材料和[R eagents

消耗品
d isposable手套
无RNAase的1.5 ml聚丙烯试管
96孔板
0.5 ml聚丙烯管
50毫升猎鹰锥形管小号（康宁，目录号：45352054）
70 μ米尼龙细胞滤网小号（BD Biosciences公司，目录号：45352350）
细胞培养板
针筒
毛巾
样品收集管
23-25 G针
2 ml无RNAase的Eppendorf管（Merck KGaA ，目录号：T2795）
P OLY -L-赖氨酸-包被的载玻片（默克KGaA公司，CATA登录号：P0425）
Whatman 1号滤纸

试剂和ķ其
无核酸酶的水（经DEPC处理的水）
绝对异丙醇（Merck KGaA ，目录号：I9516）
Tris碱（Tris-羟甲基-氨基甲烷； Bio-Rad Lab，目录号：161-0719）
3 M醋酸钠（Merck KGaA ，目录号：S7899）
溴酚蓝二甲苯氰染料溶液（Merck KGaA ，目录号：B3269-5mL）
N，N，N”，N'-吨etramethylethylenediamine ，TEMED（BIO-R广告，赫拉克勒斯，目录号：161-0800）
Amonium p ersulfate，APS （BIO-R广告，赫拉克勒斯，目录号：161-0700）
甲醇（Merck KGaA ，目录号：82762）
绝对乙醇（从常规化学药品供应商处获得）
过氧化氢（从一般化学品供应商处获得）
D +蔗糖（AppliChem GmbH，目录号：200-334-9）
乙二胺四乙酸（EDTA，Merck KGaA，目录号：E6758）
RNase-ZAP（Merck KGaA ，目录号：R2020）
BHT（丁羟甲苯;默克（Merck）KGaA ，目录号：W218405）
FACS升ysing小号olution（Becton Dickinson公司，目录号：349202）
二甲苯（异构体混合物，VWR International，目录号：28975.360）
DPX安装介质（VWR International，目录号：360294H）
来自猪皮的果冻（Sigma-Aldrich，目录号：G1890）
油红色O （Merck KGaA，目录号：O0625）
RPMI 1640培养基（生物工业）
注：- [R eagents 1-2 0被小号在室温下tored 。

Opti-MEM（Themo Fisher，目录号：51985034）
胎b绵羊小号erum（龙沙制药和生物技术，目录号：14-802F）
白蛋白ELISA试剂盒（Active Motif）
DEPC（焦碳酸二乙酯； Merck KGaA ，目录号：D5758）。
40％丙烯酰胺/ Bis 29：1（Bio-R ad ，Hercules，目录号：161-0146）
碘化丙我odine（干细胞技术，目录号：75002）
TRIzol （ThermoFisher Scientific，目录号：15596026）
DAB底物（3,3'二氨基联苯胺四盐酸盐水合物，Sigma-Aldrich，目录号：D5637-5G）
流Ç ytometry小号泰宁b uffer（赛默飞世科学，目录号：00-4222）
100 mM青霉素/链霉素（ThermoFisher Scientific，目录号：15070-063）
注：- [R eagents 2 1 - 3级0是小号在4 tored ℃下。

200 mM L-谷氨酰胺（ThermoFisher Scientific，目录号：25030-024）
高容量cDNA反转录试剂盒（ThermoFisher Scientific，目录号：4368814）
PureLinkTMRNA Mini试剂盒（ThermoFisher Scientific，目录号：12183020）
用于快速扩增cDNA末端试剂盒的5'RACE系统（ThermoFisher Scientific）
Oligofectamine 2000（ThermoFisher Scientific，目录号：12252011）
GM-CSF（研发系统，目录号：215-GM）
从脂多糖（LPS）E. Ç OLI血清型O111：B4（Sigma-Aldrich公司，目录号：L4391）
GeneEraser荧光素酶抑制测试系统（Stratagene / Agilent ，目录号：240192）
萤光素酶测定系统（Promega，目录号：E1531）
Polyfect吨ransfection ř eagent（Qiagen公司，目录号：301105 ）
血清正常山羊（Merck KGaA ，目录号：G9023）或马20％（Merck KGaA ，目录号：H0146）
注：- [R eagents 3 1 - 41储存在-20 ℃下。

