如有疑问，请咨询分光计管理员。

3. 优化站立的哈恩回声（韦伯，2005）

答。将“中心场”B0调整到当前兆瓦频率下g~2.00对应的值ν (e、克，B0~11980克ν ~33.7千兆赫）。

b。在脉冲表中，对哈恩回波序列进行编程(π/2––π––回波）进入“+x”通道，使用12 ns和24 ns的脉冲长度π/2和π-分别是脉冲。使用

 = 脉冲间延迟为200纳秒。输入脉冲长度和脉冲延迟后

在表格中，按键盘上的“回车”键确认每个条目。

c。从下拉菜单中选择“采集触发器”通道，并在“位置”0 ns处将采集触发器“长度”设置为4 ns。将“积分器时基”设置为1.0 ns，“放炮代表时间”设置为3000µs、 “每点射击”的次数是10次。

d。在模式窗口中点击“开始”，在SpecJet中点击“运行”，并降低MW“衰减”，观察SpecJet中的Hahn回波。调整“衰减”以使哈恩回波幅度最大化，即获得π/2和π-给定脉冲长度的脉冲（注8）。

e。将SpecJet中的“平均数”设置为1。设置“视频带宽”为20兆赫，并调整“视频增益”放大，使回声不被剪辑。微调MW相位，使回波在正交检波器的真实通道中完全检测到（SpecJet中的绿色轨迹）；虚拟通道中的信号（SpecJet中的黄色轨迹）平均应为零。在这种情况下，“中心场”的微小变化可能有助于使样品完全共振。

4. 记录回波探测场扫频EPR谱

答。调整脉冲表中的采集触发器“位置”，使回波从SpecJet窗口左侧开始，并将采集触发器“长度”增加到~120 ns，以覆盖整个回波（图4A）。这使得场扫光谱的光谱分辨率最大化（图4B）。

图4。建立脉冲EPR实验的初始步骤。答。哈恩回声。B。回波探测场扫电子顺磁共振谱。（A）中的灰色区域标记积分区域以获得场扫描光谱。

b。在FT-EPR参数窗口内的“Field”选项卡中，将“Sweep Width”设置为400 G。

c。切换到“采集”选项卡以设置“X轴大小”，即光谱中的点数。通常，800是合适的值，对应于0.5 G/点的分辨率。

d。按主窗口中的“运行”按钮记录光谱（图4B）。根据自旋浓度，平均多次扫描以获得良好的信噪比（SNR），并将数据保存到磁盘。

e。读出磁场扫频谱中产生最大信号强度的磁场值，然后写下来，以后需要它。

5. 进行双脉冲电子自旋回波包络调制（Two Pulse ESEEM）实验以获得横向电子自旋弛豫的信息，这限制了PELDOR实验中的偶极演化窗口。在双脉冲ESEEM实验中，Hahn回波幅度被监测为脉冲间延迟的函数. Bruker提供的默认PulseSPEL程序将其记录为. 然而，请注意，一些文献显示这些哈恩回波衰减曲线是2的函数.

答。将“中心场”设置为磁场扫描频谱中信号最大值的磁场值。

b。在“采集”选项卡中，单击相应的按钮打开“PulseSPEL”。

c。为双脉冲ESEEM实验加载标准PulseSPEL程序，默认情况下，该程序位于以下文件夹中：

“xeprFiles/PulseSPEL/sharedPulseSPEL/Standard/Spel2009/ESEEM”，以及相应的变量定义“descrESEEM.def”。

d。将变量设置为表1所示的值。

表1。双脉冲ESEEM实验参数

参数

说明

价值

p0

长度π/双脉冲

使用您在第B节第3d步中确定为最佳的值。

第1页

长度π-脉搏

d1级

初始脉冲间延迟

200纳秒

第0页

采集触发偏移

0 ns（用于安装）

通常~432ns（用于实验）

SRT公司

放炮重复时间

3000*srtu（srtu=1.02）µs）是的。

小时

每点射击次数

10

第30页

时间增量

8纳秒

e。按此顺序单击“编译”、“显示程序”和“验证”按钮。

f。在“采集”工具栏中，选择选项“从PulseSPEL运行”，选择实验“2P ESE设置”，然后按主程序窗口中的“运行”按钮。读取回波幅度最大的时间值，并将该值设置为采集触发延迟参数d0。通常，该值等于d0=432 ns。

g。选择具有两步相位循环的“2P ESEEM”实验，将该实验的点数（PulseSPEL程序中的参数dim2）设置为1024，然后单击主窗口中的“运行”按钮以记录Hahn回波衰减曲线（图5B）。

