材料和试剂

1.冷冻保存管（热小号系统求解，目录号：374081）

2. Poly-Prep色谱柱（Bio-Rad，目录号：7311550）

3. Econo- Pac色谱柱（Bio-Rad，目录号：7321010）

4. SnakeSkin透析管（Thermo Fisher Scientific，目录号：68700）

5. SnakeSkin透析夹（Thermo Fisher Scientific，目录号：68011）

6.大号订书钉2英寸装订夹（订书钉，货号：10669）

7. 5毫升血清移液管（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-678-11D）

8. 10毫升血清移液管（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-678-11E）

9. 50 ml猎鹰管（Cell star，目录号：22761）

10.精密加蛋白万花筒500米升（Bio-Rad公司，目录号：161-0375）

11.任何kD的迷你-PROTEAN TGX染色免费蛋白凝胶，12 -好，20 μ升（Bio-Rad公司，目录号：4568125）

12. 2 × Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad，目录号：1610737）

13.用于微型预制凝胶的Mini-PROTEAN Tetra垂直电泳池，2凝胶（Bio-Rad，目录号：1658005）

14. 2-巯基乙醇，10μM升（Sigma-Aldrich公司，目录号：M6250）

15.考马斯亮蓝R-250染料（热˚F isher科学，Ç atalog号码：20278）

16. Expi293表达系统套件（Thermo Fisher Scientific，目录号：A14635）

注意：将细胞储存在2 °C至8°C的液氮和其他试剂中。

17.雾先生（热小号系统求解，目录号：5100-0001）

18.Ni -NTA琼脂糖（QIAGEN，目录号：30230）。储存在2 °C至8°C

19. DMSO （Millipore Sigma，目录号：41640）

20. Opti-MEM培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：11-058-021）

21. Tris （MP，目录号：103133）

22. NaCl （Fisher，目录号：S271-10 ）

23.甘油（VWR，目录号：BHD 1172-1LP ）

24.蔗糖（Fisher，目录号：BP-220-1 ）

25.咪唑（Thermo Fisher Scientific，目录号：03196-500）

26.液氮（电弧气体）

27.纯化缓冲液（请参阅食谱）

28.洗脱缓冲液（请参见配方）

29.透析缓冲液（请参见配方）

30.用于SDS PAGE的染色缓冲液（请参见配方）

31.用于SDS PAGE的去污缓冲液（请参阅食谱）

设备

Fisherbrand摇瓶，平底，通风孔（Thermo Fisher Scientific，目录号：PBV12-5）。室温保存
4 L烧杯（Thermo Fisher Scientific，目录号：02-555-25K）
FORMA免缝-CYCLE I160 CO 2培养箱中（热Fisher Scientific公司，FORMA，目录号：51030301 ）
防CO 2摇床（Thermo Fisher Scientific，目录号：88881101 ）
生物安全柜（Labguard ，II类，A2型）
精密水浴箱GP 15D–5 L和10 L（Thermo Scientific，目录号：TSGP15D）
磁力搅拌棒（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-512-136）
离心机（Sorvall ，型号：RC-5B）
离心机（Eppendorf ，型号：5810 R）
离心机（Thermo ，型号：Sorvall Legend Micro 21R）
冰箱（Thermo Scientific Revco RLE60086A -86 °C）
低温杜瓦瓶（Cole Parmer）
迷你PROTEAN ®四垂直电泳槽的小型预制胶（Bio-Rad公司，目录编号：1658004）

程序

建立了换货Expi293细胞株（赛飞世尔科技）
从液氮中取出细胞等分试样。
马上用手解冻的细胞，并将它们在37 ℃水浴。一旦解冻，涡旋管轻轻而不完全浸没，直到仅一个冰残余的少量。
喷用70％乙醇的手和轻轻擦在转移到前细胞的小瓶以净化所述层流罩。
使用血清移液器将所有试管内容物转移到一个平底，通风的Fisherbrand摇瓶中，并用30 ml Expi293表达培养基预热。
在37°C ，相对湿度≥80％和8％CO 2的条件下孵育细胞。设定振荡速度于125 RPM下一个125毫升小号haker ˚F拉斯克。
当细胞密度达到1 × 10 6 -3 × 10 6细胞/ ml时传代细胞。
注意：这通常在解冻后4-6天发生。

进行到转染一次的细胞密度达到大约3 × 10 6 -5 × 10 6活细胞/ ml和细胞活力是≥95％。
注意：要冷冻保存细胞以备将来使用，请将细胞培养物生长至3 × 10 6 -5 × 10 6活细胞/ ml，并以300 × g离心5分钟。