的Taqman基因表达测定（ABI /赛默飞科学）（Ť能够1）

表1.本研究中使用的商业TaqMan探针

（1）使用的Taqman探针的商业代码（ThermoFisher Scientific）。

（2）Refseq / Genbank所测试基因的唯一标识符。

（3）探针内的基本位置。

0.1 M柠檬酸盐缓冲液，pH 6 （请参见食谱），在室温下保存
0.01 M柠檬酸盐缓冲液（请参阅食谱），在室温下保存
油红色工作溶液（请参见食谱），在室温下保存
Phosph一个TE缓冲小号艾琳（PBS），pH为7.5（参见食谱），贮存在室温下
PBS-Triton（PBST）（请参阅食谱），在室温下保存
PS b uffer （见配方），贮存在室温下
完整Ç ulture米edium （见配方），保存于4 ℃下
二抗（对于1：200稀释度）（请参见食谱），保持在-20 °C
退火b uffer 10 ×（见配方）
经DEPC处理的水（请参阅配方）
1 M Tris-HCl，pH 7.5 （请参阅食谱）
12％丙烯酰胺凝胶（请参阅食谱）
非-变性凝胶样缓冲液（见食谱）
PBS中的4％PFA溶液（请参阅食谱）
0.3％的油红O小号滴答小号olution （见食谱）
正常山羊或马的血清浓度为20％（请参阅食谱）

小学一ntibodies
在这项工作中，我们使用了以下特定的第一抗体：

兔多克隆抗CD40抗体（C-20，圣克鲁斯生物技术，目录号：sc-975）
兔多抗CD154抗体（H215，圣克鲁斯生物技术，目录号：sc-9097）
小鼠单克隆抗DC-SIGN抗体（1B10，圣克鲁斯生物技术，目录号：sc-23926）
兔多克隆抗NF- κ乙p65的抗体（抗-磷酸S536，Abcam公司，目录号：Ab86299）
抗F4 / 80抗体（Hycult Biotech，目录号：HM1066）
ř abbit抗小鼠胶原IV抗体（Chemicon公司国际，目录号：AB756p）
ģ燕麦多克隆抗-人体C3c抗体缀合到FITC（Nordic- MuBio ，目录号：GAHu /体C3c / FITC）

此外，以下来自BD Biosciences （美国加利福尼亚州圣何塞）的抗体用于流式细胞仪：

抗CD11c抗体（克隆HL3）
抗CD11b抗体（克隆M1 / 70）
抗CD40抗体（克隆HM40-3）
抗CD80抗体（克隆16-10A1）
抗CD86抗体（克隆GL1）
注意：所有一抗都保存在-20 °C ，除非制造商明确规定了其他温度。

二抗和组织学试剂
在该工作中使用了以下二抗：

Alexa 488标记的鸡肉防山羊（ThermoFisher Scientific，目录号：AB_2535870）
山羊抗兔（ThermoFisher Scientific，目录号：AB_2633280）
Alexa 555标记的山羊抗小鼠（ThermoFisher Scientific，目录号：AB_2535844）
Alexa 546标记的山羊抗兔（ThermoFisher Scientific，目录号：AB_2633280）
未结合的山羊抗大鼠（Novus Biologicals）
生物素化的马抗山羊（Vector Laboratories，目录号：BA-9500）
FITC缀合的山羊抗小鼠（Merck KGaA ，目录号：F0257）
VECTASTAIN Elite ABC HRP试剂盒（Vector实验室，目录号：PK-6100）
抗生物素蛋白/生物素封闭试剂盒（Vector实验室，目录号：PK-4001-NB）
Ñ OTE ：所有第二抗体储存在4 ℃下，除非一个其他温度是专门制造商规定。

使用了以下组织学试剂：

哈里斯ħ ematoxylin小号olution（Sigma-Aldrich公司，目录号：HHS32-1L）
曙红Y小号olution ，一个lcoholic（Sigma-Aldrich公司，目录号：HT110132-1L）
高碘酸（Sigma-Aldrich，目录号：P0430-25G）
希夫ř eagent（Sigma-Aldrich公司，目录号：3952016-500ML）
PAS染色试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：101646）
油Red-O试剂（Sigma-Aldrich，目录号：O0625-100G）
组织Tec OCT包合物（Sakura FinetekEurope ）
UltraCruz的Tm米ounting米edium（圣克鲁斯生物技术，目录号：SC-24941）
DRAQ5（ThermoFisher Scientific，目录号：65-0880-92）
注意小号：

