材料和试剂

带PTFE螺帽的螺口玻璃小瓶（Spectrum Chemical，目录号：985-92215）
比色杯旋转杆（VWR，货号：58949-030）
石英UV比色皿（Fireflysci ，目录号：1FLUV10）
515 nm滤光片（Andover Corporation，目录号：515FG05-50S）
1 ml注射器（BD，货号：309659）
9英寸巴斯德吸管（Fisher Scientific，产品目录号13-678-6b）
Saint-Gobain Tygon管（Saint-Gobain，目录号：ACF00017F）
玻璃管架（Fisher Scientific，目录号：K7492100100）
的HiTrap ®脱盐柱（Millipore公司-Sigma，目录号：GE17-1408-01）
凝胶上样移液器吸头（Fisherbrand ，目录号02-707-139 ）
10毫米滤镜支架（Avanti Polar Lipids，货号：610014）
0.2 µm膜（Whatman，目录号：800281）
铝箔（Fisherbrand ，目录号01-213-100）
1 ml样品定量环（Thermo Scientific，目录号：03-052-382）
氯仿（Fisher C hemical，目录号：c298）
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）（Avanti极性脂质，目录号：850375）
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[（N-（5-氨基-1-羧基戊基）亚氨基二乙酸）琥珀酰]（镍盐）（18：1 DGS-NTA（Ni）（Avanti极性脂质，目录编号：790404）
1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸-（1'-rac-甘油）（钠盐）（POPG）（Avanti极性脂质，目录号：840457）
1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）（Avanti极性脂质，目录号：850457）
乙醇（Fisher Chemical，目录号：a4094）
HPLC级水（Fisher Chemical，目录号：W5-4）
Tris-base（Fisher Chemical，目录号：BP152）
氯化钠（Fisher Chemical，目录号：BP358）
氢氧化钠（Fisher Chemical，目录号：S318）
盐酸（Fluka ，目录号：7647）
干冰
4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸，N-（2-羟乙基）哌嗪-N'-（2-乙磺酸）（HEPES）（Fisher B代理试剂，目录号：BP310）
8-氨基萘-1,3,6-三磺酸二钠盐（Setareh Biotech，目录号：6951）
对二甲苯二溴化吡啶鎓（DPX）（Setareh Biotech，目录号：6271）
Triton X - 100 （Sigma-Aldrich，目录号：X100）
醋酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2889）
甲醇（Fisher，目录号：A453-500）
凝胶过滤缓冲液（请参阅食谱）
pH 4缓冲液（请参见配方）

设备

玻璃管（VWR，货号：89000-502 ）
50毫升烧杯（派热克斯（Pyrex），货号：02-540G）
实验室安装架（Humboldt MFG Company，目录号：H-21217）
氮气储气罐
气罐调节器（VWR，目录号：55850-277）
大型顶部干燥器（Corning Life Sciences，目录号：CLS3120250）
热板/搅拌器（Thermo Fisher Scientific，目录号：SP131325）
带有加热块的挤出机套件（Avanti Polar Lipids，目录号：610000）
pH计（梅特勒-托利多（Mettler Toledo），目录号：30266626）
涡流（VWR，货号：58816-121）
秤（梅特勒-托利多，目录号：ML54）
AKTA FPLC系统（通用电气，目录号：UPC-900和P920）
荧光计（ISS，目录号：K2）
水浴（VWR，目录号：13271-086）

程序

干燥磷脂
如果使用脂质粉，请创建脂质储备液。
用螺帽将50-150 mg的脂质测量到玻璃小瓶中。
根据需要添加5-15毫升3：2氯仿：甲醇，以将浓度保持在10毫克/毫升，以便于使用。
注意：用衬有PTFE的盖子盖住样品瓶；否则，氯仿可能会溶解塑料并污染样品。

在玻璃管中测量适当量的脂质（10 mg足以进行约30个反应）。
注意：脂质体可以由单一的脂质形式小号[例如，1,2- Dioleoyl- SN -glycero -3-磷酸胆碱（DOPC），1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸（1 “-rac甘油）（钠盐）（POPG），和1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）]或它们的组合。例如，Ni 2+螯合脂质，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[（N-（5-氨基-1-羧基戊基）亚氨基二乙酸）琥珀酰]（镍盐）或（DGS-NTA （Ni）），可以将带有His标签的蛋白质附着到膜上（Sun等，2007和2008； Jacquez等，2014）。为测量EsxAB的MPA而开发的新型脂质体由POPC与POPG组成，摩尔比为4：1。

