材料和试剂

48 -孔细胞培养板（ASi的碱Scientific公司，目录号：TP9048）
CellPro TM 70微米的细胞滤网（ASi的，隼® ，目录号：MT4070）
1 ml注射器（BD Tuberculin滑动吸头，目录号：9189520）
50 ml离心管（ASi ，目录号：C5602）
15 ml离心管（ASi ，目录号：C5600）
C57BL / 6J小鼠（杰克逊实验室，目录号：000664）
C57BL / 6- IL17a tm1Bcgen / J小鼠（The Jackson Laboratory，目录号：018472）
RBC裂解缓冲液10 × （Biolegend公司® ，目录号：420302）
细胞Ç ulture克RADE瓦特亚特（HyPure TM ，目录号：SH30529.02）
MojoSort TM小鼠CD4朴素T细胞分离试剂盒（Biolegend公司® ，目录号：480040）
包被抗体：
抗-小鼠CD3 ε （克隆145-2C11，生物X细胞，目录号：BE0001-1）
抗小鼠CD28（克隆37.51，Bio X Cell，目录号：BE0015-1）
染色抗体：
APC抗小鼠CD4（克隆RM4-5，Biolegend ，目录号：100516）
PE / Cy7抗小鼠IL-17A（克隆TC11-18H10.1，Biolegend ，目录号：506922 ）
细胞刺激性鸡尾酒加蛋白质转运抑制剂（Invitrogen eBioscience TM ，目录号：00-4975-93 ）
的FoxP3 /转录因子小号泰宁缓冲器组（固定稀释剂，固定试剂，透化试剂盒，eBioscience公司TM ，目录号：00-5523-00 ）
带有L-谷氨酰胺的RPMI 1640 1 × （Corning，目录号：10-040-CV ）
胎b绵羊小号erum（FBS）（亚特兰大生物制剂TM ，R＆d SYSTEMS，目录号：S12450 ）
L- g谷氨酰胺200 mM （Corning，目录号：25-005-CI ）
青霉素-s treptomycin小号olution（PS）100 × （康宁，目录号：30-002-CI ）
钠p yruvate的100mM（康宁，目录号：25-000-CI ）
2-米ercaptoethanol（ME）1000 × （生命技术，Gibco公司® ，目录号：21985-023 ）
T H 17极化细胞因子和抗体：
重组人类TGF-β1（PeproTech，目录号：100-21C）
重组鼠IL-6（PeproTech，目录号：216-16）
抗小鼠IFN - γ（克隆XMG1.2，Bio X Cell，货号：BE0055 ）
抗小鼠IL-2（克隆JES6-1A12，Bio X Cell，目录号：BE0043 ）
抗小鼠IL-4（克隆11B11，Bio X Cell，目录号：BE0045 ）
磷酸盐-b uffered小号艾琳（PBS）1 × （康宁，目录号：21-040-CV ）
牛小号erum一个lbumin（BSA）（费希尔BioReagents公司TM ，目录号：BP1600-100 ）
乙二胺吨etraacetate一个CID（EDTA）0.5 M（费舍尔BioReagents公司TM ，目录号：BP2482-500）
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）（Invitrogen TM ，目录号：C1157）
培养基（请参阅食谱）
TCR刺激抗体混合物（请参阅食谱）
RBC裂解缓冲液（1 × ）（请参阅配方）
MACS缓冲区（请参阅食谱）
T H 17极化介质（请参阅食谱）
染色缓冲液（请参见配方）

设备

NovoCyte （ACEA生物科学）

软件

FlowJo软件（BD Biosciences）

程序

幼稚的CD4 + T细胞分离和接种。
第2天，预涂层200 μ升TCR刺激抗体混合物/孔在一个48孔板4 ℃。
第0天，安乐死一个C57BL / 6J小鼠（或IL17A-IRES-GFP-KI小鼠），收获脾和升ymph节点（LNS），以及分离幼稚CD4 +使用T细胞的MojoSort™分离试剂盒根据制造商的说明书s 。
注：乙ASIC信息有关的解剖一个实验小鼠，可以发现http://www.informatics.jax.org/cookbook/。