图5。双脉冲ESEEM实验。答。Hahnecho序列的示意图。在双脉冲ESEEM实验中，脉冲间延迟 增加，回波幅度作为. B。典型的哈恩回波衰减曲线。插图显示了最初的1.5µ在记录道的s处，232ns处的最大值用红线突出显示。

h。如果在长脉冲间延迟时曲线未达到零电平, 增加点数和/或时间步长d30。读出回波强度几乎为零的时间值并记下来。

6. 设置PELDOR实验

PELDOR是一个使用探头频率的双频实验ν探针在分子中的自旋a上产生信号，并以泵的频率翻转同一分子中的自旋Bν泵。四脉冲PELDOR序列如图6所示。首先，一个Hahn回声（HE）是由一个π/2和aπ-脉冲施加在ν探测并影响自旋A。接下来，一个泵脉冲π频率泵ν泵反转旋转B。最后，重新聚焦π-脉搏ν使用探针，重新聚焦自旋A的哈恩回波。在PELDOR实验中，泵浦光脉冲的位置在时间间隔内增加 再聚焦回波的积分强度（RE）是延迟T的函数。这就产生了所谓的PELDOR时间轨迹。如果自旋A和B之间发生分子内偶极耦合，耦合频率将被编码在时间轨迹的振荡中。整体指数衰减是指分子间偶极相互作用。2

图6。PELDOR序列的示意图。探头频率的微波脉冲显示为黑色，泵脉冲显示为红色。”他“简化了哈恩回声，”重新“聚焦回声。在PELDOR实验中，泵浦光脉冲的位置在第一个间隔内增加 测量了RE的积分强度与T的函数关系。2

PELDOR实验的建立由不同的步骤组成，并且由于PELDOR需要相位循环和核调制平均，它通常从PulseSPEL程序运行。Bruker EPR光谱仪默认配备了用于PELDOR的PulseSPEL程序；然而，许多研究小组已经开发了他们自己的程序，以自定义变量定义和约定为特色。在这里，我们描述了如何用我们版本的PulseSPEL程序建立PELDOR实验，该程序在附录中提供。

答。设置Hahn回波的变量，并在泵浦频率下对其进行优化，泵浦频率应用于谐振器倾角的中心（33.7ghz）。

一。将PELDOR程序和变量定义文件加载到PulseSPEL中。

二。在PulseSPEL中设置以下参数（表2）：

表2。建立佩尔多实验的参数。给定的参数是初始值，将在实验设置过程中进行优化

参数

说明

价值

p0

长度π/双脉冲

使用在步骤B3d中确定为最佳的值。

第1页

长度π-脉搏

第2页

泵脉冲长度

第一个猜测是16纳秒。

第0页

采集触发偏移

约360纳秒

d1级

脉冲间延迟 1

双脉冲ESEEM记录道中第一个最大值的时间，此处为232 ns。

d2级

脉冲间延迟 2

将其设置为具有足够信号强度的长度，在本例中约为3000-4000 ns。

SRT公司

放炮重复时间

3000*srtu（srtu=1.02）µs）是的。

小时

每次放炮次数

点

10

米

步骤数

核调制平均

8

第30页

跟踪的时间增量

8纳秒

第31页

核调制平均时间增量

16纳秒

d3级

仪表相关死区延时

通常约100 ns

注意，PELDOR实验对这些参数在一定范围内的变化是宽容的。然而，设置完全不正确的参数将导致低信噪比、低调制深度和数据失真。

iii.按此顺序单击“编译”、“显示程序”和“验证”。

四、选择“2P ESE设置”实验。按主窗口中的“运行”按钮，在SpecJet和脉冲表中单击“开始”，并将“衰减”降低到0 dB。

五。打开“MPFU控制”选项卡。将“<+x>振幅”滑块拖动到~6070%的水平，以最大化SpecJet中的Hahn回波振幅。

vi.使用FT bridge窗口中的“Signal phase”（信号相位）滑块调整全局MW相位。应调整MW相位，使信号出现在SpecJet的实通道中，而虚通道的平均值应为零。