用于核复染。
所有组织学试剂均在室温下保存。

动物
六个月-老NZB / NZW（F1）的雌性小鼠（杰克逊实验室，查尔斯河，威尔明顿，MA，USA）
六至八周大的雄性ICR小鼠（杰克逊实验室，查尔斯河，威尔明顿，美国马萨诸塞州）
八周-旧的ApoE - / -雌性小鼠（杰克逊实验室，查尔斯河，威尔明顿，MA，USA）
注意：将动物圈养在保持恒温的房间内，并允许其自由饮水和标准实验室饮食。为了加速动脉粥样硬化，载脂蛋白E - / -小鼠饲喂W¯¯含有0.2％的胆固醇和提供42％的西部时代饮食的能量为脂肪（TD.88137; Harlan- Tekland ，麦迪逊，WI，USA）。通过吸入异氟烷使动物安乐死。方案经批准Ë thics Ç ommittee为一个nimal [R UB-的esearch Bellvitge ，按照实验室动物实验的欧洲立法进行和实验。

siRNA寡核苷酸
在这项工作中，我们使用了CD40特异性DS-siRNA的同源两者的小鼠和大鼠CD40 mRNA序列（在本文中抗CD40-siRNA转澈）和一个加扰序列（S / S）DS-的siRNA的控制（在此S / S -对照siRNA（Chol ）。通过吡咯烷连接子将胆固醇（chol ）分子缀合至有义链的3'末端来修饰两者。

所述的siRNA序列如下：

一个NTI-CD40正义链：5'-GUGUGUUACGUGCAGUGACUU-3'

一个NTI-CD40反义链：5'-GUCACUGCACGUAACACACTG-3'

（s / s），对照siRNA有义链：5'-ACUACAAGACUCGUGAGAAU-3'

（s / s），对照siRNA反义链：5'-UGGUCACGAGUCUUGUAGUUUU-3'

为了确定转染效率和器官分布小号的所述的siRNA ，胆固醇缀合和未修饰的抗CD40的siRNA标记与Cy5.5的。

注意：所有寡核苷酸均购自Microsynth AG（瑞士Balgach ），并保存在-20 °C下。

细胞系
高度可转染的人类胚胎肾脏293FT细胞系（ThermoFisher Scientific，目录号：R70007）
主d endritic细胞（直径：从ICR小鼠的骨髓btained）

设备

细胞刮刀（Sarstedt AG＆CO，Nümbrecht ，GE，目录号：83.3950）
手术刀
钳子：小号traight ，锯齿-尖镊子; 直线或曲线，锯齿-尖端细镊子; 直细-尖镊子
剪刀：小号traight ，钝剪刀; 笔直，锋利，细的剪刀; 和微型-解剖弹簧剪刀
自动移液管（1 - 10 μ升，20 - 200 μ升）
血细胞计数器
水浴
Jasco V-650分光光度计（美国马里兰州伊斯顿，用于确定siRNA双链体的熔点）
Olympum a尿量分析仪AU400（德国汉堡，用于测定尿蛋白和肌酐浓度s ）
TaqMan实时PCR ABI PRISM ® 7700（赛默飞世科学，用于定量PCR实验）
BD FACS坎托II Ç ytometer（BD Biosciences公司，在流式细胞术实验中使用）
Zeiss SteREOLumar V12显微镜（Carl Zeiss AG，用于显微镜实验）
Leica TCS-SL光谱共焦显微镜（Leica Camera AG，用于显微镜实验）
TD-二十○分之二十光度计（特纳设计，用于升uciferase测定）
T-25 ULTRA-TURRAX TM均化器（IKA ® -Werke GMBH＆CO ）
NanoDrop 2000c S分光光度计（ThermoFisher Scientific）
台式离心机（Eppendorf冷却离心机，模式：5424R）
细胞Ç ulture CO 2我ncubator（NuAire自动流NU 8700）

