材料和试剂

1.的Eppendorf吨ubes1.5毫升（热Fisher Scientific公司，目录号：69715）

2.的Eppendorf吨ubes0.5毫升仪（Eppendorf，目录号：0030121023）

3. Greiner Bio-One 50毫升试管

4.移液器技巧

5.根据Apponyi等制备的S30裂解物。（2008年）

6. rNTP （Sigma-Aldrich，目录号：A6559，C8552，G3776，U1006）

7. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：15630106）

8.亚叶酸（西格玛奥德里奇，目录号：47612）

9. cAMP（Sigma-Aldrich，目录号：A6885）

10. NH 4 OAc（西格玛奥德里奇，目录号：A1542）

11. ATP（西格玛奥德里奇，目录号：A1852）

12.肌酸p hosphate（Sigma-Aldrich公司，目录号：27920）

13.谷氨酸钾（西格玛奥德里奇，目录号：G1501）

14.肌酸ķ inase（Sigma-Aldrich公司，目录号：C9983）

15. Mg（OAc ）2 （Sigma-Aldrich，目录号：M5661）

16. tRNA（西格玛奥德里奇，目录号：R8759）

17.二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）

18.降低的L-谷胱甘肽（GSH）（Sigma-Aldrich，目录号：G4251）

19. L-谷胱甘肽oxidis ED （GSSG）（Sigma-Aldrich公司，目录号：G4376）

20. 20个氨基酸（Sigma-Aldrich）

21.万MWCO蛇皮®透析膜（热Fisher Scientific公司，目录号：88243）。请注意，选择的膜截面积至少要比预期的蛋白质产品小三倍

22. NuPAGE TM 4-12％Bis-Tris蛋白凝胶（Invitrogen ，目录号：NP0323PK2 ）或任何适用于检测目标蛋白的SDS-PAGE凝胶

23. MES缓冲液（Invitrogen ，目录考勤号：NP0002）或其它相容的缓冲液为运行SDS-PAGE凝胶

24. NuPAGE TM LDS样品缓冲液（4 × ）（Thermo Fisher Scientific，目录号：NP0007）

25. PBS（Sigma-Aldrich，目录号：P4417）

26.尿素（西格玛奥德里奇，目录号：U5378）

27.重组二硫键异构酶DsbC （注2）

28.质粒或PC ř -a米p升ifie d FR agmen吨编码感兴趣的蛋白（注3）

设备

小号在分子生物学和蛋白质的实验室，如吸管，冰箱常用TANDARD实验室设备，磁力搅拌器没有被包括在内。也可以使用具有与以下所列规格相似的规格的设备。

解剖刀
NanoDrop TM紫外可见分光光度计（Thermo Fisher Scientific，目录号：ND-2000 ）
本生灯
保温箱（Eppendorf ，型号：Innova 44 ；M1282-0002）
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS- P AGE）装置（赛默飞世科学，目录号：A25977 ）

软件

微软Excel

程序

无细胞（在体外）的蛋白质合成

无细胞反应包括将S30裂解物与DNA构建体孵育，在组成型启动子下编码目标基因，以及透析条件下必需的辅因子。有关DNA构建体的更多详细信息，请参见注释3。

当测试新构建体的无细胞表达时，可以通过在透析中以总内部体积为50μl，外部体积为500μl进行小规模的无细胞反应来最大程度地减少试剂的使用（图2）。图2说明了我们在我们的实验室，但其他透析组使用了设置小号都可以使用。对于大多数蛋白质，反应体积为50 µl，应提供足够的样品，以便在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）凝胶上运行，以确认目标蛋白在不同反应条件下的表达及其相对产率。

为了产生更大量的蛋白质，所述内和外体积S可根据增加LY 。我们的大规模生产通常具有的内部容积1毫升和一个外部体积的10毫升与每个1毫升反应产生〜0.5 - 2毫克一个的疏水蛋白。

为了使无细胞反应易于复制和缩放，请按照表1和表2的混合物准备必要的试剂，并在-80°C下保存。以下方案显示了表3中所述的内部反应体积为50 µl和外部反应体积为500 µl的小规模无细胞反应。表4给出了可能需要根据目标蛋白质进行优化的组分的浓度范围。可下载交互式Excel电子表格，该电子表格可帮助计算反应设置中使用的试剂（注1）。