b。应用泵浦脉冲反转回波，并确定最佳泵浦脉冲长度。

一。在脉冲表和SpecJet中单击“停止”。

二。选择“3P ELDOR Setup”实验，将“Current ELDOR Frequency”设置为当前分光计频率（~33.7 GHz），然后按主窗口中的“Run”按钮。写下“当前ELDOR频率”以备将来使用。

iii.读取视口中回波最大值出现的时间（图7A，例如72 ns），将其添加到d0，并以脉冲像素的形式设置d0的新值（例如432 ns）。按

主窗口中的“运行”；回波现在应该在视图端口横坐标上的零时间达到最大值（图7B）。

图7。通过改变脉冲像素变量d0来调整时间轴上的回波位置。答。d0=360 ns，回波最大值位于72 ns。B。d0=432ns，回波最大值与横坐标原点重合。

iv.启动SpecJet。将“ELDOR衰减”降低至0 dB，这将反转Hahn回波（注9a-d）。

五。在SpecJet和Pulse Tables窗口中单击“Stop”。选择“3P ELDOR章动”实验，在主窗口中按“运行”；这个实验增加了泵浦脉冲的长度并测量了哈恩回波的幅度。读取导致章动轨迹全局最小值的泵脉冲长度，并将此值设置为参数p2。通常，根据样品，可获得12 ns到18 ns之间的最佳泵浦脉冲长度（注9e）。

六、设置“衰减”为60分贝，“衰减”为30分贝，将行波管放大器切换到待机模式。将中波电桥设置为“CW”模式。

c。改变MW频率，优化探头频率下的Hahn回波。

一。打开“MW电桥调谐对话框”，并使用

“频率滑块”二。按照仪表手册中的说明进行安全检查，并将行波管切换到操作模式。iii.选择“2P ESE设置”实验，相位循环选项“<+x>none”，然后在主窗口中按“Run”。

iv.在Pulse Tables（脉冲表）窗口中单击“Start（开始）”，在SpecJet中单击“Run（运行）”，然后以10 dB的步长将“Attenuation（衰减）”减小到0 dB。

五。拖动MPFU控制窗口中的“<+x>振幅”滑块，使回波振幅最大化。调整“<+x>相位”，使信号在实际信道中具有负号。假想信道的平均值应为零。

vi.选择“<-x>无”阶段循环选项，然后再次单击主窗口中的“运行”。

调整“<-x>振幅”滑块，使哈恩回波最大化。拖动“<-x>

相位“滑块，使信号在实际信道中具有正号。信号的虚部平均应为零。七。确保使用相位周期选项获得的绝对回波振幅“<

+“x>无”和“<-x>无”相等。

d。选择偶极演化窗口的长度. 2

一。间隔的长度, i、 PELDOR时间迹的长度由两个方面决定，即横向电子自旋弛豫和要解析的自旋间距离。横向电子自旋弛豫决定了偶极演化窗口的最大值，这可以从步骤B5中记录的Hahn回波衰减曲线中读出。最小长度 给出了需要解决至少1.5偶极振荡编码的最可能的距离在样本可靠的数据分析。22

二。如果您事先知道预期的自旋间距离（例如，从硅自旋标记），计算预期的振荡周期并设置 相应地，在时间轨迹中解决至少1.5个振荡。2

iii.如果没有关于预期距离的信息，请为 根据哈恩回波衰减曲线。套 在双脉冲ESEEM记录道中仍保留足够信号强度的值。如果你后来意识到解决1.5振荡需要更长的偶极演化时间窗口，中止PELDOR运行，增加, 重新开始测量。请注意，人工制品可能出现在时间跟踪的末尾，稍后必须将其切断（请参阅数据分析部分）。考虑到这一点，因此增加 足够了。2222