软件

徕卡ç onfocal小号oftware（徕卡股份公司，韦茨拉尔，德国）
图像分析软件ProgResCapturePro 2.7.7 （JenoptiK AG，耶拿，GE）
ImageJ v1.48（NIH，美国马里兰州贝塞斯达）
ExpressionSuite软件v1.0或更高版本（ABI，ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）
SDS的软件v2.4（ABI，ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）
FACS DIVA软件（美国加利福尼亚州圣何塞的BD Biosciences公司）

程序小号

siRNA的合成与制备
要求：d isposable手套，加热水浴，离心，自动移液管（1 - 10 μ升，20 - 200 μ升），的Jasco V-650分光光度计，RNA酶-free 1 。5 -毫升聚丙烯管，冰，无核酸酶水，退火缓冲液（10毫摩尔Tris pH为7.5，20mM的NaCl）中，3M乙酸钠（pH 5.2），异丙醇，70％乙醇，ö ligonucleotides。

抗CD40寡核苷酸的设计。
ANALY ž Ë靶mRNA序列（在本文中鼠CD40，NCBI登录X60592.1 ）选择一个数字，并具有以下结构，符合序列的5'-GN 17 C-3' 。产生了九个不同的序列以选择最佳的靶位点（Pluvinet等，2004）。一般规则，以改善siRNA沉默的有效性是：1）p在有义链的5'端的G / C的resence ; 2）在反义链的5'末端存在A / U ；3）在反义链的5'末端的前7个碱基中存在至少5个A / U残基；4）序列中不允许有超过9个G / C残基的运行（Ui-Tei等，2004）；5）在靶位点处的二级结构应保持到最低限度（Bohula等人，2003;克雷奇默尔-Kazemi的远东和Sczakiel ，2003）。

寡核苷酸退火以产生ds-siRNA。
对于寡核苷酸退火，可通过混合混合等摩尔量的不同抗CD40和对照siRNA的互补有义链和反义链：

寡核苷酸1 /有义链（100 pmol / µl）……………………………… 10 µl

寡核苷酸2 /反义链（100 pmol /µl)……..………………………10 µl

2 x寡核苷酸退火缓冲液（10 mM Tris，pH 7.5，20 mM NaCl）………………... 50 µl

无核酸酶的水（最高）…………………………………………..………… 100 µl

在水浴中于90 °C加热3分钟，然后将其关闭。
让试管在水浴中缓慢冷却至室温（<60分钟）。最终浓度应为100 pmol / µl ds-siRNA。
将退火的ds-siRNA寡核苷酸储存在4 °C以便立即使用，或储存在-20 °C以便更长的存储时间。
确定ds-siRNA的解链温度（Tm）。
在Jasco V-650分光光度计中，以0.5 °C / min的线性温度梯度加热样品。获得熔融温度作为一阶导数的最大值。未修饰的CD40的ds-siRNA的熔点是79 ℃，和该中的C ^ holesterol衍生CD40 DS-的siRNA（抗CD40-siRNA转澈）是71 ℃下。

ds-siRNA的酒精沉淀。
添加一个0.1体积的3M乙酸钠（pH5.2）和1倍体积的异丙醇，混匀。
保持在冰上进行5分钟并离心，在所述在微量的最高速度10分钟。
小心吸出上清液，用0.5 ml的70％冷乙醇洗涤沉淀，并小心除去所有乙醇。
空气干燥沉淀为没有再在室温下超过15分钟，并重新悬浮的ds-siRNA对不含核酸酶的水在2 - 5 -倍原体积。
定量的siRNA的浓度使用Ñ ANO d ROP或等效。在F伊纳勒浓度应为20 - 50皮摩尔/微升。
ANALY ž Ë所述的siRNA在非-变性12％聚丙烯酰胺凝胶（见ř ecipes）大小和完整性，并储存在-20 ℃下或-70 ℃下。
混合达5个μ升用2寡核苷酸μ升装载缓冲液（见ř ecipes）。
加载在非样品-变性12％聚丙烯酰胺凝胶和受electrophores是在200 - 250 V.
当停止电泳乙romophenol乙略染料前已经迁移的方式向下凝胶三分之二。
染色为2的凝胶-在1 5分钟μ克/米升的溴化乙锭溶液。
将该凝胶浸泡2 -在水中5分钟。
使用紫外线透射仪可视化siRNA。