使用钳座将小瓶固定到位。
使用第二个夹具，将Pasteur移液器放置在距离试管中液体约2-5 mm的位置。
连接的管道巴斯德移液管端，打开阀门，让柔和的气流中。
从小瓶中蒸发出氯仿，直到看不到液体为止。
从支架上取下样品瓶，并将其放在室温下的真空室内至少3小时或过夜。
将干脂质储存在-20 ℃。在这些条件下，脂质最多可以保存一个月。

准备色谱柱和FPLC进行脱盐
1.需要5毫升的脱盐柱以去除多余的ANTS / DPX和交换缓冲液。如有必要，可以串联连接两个脱盐柱，以提高脱盐效果。

2.通行证至少5倍柱体积（CV）或，在这种情况下，通过该柱50ml的水，以除去所述乙醇从该柱。

3.使至少5 CV （50 ml ）的凝胶过滤缓冲液通过色谱柱。

4.使机器以5毫升/分钟的速度通入50毫升水，以准备进行脱盐处理。

5.以5 ml / min的速度使50 ml的凝胶过滤缓冲液通过机器。

6.将色谱柱连接到机器上，并通过100 ml的凝胶过滤缓冲液。

7.注入1 ml的凝胶过滤缓冲液清洁注入阀。

8.重复步骤B 7至少两次。

Prepar荷兰国际集团的脂质蚂蚁/ DPX解决方案
通过向> 95％的乙醇中添加干冰，在烧杯中制备冷冻溶液。冷冻溶液用于使包含ANTS / DPX的脂质快速冷冻。可替代地，液体可以使用氮气，以闪烁冻结。理想的是将冷冻溶液保持在-50 °C以下。
用温水装满另一个烧杯，以解冻脂质。
将脂质重悬于5 mM HEPES （pH 7.4 ）中，每10 mg脂质中应含1 ml脂质。
涡旋直至溶液完全悬浮。
测量该溶液的体积，并添加ANTS和DPX 50mM的到管中。
上下吹打混合，并用铝箔覆盖管。
将试管放入冷冻溶液中，使其冷冻。
将试管移入温水中以解冻脂质。
重复步骤C7-C8进行五个以上的冻结/解冻循环。
注：六˚F reeze /解冻循环是通常足以溶解脂肪。如果在挤出过程中出现问题，例如使液体无法通过膜的困难，请执行更多的冷冻/解冻循环。

通过挤出生产脂质体
组装的根据挤出机的制造商的规格。
制定1毫升的凝胶过滤缓冲液使用的注射器中的一个，并通过挤出机通过缓冲，直到液体被转移到其他注射器。
注意：您可能会感到一点阻力。我f无阻力，所以能够在膜已经在装配过程中移动或已经撕裂。

除去的从注射器缓冲器。
制定到1毫升脂质体到一个注射器的。
通过膜传递的脂质体，直到液体已经从一个针筒转移到另一个。
重复小号TEP D5 ，总共20次。
挤出后检查流体；它应该从改变一个不透明到透明的，黄色的色彩的液体（图1）。

图1的比较的前和挤出后的脂质溶液。一。挤出之前的脂质溶液具有不透明的颜色。乙。挤出后脂质溶液变得更透明。

将脂质分配到干净的玻璃管中。

通过脱盐色谱去除多余的荧光染料
在对柱子和机器进行预平衡并清洗进样环后，将脂质体注入进样环。
运行脱盐程序以0.5ml /分钟的流速，使用凝胶过滤缓冲液，并收集0.5每馏分毫升。
允许50 ml缓冲液通过色谱柱。
脂质体将柱洗脱出来后约2mL公顷VE通过。
通常在六个试管中收集含有脂质体的级分，以收集总计3 ml的脂质体（图2）。

图2.大多数流动大约2毫升缓冲液后的脂质将洗脱通过该柱。使用该程序，预期的典型产量为3 ml。蓝线表示mAu ，棕线表示电导。

合并所有脂质体样品，盖上铝箔，并在4°C下保存。
在这一阶段的脂质体可以存储约1-3周。
用这种方法制备的脂质体的浓度通常是一致的。但是，每个生物复制都需要使用具有相同批次脂质的技术复制来获得一致的结果。
通过使至少5CV的清洁柱+ 30毫升（该体积的机器）的水通过该机器。
通过至少五个CV除了30毫升20％乙醇的第ř ough机器为列存储。