iv.设置所选值 在PulseSPEL中，单击“编译”、“显示”将其激活2

根据时间跟踪的长度，考虑增加或减少时间增量d30。在足够高的偶极振荡分辨率和可接受的测量时间之间找到一个平衡点（注10）。

e。优化重新聚焦的Hahn回波。

一。将“ELDOR衰减”设置为0 dB。

二。选择“4P DEER Setup”程序和相位循环选项“2步”。在主窗口中单击“运行”，在脉冲表窗口中单击“开始”，在SpecJet中单击“运行”。

iii.将SpecJet中的“平均数”设置为1。

iv.增加“视频增益”放大，使回波充满SpecJet的整个显示，而不会在顶部或底部边缘进行剪切。

五。在SpecJet中，将“平均数”设置为更高的值（100-1000），以便可以清楚地识别回波。根据累积的瞬时平均数，这可能需要一段时间。

六、按主窗口中的“Run”键，将SpecJet的回波传输到视口中。读出回波最大的时间位置。

七。将积分门宽度（PulseSPEL中的参数pg）设置为PELDOR序列中最长脉冲的长度，很可能是π-探头频率脉冲。八。调整采集触发偏移d0，使回波最大值位于积分门的中心。示例：假设以d0=360 ns记录的重新聚焦回波在72 ns处达到峰值（图8A）。从时间轴的零点开始，积分门长度应为24 ns（图8B中的灰色矩形）。因此，为了将回波最大值传输到12 ns的位置，设置采集延迟d0=360 ns+（72-12）ns=420 ns。

图8。通过改变脉冲像素变量d0来调整回波位置。答。d0=360 ns，回波最大值位于72 ns。B。d0=420ns，回波峰值为12ns。灰色矩形表示PELDOR实验的积分门宽度为24 ns。

九、点击主窗口中的“运行”，检查回声的正确定位。

f。进行佩尔多实验。

一。计算要记录在PELDOR时间轨迹上的点数，并将其设置为PulseSPEL程序中的参数dim5。由以下公式得出：

d1+d2-2d3尺寸5=

第30页

脉冲间延迟了PELDOR序列的d1和d2( 以及 在图6）中，分光计的死时间延迟为d3，时间增量为d30。12

二。从下拉菜单中选择“4P鹿”实验和两步阶段循环，然后单击主窗口中的“运行”。单击主窗口工具栏中的“Re/Im”按钮

显示虚拟通道并确保它是平坦的并且在零电平附近。如果在假想信道中有可观的信号量，则相应地改变MW相位。

iii.设置足够高的扫描次数（50-1500次），以获得良好的信噪比。信噪比可以定义为调制深度除以噪声的标准偏差，并且应至少达到20或更好的100，以便进行可靠的数据分析。可以使用例如程序SNR计算器来实现SNR的确定。根据自旋浓度、时间轨迹的长度和选择的频率偏移，通常采集时间在4小时到48小时之间（注10）。

iv.测量完成后，将数据以标准Bruker-bes3t格式（.DTA/.DSC文件）保存在磁盘上。

上面描述的所有关键步骤的摘要如图9所示。

图9。建立佩尔多实验的关键步骤概要。答。瞬时章动实验。导致回波最大反转的最佳泵浦脉冲长度在记录道的全局最小值处给出，并用红线标记。B。重新聚焦哈恩回声。积分门的长度为24 ns，用灰色阴影区表示。C。

在数据处理之前从光谱仪获得的原始佩尔多时间轨迹。

7. 将行波管切换到待机模式。将“衰减”设置为60 dB，并将“衰减”设置为

衰减”至30 dB。将微波桥切换到“CW”模式，然后切换到“待机”。

8. 如果RNA链和自旋标签是刚性的，如这里和Wuebben等人，2020中的情况，则可以发生取向选择，即，并非在一对泵和探针频率中对关于外部磁场的自旋间矢量的所有取向进行采样。方向选择通过偶极振荡变得依赖于微波频率偏移而表现在PELDOR时间轨迹中Δν. 此外，时间轨迹的傅里叶变换不再显示整个Pake模式。