弃去上清液，加入含10％DMSO的Expi293表达培养基，然后通过移液轻轻重悬细胞。
将细胞稀释至1 × 10 7活细胞/毫升，然后将1毫升等分试样吸取至冷冻保存管中，并用控制速率的冷冻设备在-80 ° C的冰箱中冷冻。24小时后，转移到低温杜瓦长-长期储存和日后使用。在转染前将细胞解冻后再培养两次，使其恢复培养。
注：对于一般的细胞维持，传代细胞以0.5 × 10 6个细胞/ ml，当他们到达的3的密度× 10 6 -5 × 10 6个细胞/ ml。不建议超过5 × 10 6细胞/ ml。

转染（30毫升）
共75个的稀释× 10 6细胞的3的最终密度× 10 6个细胞/ ml用25ml预热Expi293表达培养基在一个125毫升摇瓶中。
稀25 μ克于1.5ml的Opti-MEM培养基的RBD表达质粒DNA。
稀80微升的ExpiFectamine在1.4毫升的Opti-MEM培养基的293试剂。孵育所述在室温下的溶液5分钟。
将稀释的质粒DNA添加到含有ExpiFectamine 293试剂的溶液中，并在室温下孵育10-20分钟。在V olume应该约3μm升。
转移3米升的所述溶液加入到一个摇瓶，并培育的细胞在37℃下用≥80％相对湿度和8％CO 2 。
18到20 -两个ħ我们的小号转染后，加入150微升的ExpiFectamine 293转染增强器1和1.5毫升ExpiFectamine 293增强器2的摇瓶。转染后最多孵育5天。
注：该程序可以按比例高达比例较大的转小号。第5天的细胞活力应高于50％。

收获与透析
转移的细胞培养至50ml的Falcon管中并离心以3000 - 5000 ×克5分钟，在25 ° C（图1）。

图1.收集细胞培养物和上清液透析的示意图

转移的上清液到新的50ml Falcon管中，并保持它在冰上。
准备3 L的透析缓冲液。
约7-8英寸使用蛇皮透析管中，蛇皮透析剪辑传送30米升收获上清液到透析缓冲液中。
注意：转移上清液之前，用透析缓冲液对膜进行水合。

放置在密封的蛇皮管，并在4磁搅拌棒-大号烧杯中。
将烧杯放在磁力搅拌器上，并于4 °C过夜交换缓冲液。
传送缓冲器-交换上清液至50ml的Falcon管中。
注：在收割，有可能评估转染和蛋白表达的成功的亲和层析步骤之前，通过SDS-PAGE用的细胞培养物上清液（可选）。要执行此操作：

将50 µl 2 × Laemmli样品缓冲液与2-巯基乙醇和50 µl细胞培养上清液混合，然后在95°C下煮沸样品5分钟。
加载8-15 μ升的缩小样品到SDS-PAGE。
在Mini-PROTEAN Tetra垂直电泳池中以170 v运行样品35分钟，并按照制造商的规程对考马斯染色后的条带进行可视化。

固定金属亲和色谱
将0.5 ml的Ni-NTA树脂放入多制备色谱柱中，并以5 ml的纯化缓冲液以1 ml的增量进行平衡。关闭柱，重悬在1米树脂升纯化缓冲液中。
注：按比例调整需要较大的转染树脂的量小号。

转移的平衡树脂成一个50米升含有Falcon管的缓冲液更换上清液。
孵育与树脂的上清液上在4℃下1个小时在摇床上。
除去的从摇杆50毫升Falcon管并放置其上的支架。使树脂沉降20分钟。
将上清液转移到新的50 ml的Falcon管中，而不会干扰树脂。
将树脂直接转移到制备型色谱柱的床上。
通过移液至色谱柱壁上，以6 ml的纯化缓冲液以1 ml的增量洗涤树脂。
注：允许缓冲器到完全加入另一米之前流过柱升洗涤缓冲液中。

洗脱的加入200蛋白μ升洗脱缓冲液到塔壁，共7级分。
通过测量级分在280 nm处的吸光度来定量蛋白质。
通过在还原条件s下运行的SDS PAGE评估蛋白质纯度（图2）。

图2.纯化的尖峰RBD蛋白的SDS-PAGE分析

贮存
纯化的蛋白质可以在4°C下保存数周。为了长期保存，可以将蛋白质样品等分，在液氮中快速冷冻，然后保存在-80°C下。冷冻的蛋白质样品可以在使用前快速进行手动解冻。