计数细胞小号和种子2.5 × 10 5个细胞/孔在预涂覆有500 48孔板μ L T ħ 17极化介质，在37℃/ 5％CO 2 。
注意：Ť ö后续T细胞增殖，它是可选的染色的幼稚CD4 +根据制造商的说明书的T细胞用CFSE小号。

FACS分析T H 17细胞分化（图1 ）
第3天（或2天之间任何时间和5天;我们在40％以上通常观察到IL17 +细胞开始在第2天以及其余为3天，直到介质的营养物耗尽），治疗的细胞4小时以细胞刺激鸡尾酒加蛋白转运抑制剂，根据制造商的4小时，然后染色的细胞小号带的抗小鼠CD4抗体（1：100），在4℃下30分钟℃下。接着，固定和透化的使用细胞的FoxP3的固定/透化试剂盒根据制造商的说明。最后，染色的与细胞的抗-IL-17A抗体（1：100），在RT用于FACS分析之前15分钟（我˚F培养的细胞是从一个IL17A-IRES-GFP-KI小鼠，FACS分析可以进行的情况下直接程序descri b上述b中ED）。

注意：乙ASIC原则和流式细胞术的应用程序可以在文献中找到（麦金农，2018）。

C：\ Users \ Madandan \ Desktop \ Proofreading v1--截止期限0408（1）\ Proofreading v1--截止期限0408 \ 2003927--1795 SiwenKang 970920 \ Figs tif \ Fig1.tif

图1.朴素CD4 + T细胞分离和T ħ 17分化。流式细胞仪数据显示，在第0天分离后可获得超过90％的原始CD4 + T细胞（左图）。第3天，CFSE标记数据显示荷兰国际集团的是50％以上Ť ħ 17细胞可观察到交-极化（点泰德线帧）。

数据分析

FlowJo软件：主门P1 ; 在第0天数据中，选择对数SSC与CD4进行门控CD4 + T细胞。第3天数据; P1-CD4栅极（相同选通方案为第0天）内，选择登录CFSE或CD4与IL-17A到analyz Ë细胞内IL-17。

菜谱

培养基
RPMI 1640 1 ×

10％胎牛血清（FBS ）

2毫米L-谷氨酰胺

1％丙酮酸钠

PS 1％

1：1 ，000 2-ME

储存在4°C

TCR刺激抗体混合物
10 μ克/ ml抗小鼠CD3和10 μ微克/毫升的抗小鼠CD28抗体在PBS中

RBC裂解缓冲液（1 ×）
1 ml 10 ×缓冲液和9 ml细胞培养级水

储存在4°C

MACS缓冲区
500 ml PBS，其中含有2.5 g牛血清白蛋白（BSA）和2 ml 0.5 M EDTA

商店在4℃下，郝晓红使用一个0.2 -微米过滤器

T H 17极化介质
含的mIL-6（50纳克/毫升），hTGF-β1培养基（20纳克/毫升），抗-的mIL-2（8微克/毫升），抗-的mIL-4（8微克/毫升），和抗- mIFN- γ（8微克/毫升）

准备立即在我们面前Ë

染色缓冲
含2％（w / v）BSA的PBS

储存在4°C

致谢

笔者想通过1R21CA227926-01A1和1UO1CA232488-01从承认支持了国家研究所小号卫生（癌症登月计划），1R01AI114581的该研究所小号健康，V2014-001从V型基金，和128436-RSG美国癌症协会（-15）的-15-180-01-LIB 。对于，作者W¯¯ ISH强调，这个协议是建立在的T以前的知识和实验细节^ h 17在体外分化已经建立在FIEL d多年（哈林顿，哈顿等人。，2005;公园，李等人。，2005; Veldhoen ;广田等人。，2009）。该协议经过了Wu等人发表的先前研究的微小修改后进行了修改。（2020年）。

利益争夺

该作者宣称没有冲突小号的兴趣。

参考

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