所述siRNA应该迁移为21 -稍微运行后面22 bp的条带乙romophenol乙略染料前沿。在主要siRNA谱带后面延伸的第二条强度较低的谱带可能很明显，代表一条部分消化的siRNA链。所述underdigested RNA链是27个核苷酸的长度，并且不产生任何非-当特异性作用用于转染细胞。

反的沉默能力的测定- CD40-siRNA转澈使用GeneEraser荧光素酶抑制测试系统
要求：d isposable手套，96孔板，自动移液管（1 - 10 μ升，20 - 200 μ升），细胞刮刀（Sarstedt的AG＆CO。，宁布雷希特，GE，目录号：83.3950），离心，冰，0.5 -毫升聚丙烯管，PTARGET-LUC-rCD40，Oligofectamine转，HEK-293细胞，Polyfect吨ransfection ř eagent，70％乙醇，1 ×磷酸盐缓冲盐水（PBS），1 ×裂解试剂，升uciferase一个SSAY ř eagent， TD-20 / 20发光计。

发电机密封Ë的apTarget-LUC-CD40质粒。
对应于部分鼠CD40 cDNA序列平末端506 bp片段（编码序列的41个核苷酸- 547; GenBank登录Acc编号AF241231）是钝-端在克隆到质粒PTARGET-luc的在荧光素酶的3'UTR基因。

用siRNA（100 nM ）转染HEK-293细胞。
准备ds-siRNA的100 nM溶液，使用O ligofectamine按照制造商的说明转染融合的HEK-293细胞。
6小时后，转染上述细胞与400ng的PTARGET-LUC-CD40使用Polyfect吨ransfection ř eagent根据制造商的说明。通过共转染500 ng pCMV-bGal标准化转染效率。
将细胞在37 °C ，5％CO 2的潮湿气氛中孵育48小时。
Prepar Ë细胞裂解物进行分析。
除去的从生长培养基中培养的细胞。
冲洗的细胞在1 × PBS中，并除去尽可能多的。
在一个96孔板，分配20微升/孔1 ×裂解试剂（1 ×裂解试剂通过添加4体积水至1个体积制备5 ×来自试剂盒的裂解试剂）。
刮掉的从培养皿的细胞，将溶液转移到离心管中。
沉淀的通过短暂离心细胞碎片，将上清液转移到一个新试管中。
混合20微升细胞溶胞产物与100μl升uciferase一个SSAY ř eagent并测量的在TD-20/20光度计光。

骨髓来源的树突状细胞（DC）萃取，文化，激活，和转染的siRNA在体外
要求：d isposable手套，50 -米升猎鹰锥形管小号（康宁，目录号：45352054），70 - μ米尼龙细胞滤网小号（BD Biosciences公司，目录号：45352350），高压灭菌材料小号（钳子，解剖刀，剪刀），细胞培养罩，冰，小鼠股骨和胫骨，血球，细胞培养板，样品收集管，Oligofectamine转2000，BD FACS升ysing小号olution，完全RPMI 1640培养基（RPMI 1640培养基补充有100U / ml的p enicillin， 100μg/ ml的小号treptomycin，2μML-谷氨酰胺，10％热-失活的FBS ，和20ng / ml的GM-CSF），的Opti-MEM培养基，碘化丙啶（原液：1.5毫摩尔）中，siRNA，LPS，流式细胞仪。

安乐死ICR根据小鼠到该机构的指导方针和提取的股骨胫骨和。
将每只小鼠放在无菌罩中的无菌手术垫上。
用70％的乙醇喷洒鼠标，以免污染样品。
浸泡的在RPMI股骨和胫骨1640培养基。
收获的骨髓（BMC）。
注：所有工作都应该进行无菌条件下在细胞培养罩。

