材料和试剂

陪替氏d杂交，可堆叠盖子，100毫米× 15毫米，无菌，聚苯乙烯（FISHERBRAND ，Fisher Scientific公司，目录号：FB0875713）
粪便标本收集杯，650 ml （Fisherbrand ，座厕标本收集系统，目录号：23-038032）
1.5 ml微量离心管（Fisherbrand ，Fisher Scientif ic，目录号05-408-130）
可调0.5- 10微升p ipette仪（Eppendorf研究，目录号：EPPR4402）
10个微升p ipette提示，- [R ACKED，小号terile（托马斯科学，目录号：1148U48）
琼脂，b acteriological摹RADE（研究产品国际，CAS号：9002-18-0）
钠Ç hloride（费舍尔化工，Fisher Scientific公司，CAS编号：7647-14-5）
胰蛋白,，经过微生物测试（Sigma-Aldrich，CAS编号：91079-40-2）
酵母提取物（Acumedia ，Neogen Corporation，目录号：7184B）
蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，目录号：15230001）
琼脂LB p鲈（见食谱）
注意：所有材料和试剂均在室温下保存。

设备

Epson Expression 1600扫描仪（Epson，Expression 1600，目录号：E1600-PRO）
孵化器（Thermo Scientific，NAPCO Series 8000DH孵化器，目录号：3541）
-80°C冰箱（Thermo Fisher Scientific，Revco ExF ，目录号：EXF40086D）
高压灭菌器（Amsco Scientific ，Eagle，目录号：SV120）
加热板（Thermolyne ，Cima rec ，目录号：HP131225）
生物^ h OOD（赛飞世尔科技，1300系列II类，生物安全柜，目录号：1353）

软件

ImageJ的版本1.59e（研究所小号健康，https://imagej.nih.gov/ij/download.html）

程序

准备的一个GAR LB p与拉泰什一个的0.4％最终浓度的琼脂（参见食谱）。

从删除粪便样品的冰箱
在2015年（根据IRB＃2009-446和2015-4465协议）从没有肠道困扰的健康捐献者和已知患有肠道炎症的捐献者中获得了新鲜的人类粪便样品。标本收集在不含防腐剂的无菌粪便标本杯中。然后样品保持在4℃下进行最多15分钟，运输前，实验室在环境温度下处理，其中由等分的所述样品置于一个100-微升在-80微量和存储℃下自2015。
删除了从粪便样品的冰箱，并允许在室温解冻彩画TURE在板凳上。
下一个生物罩，使用一个移液管来接种7.5微升在板的一侧（作为对照）和7.5健康样品微升疾病在板的另一半样品。
注意：如果样品未预先均质化，则最好使用均质器进行均质化以确保均匀性。

小心避免刺破的琼脂的吸管尖端，因为这可能会妨碍对确定今后的群聚能力。
离开所述的罩F中的P ETRI培养皿中并允许下干燥一个生物罩10分钟。

孵化
（ø ptional）一旦医生Ý ，取在板的n个图像的扫描仪，其将作为“前图像”以供以后参考。参见下面的图1A。
放置在在板直立（未反相）的培养箱中，设定为37℃和80％的湿度。
除去的从板的24小时后培养箱并目视评估蜂拥的存在。
（ø ptional）扫描的所述板和标签为“后的图像的图像”用于记录保存。参见下面的图1B。
（ø ptional）输入的之前和之后的图像到所述NIH的ImageJ的程序定量测定膨胀的褶皱。使用“自由选择”工具来凸显一个在“图像前区” ，牛逼母鸡突出“的形象后，蜂拥的区域” 。此方法允许生长的像素的测量并且使孔定量吨即使当在蜂拥不规则的方向发生通货膨胀。

图1.孵育前后，LB a gar平板上的细菌群。一。7.5微升粪便样品小号被接种到20毫升0.4％LB琼脂平板上，其然后被扫描。乙。板置于一个保温箱，设定为37℃和80％的湿度，并取出并扫描在24小时后。

数据分析

的琼脂浓度0.4％，发现引起最群聚（比较用琼脂精矿的0.5％，0.6％，和0.7％ations），作为是样品体积7.5微升（比较用2.5体积微升或5.0微升）。同时，发现样品的解冻方法（在冰上或在室温下）对成群的存在没有显着影响。这些结论来自对6个独立患者样本的10个独立实验（一式两份）的统计分析。在GraphPad Prism（v8）中执行单向ANOVA，以确定琼脂和接种物体积条件之间的显着差异s 。

菜谱

琼脂LB p乳胶
1克胰蛋白Try

0.5克酵母ë XTRACT

0.5克氯化钠

0.4克琼脂

100毫升dH 2 O

结合的水和干成分而上搅拌一热板上，直到所述水开始沸腾，然后高压灭菌消毒（121 ℃，15 PSI，65分钟）
高压灭菌后，允许将0.4％LB一个GAR溶液冷却至温热到的触摸，搅拌连续吨ö防止结块或硬化
倾20毫升0.4％LB一个GAR小号olution到无菌P ETRI菜ES
允许LB一个GAR板以冷却并硬化于所述在RT长椅为至少一个H

致谢

研究从克罗恩病和美国结肠炎基金会（CCFA）＃下一个学生研究奖学金奖进行了640806授予AB ，以及＃431602颁发给SM 。数据采集也部分受支持的广泛的医学研究发展计划（BMRP）摹咆哮＃362520在CCFA到SM作者竟被d要感谢Arpan德和豪礼为他们出谋划策，为变量的建议探索，并与格式帮助和编辑。该协议从工作由我们集团，完成修改发表在2021年三月消化科（德等人。，2021）https://doi.org/10.1053/j.gastro.2021.03.017。

利益争夺

作者们没有竞争利益小号或财务披露报告。

伦理

所有描述的方案均已获得阿尔伯特·爱因斯坦医学院学院机构审查委员会的批准（IRB＃2009-446和2015-4465）。获得粪便样本的人类受试者给予了知情同意。

参考

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