关于数据采集，存在两种方法来处理方向选择。首先，在最小方向选择的频偏下进行PELDOR实验；在我们的手中，这是通过在氮氧化物光谱的最大值处施加泵浦脉冲和在-80兆赫的偏移量处施加探针脉冲来实现的ν泵。

其次，PELDOR测量可以在不同的信号组合下进行ν泵和

ν探查。这种方法还提供了在数据分析过程中明确考虑方向选择性的可能性（见数据分析部分；Wuebben等人，2019年）。

如果您选择后一种方法，请从步骤B6c开始重复此协议，现在使用另一个偏移量ν泵和ν探针（图10）。建议对一个或多个特定样品进行定向选择性测量，而不要将样品移走。因此，谐振器内的调谐和样品定位对于所有偏移都是相等的，并且光谱仪灵敏度的变化不会影响数据质量。

图10。回波探测场扫描EPR谱，泵脉冲和探头脉冲的位置指示不同的频率偏移Δν

9. 如果已对特定样品进行了所有测量，则关闭膜泵，等待气流控制器的指针降至零，然后取下样品棒。

10. 此时，可以对另一个样品进行PELDOR测量，也可以按照仪器手册中的说明完全关闭光谱仪。

注：最好在两到三个独立制备的样品上进行PELDOR实验，以确保数据的可靠性和再现性。

数据分析

1. 如果在显示最小方向选择性的频率偏移处记录了单个PELDOR时间轨迹(Δν = 80兆赫），从第3点开始执行数据分析。

2. 如果在泵和探头位置的不同组合处收集了PELDOR数据（图11A），则按以下方式预处理时间记录道：将不同偏移处记录的原始数据除以相应的扫描次数。然后，将所有记录道相加，并保存结果以供进一步处理（图11B）。这样，可以最小化方向选择。这一步可以使用Xepr软件中的数据处理工具来执行，如果要处理许多记录道，则可以更方便地使用自行编写的Matlab脚本来执行。

或者，为了获得关于自旋标签相对于外部磁场的方向的额外角度信息，可以使用PeldorFit程序（Abdullin et al.，2015）。

图11。定向选择性PELDOR数据分析。答。在泵和观察者频率之间的不同偏移处获得的时间轨迹。B。将（A）中所示的记录道相加得到的时间记录道。C。从（B）开始的时间跟踪，背景拟合显示为红线。在轨迹末端去除人造物的截止线以蓝色显示。D。

用Tikhonov正则化得到的拟合进行背景校正的时间跟踪。箭头表示调制深度λ. E。通过（D）的傅里叶变换得到的Pake图案。F。带正则化参数的L曲线，用于计算以红色突出显示的距离分布。G。背景验证的距离分布显示为灰色阴影。

3. 启动Matlab。在Matlab中，点击“设置路径”按钮，将DeerAnalysis文件夹及其子文件夹导入Matlab。单击“保存”、“关闭”，然后通过命令行输入“DeerAnalysis”启动DeerAnalysis。有关详细说明，请参阅手册和DeerAnalysis的原始出版物（Jeschke et al.，2006）。

4. 在DeerAnalysis中，单击窗口右侧的“加载”按钮。选择包含无方向选择的PELDOR时间跟踪的文件（ASCII格式的.dat或BES3T格式的.DTA/.DSC）。如果使用BES3T格式，请确保.DTA和.DSC文件都位于同一文件夹中。

5. 使用图形用户界面（GUI）左上角的界面调整原始数据处理的参数。通过单击“+”和“-”按钮或直接输入值，将零时间设置为时间跟踪的最大值。执行相位校正，使数据集的虚部平坦且近似为零。作为起点，单击“！”与相位校正选项关联的按钮。

6. 设置cut-off参数以删除时间跟踪结束时的人工制品（图11C）。这些伪影主要与泵浦脉冲和再聚焦脉冲的重叠有关，在记录道末端信号的突然上升表明了它们自己。

7. 应用背景拟合来移除偶极耦合的分子间部分。在GUI的中心面板中选择三维背景模型。该背景模型基于函数B（t）=e-kt和自旋密度k以及均匀分布的维数d（Jeschke等人，2006）。点击“！”-按钮自动优化后台启动的时间值。在时间域和频率域检查背景校正的质量：在时间域，在长偶极演化时间，轨迹应平坦（图11D）。在频域中，傅里叶变换应具有Pake图案的形状，并且在零频率处不应显示深孔或尖峰（图11E）。如果您确定了这些缺陷中的任何一个，请更改background start的值以改进background correction。如果仍然不成功，请考虑更改背景模型，例如，通过更改维度或选择多项式背景。第3天