切两端股骨机智^ h无菌剪刀。
用无菌培养皿将b转移到RPMI 1640中。
大力冲洗骨骼的内部用1ml冰冷的RPMI 1640培养基中使用1 -毫升吸管。同花顺2 - 3次，直至骨头完全为白色。
冲洗骨髓出到一个70 - μ置于50米的尼龙细胞过滤器-米升猎鹰锥形管。
粉碎通过细胞过滤骨髓使用5 -毫升柱塞，和洗涤用5微米的过滤器升RPMI。
离心的在250个细胞×克8分钟，在4 ℃下，并丢弃上清液。
重悬的细胞沉淀在1米升RBC裂解缓冲液，孵育在室温下5分钟。
中和裂解缓冲液通过加入5ml FBS 。
离心机的细胞以250 ×克在4 8分钟℃下，弃上清，重悬在5米升RPMI 1640培养基。取出等分的细胞悬液进行计数。
确定获得的细胞总数。
一种。稀10 μ升骨骨髓悬浮液在90 μ升1 × BD FACS升ysing小号olution（见上文）。

b 。计数10 μ升细胞悬浮液使用一个血球。

生长5 × 10 6个细胞。
在5 ml完整RPMI 1640培养基（参见上文）中添加细胞，该培养基中添加了10 ng / ml IL-4和20 ng / ml GM-CSF，在37 °C的T25烧瓶中，5％CO 2的潮湿环境中生长。

24小时后，一些细胞粘附在平板上，但其他细胞则悬浮在培养基中。72小时后出现菌落。n个贴壁细胞的棕土逐渐减少小号随时间和在第5天，将悬浮的细胞与树突突起逐渐增加。在第7天，将悬浮的细胞求我n至骨料和突起伸长。

更改的第3天至5培养基。
删除的中介UM小心，以免干扰生长的细胞。
短暂离心（250 ×g ，8分钟），因为DC s松散附着，所以去除了培养基。重悬细胞沉淀在具有10米的相同的烧瓶升新鲜RPMI 1640补充有20纳克/立方米升GM-CSF。
收获BMDC（第8天）
收集非贴壁细胞通过轻轻吹打的培养基，并转移到无菌的50 -米升离心管小号。丢弃该贴壁细胞的是包括巨噬细胞。
松散粘附的BMDC变得容易通过该方法脱落成悬浮液，而巨噬细胞仍然是一个dhered到培养皿中。
计算获得的细胞总数。
在第8天用siRNA转染。
孵育1 × 10 6未成熟的BMDC / ml的2μM未修饰的siRNA-Cy5.5的或澈-siRNA转-Cy5.5的（见小号的M的挠度Ë aterials和试剂部，上述），使用阳离子脂质Oligofectamine转2000中的Opti - 6 MEM培养基-厘米的菜肴。

在第9天用100 ng / ml LPS处理不成熟的BMDC，持续12 h。
收获BMDC
收集所有的细胞（分离细胞一刮刀）。
离心机中以250细胞×克为8分钟。
除去上清液，将细胞沉淀重悬于5 ml PBS中（洗涤1）
离心机中以250细胞×克为8分钟。
除去上清液并将细胞沉淀重悬于5 ml PBS中（洗涤2）
离心机中以250细胞×克为8分钟。
重悬在1米的细胞沉淀升RPMI 16 4 0补充有10％FBS和20 mM的青霉素/链霉素。
数细胞。
染色的带的终浓度的DCs ≤ 1 μ克/ ml的碘化丙啶碘化物（PI）。
通过将固体PI溶解在PBS中制备1 mg / ml （1.5 M）的储备溶液。避免长时间暴露在光线下。
只要有可能，准备和使用的当天原液。如果在储备溶液必须提前，等分试样并储存在-20制成在密闭小瓶中℃下（通常最多稳定到1个月）。
重悬50 μ升细胞悬浮液在50 μ升˚F低Ç ytometry小号泰宁b uffer。
加入5 μ升PI染色小号每100 olution μ升细胞悬浮液。不洗的细胞加入PI之后。
在黑暗中于冰上孵育5 – 15分钟。
ANALY ž Ë的样品立即通过流式细胞术。
表征的通过流式细胞术细胞表型。
非特异性块Fc介导的与0.5相互作用μ克抗小鼠CD16 /每100 CD32 μ升15分钟，在4 ℃下染色之前。
抗体结合动力学是温度依赖性的。在冰上染色可能需要更长的孵育时间。