图2.流程图说明了小规模无细胞反应的建立。的削减线表示透析膜的位置。

试剂混合物的制备
根据以下步骤A 2至A 4 ，将20种氨基酸的3种混合物准备在冰上的3个单独试管中。
添加的氨基酸（Ala，精氨酸，甘氨酸，组氨酸，赖氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸）和溶解的MilliQ水，使水溶性氨基酸股票小号。
添加的氨基酸（天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，亮氨酸，蛋氨酸，色氨酸，酪氨酸）和1M的盐酸溶解，使可溶于酸的氨基酸股票小号。
添加的氨基酸（异亮氨酸，苯丙氨酸）和在1M KOH溶解，使碱溶性氨基酸股票小号。
混合表1中列出的3种成分，使总氨基酸混合物与每种氨基酸的最终浓度为15 mM。

表1.用于50 µl内部反应的氨基酸混合物的制备

组件

库存浓度

最终集中

体积

水溶性氨基酸储备

50毫米

15毫米

12微升

酸溶性氨基酸储备

50毫米

15毫米

12微升

基础可溶性氨基酸储备

50毫米

15毫米

12微升

MilliQ水

--

--

最多填充40 µl

混合所有成分中列出。表2在冰上制备用于10 ×预混合。

表2.用于50 µl内部反应的10 ×预混合物的制备

成分

库存浓度

反应终浓度（1 × ）

最终浓度（10 × ）

体积

NTP

25毫米

0.8毫米

8毫米

19.2微升

pH 7.58的HEPES

2 M

55毫米

550毫米

16.5微升

甲酰四氢酸

10毫米

68微米

680微米

4.08微升

营

100毫米

0.64毫米

6.4毫米

3.84微升

NH 4 OAc

10 M

27.5毫米

275毫米

1.65微升

MilliQ水

--

--

--

最多填充60 µl

氨基酸混合物和10 ×预混合物可以在-80°C下保存以备后用。

制备内部和外部反应预混合物
解冻的氨基酸混合物和所述10 ×在冰上预混合。
将内部反应预混料的成分添加到新管中，将外部反应预混料的成分添加到另一管中（表3）。

表3.用于50 µl内部反应的内部和外部反应预混合物的制备

成分

库存浓度

内部反应终浓度

内部预混液（50 µl ）

外部反应终浓度

外部预混液（500 µl ）

10 ×预混

10 ×

1 ×

5微升

1 ×

50微升

磷酸肌酸

1 M

80毫米

4微升

80毫米

40微升

氨基酸混合物

15毫米

1毫米

3.3微升

1毫米

33.33微升

钾摹lutamate

400万

208毫米

2.6微升

208毫米

26微升

肌酸激酶

10毫克/毫升

250微克/毫升

1.25微升

--

--

镁（OAc ）2

1 M

15毫米

0.75微升

19.3毫米

9.65微升

三磷酸腺苷

100毫米

1.2毫米

0.6微升

1.2毫米

6微升

核糖核酸

17.5毫克/毫升

0.175毫克/毫升

0.5微升

--

--

全部的

--

--

18微升

164.98微升

设置反应装置时，将混合物保持在冰上。

无细胞反应装置的设置
将内部反应的成分添加到试管中（表4）。

表4.用于50 µl内部反应的透析设置中的无细胞反应设置（使用提供的Excel计算器并根据需要输入其他体积）

成分

库存浓度

内部反应终浓度

内部容积

外部反应终浓度

外卷

反应预混料

--

--

18微升

--

164.65微升

S30裂解液

--

30％（v / v）

15微升

--

--

DTT一

100毫米

1.7毫米

0.85微升

1.7毫米

8.5微升

GSH b

10毫米

1毫米

5微升

1毫米

50微升

GSSG c

5毫米

0.1毫米

1微升

0.1毫米

10微升

DNA d

300 ng /微升

6 ng /微升

1微升

--

--

DsbC的è

10毫克/毫升

0.3毫克/毫升

1.5微升

0.3毫克/毫升

15微升

MilliQ水

最多填充50 µl

填充量最大为500 µl

一个DTT（0.1 - 1.7毫摩尔）

b GSH （0.1 - 1毫米）

Ç GSSG （0.1 - 0.1毫米）

d DNA（0.3 - 6纳克/微升）

È的DsbC （0.1 - 1.7毫米）

A- ê可以被改变以满足目标蛋白质的需求

将外部反应的成分添加到另一个管中（表4）。
在添加DTT，GSH，GSSG之前，将外部反应缓冲液的pH调节至7.5 。
加入二硫键异构酶C （DsbC ）（注2）。
将设备设置为进行小规模（图3）或大规模无细胞反应。

图3.准备一个自定义的微透析按钮。一。加热手术刀（例如，使用本生灯），将试管的尖端切成薄片，并用剪刀剪下盖子。乙。将内部反应混合物加到盖子上，盖上一小块透析膜。Ç 。用切开的塑料管将透析膜密封在盖子上，其方向与标准管的闭合方向相同。确保膜是在地方安全地与周围的盖多余的透析膜中所有可见。d 。将外部反应混合物添加到直径略大于微透析按钮的收集管中。将微透析按钮放在该管内。