8. 背景校正后，在GUI右侧的“距离分析”面板中选择“Tikhonov”选项，并勾选“L曲线”复选框。单击“Compute”按钮并等待L曲线出现在GUI中（图11F）。L曲线为解决将PELDOR时间轨迹转换为距离分布的不适定问题提供了一种方法，并允许为Tikhonov正则化选择正则化参数。在L曲线图中，横坐标表示拟合时间轨迹与实验数据的偏差，纵坐标表示由此产生的距离分布的粗糙度，两者均以对数标度表示。可以应用各种标准来确定最佳正则化参数，例如，L曲线角点准则（Lc）、广义交叉验证准则（GCV）和Akaike信息准则（AIC）。通常，选择一个靠近L曲线拐角的正则化参数是一个很好的选择。取消选中绘图上方的“L曲线”勾选框以显示距离分布。

9. 为了测试背景移除对距离分布的影响（图11G），通过单击“验证”按钮调用DeerAnalysis的验证例程。调整所选参数的验证范围并按下“计算”按钮。计算完成后，将显示背景拟合的集合、具有各自拟合的背景校正时间轨迹以及距离分布。单击“！”可以显示在选定正则化参数处具有最佳拟合的背景校正时间跟踪-在GUI中央的“参数集选择”按钮。选择一个提供的参数集，然后单击“关闭”按钮退出验证窗口。然后将选定的数据集传输到主窗口，距离分布显示为粗体黑线。从验证程序获得的不确定度分析显示为灰色阴影区域。

10. 点击“保存”按钮保存结果。这将生成ASCII文件，其中包含具有背景拟合（“*\u bckg.dat”）、背景校正轨迹及其拟合（“*\u fit.dat”）、偶极谱（“*\u spc.dat”）、距离分布（“*\u distr.dat”）和L曲线（“*\u Lcurve.dat”）的原始数据。包含上述所有参数的数据处理摘要将写入文件（“*\u res.txt”）。

11. 除Tikhonov正则化外，DeerAnalysis还提供了将偶极轨迹转化为距离分布的进一步方法。近似Pake变换（APT）是一种快速但不太复杂的方法，它用于在加载时间轨迹时获得距离分布的第一个猜测。从APT获得的距离分布仅应视为初步结果。DeerNet（Worswick et al.，2018）功能使用经过训练的神经网络分析时间轨迹，并一步完成背景校正和从时域到距离域的转换。DeerNet的一个优点是没有用户干扰，即不需要手动背景校正，也不需要选择正则化参数。这增加了数据分析的再现性，防止了数据偏差，特别是在背景不确定性方面。除了这些通用分析方法外，还可以使用假设的参数化模型，例如高斯形距离分布或随机线圈。在这种情况下，DeerAnalysis还允许构建和实现用户定义的模型。其他数据分析程序见注11。

12. 在您首选的数据可视化程序（例如，Origin、SciDAVIS、Matlab、Excel等）中绘制结果。

13. 除了自旋间距外，时间迹还提供了有关样品的更多信息，在解释数据时应考虑这些信息：时间迹可根据调制深度（分子中耦合自旋的数量）、背景衰减进行分析

（样品浓度和均匀性）和信噪比（样品质量/测量）。距离分布可以根据最可能和平均距离、宽度、形态和分布形状进行分析。任何要解释的分布特征都不能在验证中消失。特别是如果要解释分布的形状，例如路肩，则PELDOR数据应具有高质量，应具有可复制性，并应考虑从独立技术获得的额外证据。