脂质体泄漏测定
Ť脂质体的质量他应测试b安伏ANALY懋目的蛋白质中加入2％（V / V）Ť瑞通X - 100，其完全裂解脂质体，迅速揭示一个强荧光信号。
将荧光计的激发设置为350 nm，并记录520 nm的发射，并以1秒的间隔继续测量5-10分钟。
Ç罗斯两极分化RS在所施加的激发和发射路径，以减少背景。我˚F必要，应用515nm的长-pass滤波器在发射路径，以减少背景散射。
如果可用，水浴连接到水入口和出口的样品室的维持一个恒定的温度。这是与蛋白质，在相互作用是特别重要的生理温度，因为是与壳体EsxAB 。
向紫外线比色杯中，加入1.15 ml凝胶过滤缓冲液，150 µl 1 M NaAc缓冲液（pH 4）和100 µl脂质体。
将样品比色杯放入样品室中，然后合上盖子。
一个后pproximately 30秒，使用凝胶加样枪头注入100微升的2％Ť瑞通X - 100通过在盖盖在孔到试管。ANTS荧光应增加至少5倍（图3）。这将起到积极的控制作用。
荧光我ntensity将一个或两个第二次下降，由于试管内混合稀释，但它会开始后不久上涨。
阴性对照由小号样品的制备与脂质体和凝胶过滤缓冲液中。
通过测试溶细胞蛋白继续进行实验；制备的反应杯在小号TEP ˚F 5（图3）。

图3.原始情节小号的一个ANTS / DPX测定。背景荧光强度约为100,000个单位。加入2％T riton X -100后，荧光强度增加了5倍。随着EsxA ，已知的蛋白质具有MPA ，我们观察到逐渐增加的荧光。EsxB ，没有蛋白质MPA ，也不会增加荧光强度。自由以下组成的阴性对照的只凝胶过滤缓冲液并不能增加荧光强度。

将紫外线比色皿放入样品室中，然后盖上盖子。
经过约30秒，使用凝胶加样枪头添加100 μ蛋白的升中的比色皿TE 。
P rotein Ç oncentrations可以变化，但一共有100微克的是通常在我们的实验中使用。
根据实验的性质，可以将蛋白质而不是pH 4缓冲液加载到比色杯中。然后，在30秒钟后，添加pH 4缓冲液将导致EsxAB裂解膜。

数据一nalysis

通过从所有其他值中减去最低强度值，除去背景荧光，在添加蛋白质的时间点对荧光强度进行标准化。
最低强度值现在被视为测量在T = 0 ，并且在T的所有值= 0直到的端部的试验的平均，所有重复。
通过添加样品来稀释脂质会导致荧光的少量下降。中号从添加了蛋白质的瞬间easuring允许determin的通货膨胀的荧光的增加为脂质体裂解。

平均强度作图针对该时间获得的曲线（图4甲）。
该p lateau接着是一个-相关联也可以被用来获得的缔合常数。

每个样品的最高荧光强度值的平均值以条形图绘制（图4B）。

图4 。标准化后的样品脂质体实验图。一。数据进行归一化，以除去背景荧光和以考虑了在荧光下降引起的稀释的由脂质体的样品。乙。用表示标准偏差的误差线对荧光峰进行绘图。统计意义也显示在这里。

使用Shapiro-Wilk检验测试这些值的正态性。
如果数据与正常值不同，则使用单向方差分析对其进行显着性检验。否则，执行Tukey-Kramer测试。

菜谱

凝胶过滤缓冲液
20 mM Tris，pH 7.4

10毫米氯化钠

pH 4缓冲液
1 M NaAC ，pH 4.01

致谢

钍是研究是由赠款NIGMS（SC1GM095475到J.日），国家研究资源中心（5G12RR008124）的支持，以及对少数民族健康与健康差距（G12MD007592）研究所。哈维尔·阿奎莱拉（Javier Aguilera）由美国国立卫生研究院（R25GM069621授予R. Aguilera）通过RISE计划为研究生提供了支持。内容仅由作者承担，并不一定代表美国国立卫生研究院的正式观点。

该协议改编自Nieva等人。，1989（DOI：10.1021 / bi00444a032）并针对EsxA / EsxB复合体进行了优化。

竞争我nterests

作者没有竞争利益要声明。

参考

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