菜谱

净化缓冲液
50 mM Tris pH 8

105毫米氯化钠

10％甘油

10％蔗糖

透析缓冲液
50 mM Tris-HCl，pH 8

100毫米氯化钠

洗脱缓冲液
50 mM Tris pH 8

105毫米氯化钠

10％甘油

10％蔗糖

300 mM咪唑

用于SDS PAGE的染色缓冲液（1 L）
500毫升去离子水

100毫升甲醇

100毫升冰醋酸

3克艳蓝

用于SDS PAGE的去污缓冲液（1 L）
500毫升去离子水

400毫升甲醇

100毫升冰醋酸

注意小号

编码SARS-CoV-1（318-514氨基酸，P59594），SARS-CoV-2（331-528氨基酸，QIS60558.1），OC43（329-613氨基酸，P36334.1）的RBD的密码子优化核苷酸序列GenBank中提供了HKU-1（310-611 aa，Q0ZME7.1），229E（295-433 aa，P15423.1）和NL63（480-617 aa，Q6Q1S2.1），登录号为MT649401，MT649402 ，MT649403，MT649404，MT649405和MT649406。编码上述蛋白质的基因被克隆到哺乳动物表达质粒pαH的KpnI和XhoI位点之间。作者也可以从质粒储存库（Addgene ）获得哺乳动物表达质粒。

致谢

这项工作由北卡罗来纳大学医学院和NCI U54 CA260543-01 （LP和AD）资助。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

参考

Grifoni ，A.，Weiskopf，D.，Ramirez，SI，Mateus，J.，Dan，JM，Moderbacher ，CR，Rawlings，SA，Sutherland，A.，Premkumar ，L.，Jadi，RS，Marrama ，D.， de Silva，AM，Frazier，A.，Carlin，AF，Greenbaum，JA，Peters，B.，Krammer ，F.，Smith，DM，Crotty，S. and Sette ，A. （2020年）。具有COVID-19疾病的人和未暴露个体对SARS-CoV-2冠状病毒的T细胞应答的靶标。单元格181（7）：1489-1501 e1415。
Mateus，J.，Grifoni ，A.，Tarke ，A.，Sidney，J.，Ramirez，SI，Dan，JM，Burger，ZC，Rawlings，SA，Smith，DM，Phillips，E.，Mallal ，S.， Lammers，M.，Rubiro ，P.，Quiambao，L.，Sutherland，A.，Yu，ED，da Silva Antunes，R.，Greenbaum，J.，Frazier，A.，Markmann ，AJ，Premkumar ，L. de Silva，A.，Peters，B.，Crotty，S.，Sette ，A.和Weiskopf，D.（2020）。未暴露人群中的选择性和交叉反应SARS-CoV-2 T细胞表位。科学370（6512）：89-94。
Premkumar ，L.，Segovia- Chumbez ，B.，Jadi，R.，Martinez，DR，Raut，R.，Markmann ，A.，Cornaby ，C.，Bartelt ，L.，Weiss，S.，Park，Y. ，爱德华兹，CE，韦默，E.，舍雷尔，EM，Rouphael ，N.，Edupuganti ，S.，WEISKOPF，D.，谢，LV，侯，YJ，马戈利斯，D.，泽塞特，A.，柯林斯，MH ，Schmitz，J.，Baric，RS和de Silva，AM（2020）。病毒刺突蛋白的受体结合结构域是SARS-CoV-2患者中抗体的免疫优势和高度特异性靶标。Sci Immunol 5（48）：eabc8513。
Puhl ，AC，Fritch，EJ，Lane，TR，Tse ，LV，Yount ，BL，萨克拉曼多，CQ，Fintelman -Rodrigues，N.，Tavella ，TA，Maranhao Costa，FT，Weston，S.，Logue，J.，弗里曼（Frieman M.），普伦库玛（Premkumar ），皮尔斯（Pearce），KH，赫斯特（Hurst），布莱克（Andrade），CH，李维（Levi），JA，约翰逊（Johnson），新泽西州（Kisthardt），SC，斯科尔（Scholle），F。，PB，马德里和Ekins，S.（2021年）。重新利用埃博拉和马尔堡病毒抑制剂Tilorone，Quinacrine和Pyronaridine：针对SARS-CoV-2的体外活性和潜在机制。ACS Omega 6（11）：7454-7468。