14. 将PELDOR导出的距离分布转换为粗粒度结构模型。通过PELDOR测量，得到了两个未配对电子自旋之间的距离。为了将这种自旋间距离转换成结构信息，可以使用诸如mtsslWizard、MMM或基于GFN/FF的CREST-MD等硅自旋标记程序。基于生物分子的结构，既可以从数据库中获取，也可以在硅片中建模，这些程序生成自旋标签的转子流量计集合，并进一步计算自旋间距分布。将这种在硅中的分布与PELDOR衍生的分布进行比较，可以改进现有的结构模型，监测构象变化，并对接生物分子复合物的亚单位或部分（Duss等人，2014；Peter等人，2019年）。在这方面，建议使用不同的标记位置记录生物分子的几种结构的PELDOR数据。或者，可以测量锚定点（例如空间固定的金属离子）和各种标记位点之间的距离，从而允许通过三边测量将金属离子定位在生物分子的折叠内（Abdullin等人，2014）。此外，多聚体生物分子复合物的几何结构，以及由此而来的亚单位组装，已通过距离测量重建

（Hagelueken等人，2009年；Pilotas等人，2012年；瓦莱拉等人，2016年）。

特别是对于具有挑战性的系统，集成结构生物学已经成为一个强大的工具：例如，FRET、cryo-EM、NMR、X射线、SAXS和EPR的结合允许对结构进行全面的观察。这些方法是相互补充的，每种方法都提供了一些信息，这些信息可以组合成一个更详细的结构模型。图12总结了整合结构生物学的方法，并强调了EPR光谱的贡献。

图12。整合结构生物学。来自不同生物物理方法的信息被组合成生物分子的结构模型。并与实验（PELDOR）结果进行了比较。它们既可以相互匹配，也可以相互偏离：如果分布匹配，则模型成立；如果出现偏差，则需要进一步的实验以及模型的改进。

笔记

1. 通常，两个标记反应可以平行进行（在单独的Eppendorf管中），每个反应含有2.5 nmol RNA。反应可以在一个Eppendorf管中放大到5 nmol RNA，原则上，超过5 nmol RNA（在一个Eppendorf管中）也可以起作用。但是，放大时，可能需要调整反应条件，例如反应温度和时间。这对于你开始研究的每一个新的RNA寡核苷酸序列也很重要。

2. 在二甲基亚砜中溶解CuI后，当溶液仍呈黄色时，Cu+与THPTA的络合反应立即发生。Cu+很容易被大气中的氧气氧化（Hein和Fokin，2010；Chandrasekaran，2016）和

溶液中的Cu2+可以通过溶液的颜色来监测：当CuI完全溶解时，溶液由浅黄色变为深黄色，在5到10分钟内变为深绿色，最后变为棕色，此时不应使用溶液。

3. 每个新的RNA寡核苷酸的反应时间需要单独确定。为此，建议进行标记反应并取1或2个样品µl每5至10分钟。通过Amicon超离心过滤装置对这些样品进行脱盐后，可通过HPLC分析反应过程，如步骤A5所述。

4. EG-d6起到玻璃形成剂的作用，即冷冻样品是均匀的。在PELDOR实验中，玻璃态和氘化基体延长了电子自旋的相位记忆时间，使得偶极演化的时间窗口更长。注意一些生物分子可以与低温保护剂结合或相互作用（Vagenende等人，2009；施密特等人，2020年）。冷冻保护剂本身以及冷冻保护剂与生物分子的比例都必须针对每种情况进行优化。作为EG-d6的替代品，可以使用氘化甘油（甘油-d8）或海藻糖。

5. 如果温度没有稳定在50K或根本没有下降，请按给定顺序说明以下几点：

答。检查氦罐的加注液位。

b。检查所有管道是否与膜泵、气体流量控制器和输送管线的右端口紧密连接。确保氦回收端口打开。

c。确保传输线是可渗透的，并且没有被冰等堵塞。

d。如果温度不稳定，确保气体流量达到~1 L/h；流速过高或过低都会导致温度不稳定。此外，检查传输线绝缘层内的真空度，如有必要，排空传输线。

6. 使用小杜瓦容器冷却EPR管。这样，管的下部可以浸入液氮中，而样品棒的上部则在冷却剂的外面。这样可以将液氮转移到低温恒温器中的可能性降到最低，并且可以防止在测量后过度耦合谐振器和移除EPR管时出现困难。