对于小规模的反应，请切成0.45 ml PCR管的盖子，制成微透析按钮。
放置在平坦的表面上的盖子倒置和DD 50 μ升的的内反应混合物（或任何其它期望的体积适合）到盖子。
W¯¯等万MWCO一小片蛇皮®透析膜水，DAB掉多余的水用纸巾和楔形膜盖之间的切管。
将外部反应混合物添加到试管中，并将微透析按钮置于内部，并使膜暴露于外部反应混合物。
孵育4无细胞反应-在30℃下20小时和180rpm下在振荡培养箱它编带在支架。

蛋白质表达的初步分析
一旦反应已经完成，REM OVE透析按钮和DAB干。然后用移液器尖端小心地刺穿膜，将移液器柱塞压下至第一个停止点，然后吸出内部反应混合物以进行下游分析。
通过离心（20,000 ×g ，10分钟，4°C）澄清反应混合物，分离可溶性和不溶性馏分，并分装适当量的SDS-PAGE分析。
对于20 µl SDS-PAGE凝胶样品，取10 µl澄清的可溶级分，加入10 µl 1 × PBS，取不溶级分，并用20 µl 1 M尿素稀释。
从4 × LDS储备液中添加1 × LDS缓冲液到凝胶样品中，并在80°C加热10分钟。
在200 V下运行SDS-PAGE分析20分钟，并根据制造商的规程染色。

表达蛋白的纯化
这将根据目标蛋白质以及是否存在亲和标签而有所不同。对于实验室中产生的疏水蛋白，我们使用镍-NTA亲和色谱（IMAC），然后在需要时裂解并去除六组氨酸标签，然后反相高压液相色谱（rpHPLC ）。标记的氨基酸（例如，用15 N）可以规避在某些应用蛋白质纯化的需要（例如，以检查使用蛋白质构象1 H- 15 ñNMR光谱法），其可导致大量的时间节省。

纯化蛋白的分析
纯化蛋白质的分析（包括测量其产率）将根据目标蛋白质的具体特征以及可用的设备而有所不同。几种技术如凝胶光密度，布拉德福德分析或UV-Vis光谱，可以利用来测量纯化的蛋白质的产率。一个一个ctivity测定法（例如，酶活性测定）对于感兴趣的蛋白质应该进行（如果可用）来评估，如果所产生的蛋白质是功能性的。使用我们感兴趣的蛋白质，我们使用SDS-PAGE检查蛋白质的纯度，通过使用NanoDrop TM测量纯化的蛋白质溶液在280 nm处的吸光度来计算疏水蛋白的收率，通过NMR光谱确认正确的折叠，确认该蛋白质可通过质谱法与计算质量相匹配，并使用硫黄素-T分析验证其组装能力。

笔记

可以下载交互式无细胞反应设置计算器。在左侧，该反应显示为小规模的无细胞反应，其中50-μ升内体积的反应。这些值在反应设置计算器的右侧使用。任何期望的内反应体积可以一起输入的反应的数量和所需的v olumes将被计算。氧化还原添加剂（DTT，GSH的所需的浓度：GSSG ，DsbC的）和DNA的浓度可根据需要进行调整（见表4为表明编范围）。
如Matsuda等所述，表达和纯化DsbC 。（2013 ）并透析入磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并储存在4°C直至使用。我们使用的构建体是从Kigawa实验室获得的。
选择一个质粒是非常重要的是所有Ø WS的利弊牛逼它utiv é亲TEIN é XPR é SSIO ñ ，即，没有lac操纵。我们用质粒是吨他的pET -MCSIII作为本VECT ö ř ħ作为被报道为成功小号一些蛋白质的ynthesis在无细胞合成方案。但是，我们相信，只要可以实现组成性蛋白表达，任何重组蛋白表达载体均可与该方案一起使用。如果现有的重组蛋白表达载体具有lac操纵子，我们建议将其删除以提高产量。代替质粒DNA，也可以在该设置中使用PCR扩增的DNA（Neylon等，2000 ；Wu等，2007 ）。
如果需要生产带有选择性标记氨基酸的蛋白质，只需在选择氨基酸时将步骤A2，A 3和/或A 4中使用的未标记氨基酸替换为所选的标记氨基酸即可。氨基酸混合物（表1）。

致谢

此项目得到了澳大利亚研究委员会授予AHK的探索项目资助DP200102463的支持

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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