7. 如果调谐不稳定，请检查以下几点：

答。微波频率稳定吗？如果没有给电子元件足够的时间预热，MW频率不稳定可能发生。此外，确保进入微波桥的冷却水不太热（<15°C）是的。

b。样品和低温恒温器是否处于热平衡状态，温度是否稳定？插入EPR管后，在开始测量前至少等待20分钟。

c。如果谐振器调谐倾角开始移动而光谱仪没有任何变化，氮气可能在低温恒温器中凝结。在这种情况下，取出样品，将低温恒温器预热至~120K至少20分钟，然后从步骤B1l重新开始。如果问题无法解决，则将低温恒温器预热至室温，并通过谐振器吹入氮气流过夜。

8. 如果看不到回声，请尝试以下步骤：

答。仔细检查微波频率、中心场、脉冲长度等参数。

b。确保SpecJet显示足够的点来检测回波。

如果在逐步将衰减降低到0 dB时，Hahn回波振幅未超过最大值，请考虑以下方面：

一。检查谐振器的过耦合。确保“真实”谐振器调谐倾角位于“微波桥调谐”对话框的中心。特别是，要确保“真正的”中心下降在窗口，而不是“假”下降。

二。MW功率可能不足以实现π/2和π-给定脉冲长度的脉冲。增加脉冲长度（例如π/2=16 ns和π = 32 ns），再次尝试优化Hahn回波。

9. 如果无法观察到回波反转，或者如果瞬态章动实验报告最佳泵脉冲长度大于18 ns，请说明以下几点：

答。确保“当前ELDOR频率”已正确设置，即设置为当前分光计频率。

b。检查泵脉冲长度（PulseSPEL程序中的p2）是否在12 ns和18 ns之间。

c。确保“ELDOR衰减”已设置为0 dB。

d。检查调谐，确保调谐倾角位于“MW电桥调谐”中心

对话框“即，MW频率与谐振腔的谐振频率一致。

e。根据瞬态章动实验确定的超长泵脉冲长度可能表明液氮在低温恒温器中凝结。见注6和7c。

10. PELDOR测量的大致持续时间如下所示：

持续时间=SRT PCm hndim5

利用放炮重复时间SRT、相位循环步数PC（通常为2）、核调制平均步数m（通常为8）、每点放炮次数h、累积扫描次数n以及记录道dim5上记录的点数。

11. 除了常用的去辐射分析软件将PELDOR时间轨迹转换成距离分布外，还出版了进一步的程序。下面给出了其中的一个选择：

鹿栏á布雷加斯Ibáñez等人，2020年）

远距离（Altenbach，C。；https://sites.google.com/site/altenbach/labview-programs/eprprograms/long-distances)GLADD/DD（Brandon等人，2012年）

DIPFIT（Steinhoff等人，1997）

食谱

1DEPC净化水

将0.1-0.2 ml DEPC加入100 ml Milli-Q水中，在通风柜中培养过夜

由于二氧化碳的形成，瓶子不应该紧闭

最后，对溶液进行高压灭菌以去除剩余的DEPC

致谢

感谢波恩大学（TRA-2）和DFG（Reinhart Koselleck grant，Projektnummer 420322655）的资助。

该协议基于以下原始研究论文：

Wuebben，C.，Vicino，M。F.，穆勒，M。和希曼，O(2020). 胍Ⅱ核糖开关的P1和P2发夹相互作用吗？核酸研究48（18）：10518-10526。

Wuebben，C.，Blume，S.，Abdullin，D.，Brajtenbach，D.，Haege，F.，Kath Schorr，S。和希曼，O(2019). 用Gem二乙基异吲哚啉自旋标记RNA的定点自旋标记：PELDOR、弛豫和还原稳定性。分子24（24）：4882。

Kerzhner，M.，Matsuoka，H.，Wuebben，C.，Famulok，M。和希曼，O(2018). 电子顺磁共振波谱中长rna的高产率自旋标记。生物化学57（20）：

2923-2931.

相互竞争的利益相互竞争的利益

没有相互竞争的利益需要申报。

参考文献

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