等分试样50 μ升细胞悬浮液到每个管（一个每抗体）。
结合的原发性抗体（同种型对照和下列抗体的细胞悬浮液：抗CD11c（HL3克隆），抗CD11b（M1克隆/ 70），抗CD40（克隆HM40-3），抗CD80（克隆16 -10A1）和抗CD86（克隆GL1））和适当体积的˚F低血细胞计数小号泰宁b uffer达到一最终染色体积的100 μ升。涡流。
孵育用于在冰上至少30分钟。避光。
通过加入2M洗细胞升流Ç ytometry小号泰宁b uffer到每个管中。
通过在250离心细胞重复洗涤步骤两次×克为在室温下8分钟。
除去上清，重悬在100沉淀μ升流Ç ytometry小号泰宁b uffer。
将细胞悬浮液转移到聚丙烯管中进行流式细胞术。
有关存储在分析之前样品，添加100 μ升IC ˚F ixation b uffer。
ANALY ž Ë的细胞根据荧光强度的上述标记和获取代表图像用于后续的分析/孔定量吨通货膨胀。

的沉默活性的评价抗-CD40-siRNA转澈在体内米乌斯模型
要求：G loves，手术刀，剪刀，注射器，毛巾，棉布，样品收集管，23 – 25 G针，小鼠，siRNA，PS缓冲液（参见R ecipes），异氟烷，异氟烷腔，便携式液氮容器，液氮，和采血管。

分离小鼠到治疗组和对照组。
研究在体内的全身给药的效果CHOL -siRNAs：使用6 - 8 -周大的雄性ICR小鼠（每组4只小鼠）。ADMINIST ER 50微克抗-CD40-siRNA转澈或S / S-控制的siRNA澈通过我。p 。注射（0.2 µm过滤的PBS中10 ml / kg ）。在预定的时间点（天0，1，3，5，7 ，和9），从辖单剂量的5个微克LPS大肠杆菌通过我。p 。注射。给予LPS后4小时对动物实施安乐死。
对于5个月大的NZB / NZW F1狼疮肾炎研究，小号等了以下几组：
CYP：甲dminist ER 50mg / kg的我。p 。每10天（n = 9）。
CTLA4 ：ADMINIST ER 50微克阿巴西普（ORENCIA ，Bristol Myers Squibb的）THR EE次每周（N = 9）。
siCD40-1w ：ADMINIST ER 50 μ克抗- CD40-siRNA转澈我。p 。每周一次（n = 9）。
siCD40-2w ：ADMINIST ER 50 μ克抗- CD40-siRNA转澈我。p 。每周两次（n = 9）。
控制：ADMINIST ER 50 μ克S / S-控制的siRNA澈我。p 。每周两次（n = 15）。
对于与8周龄雌性ApoE -/-小鼠进行的硬化研究。牛逼不动产资产信托小鼠每周两次我。p 。用50 μ克抗- CD40-siRNA转澈，S / S-控制的siRNA澈或媒介物（每组5只小鼠）。安乐死的8周（基础组），10周，14周动物，或24周。
组织收集：尿液和静脉血。
将在个体代谢笼中的动物与水和在平时的饮食，并收集处理来临之前，之后每隔一个月24个小时尿液标本。
注意：如果小鼠在给定时间内没有产生尿液，则在第二天在更暖的房间中重复该步骤。

将尿液样品以500 × g离心10分钟。收集的尿液，并保留了进一步研究的沉积物; 存储的尿和沉积物在-20 ℃下。
每月两次确定小鼠的体重。
ø N A按月，使用短执行从尾静脉的非末端静脉采血（无需更换流体的）-term麻醉通过吸入异氟烷。
要记住的动物舒适性要点：

使动物舒适的温度保持在24 - 27 ℃的。
不擦的从尖端的基部作为尾部这将导致亮氨酸ķ ocytosis 。如果看不到静脉，则将尾巴浸入温水（40 °C ）中。
插入一个23 - 25号针入使用毛细管或注射器针头的血管和采集血液。在困难情况下，切一个皮肤的最小表面，刺的与刺血针出血或针，并收集血液的毛细管或具有针头的注射器中静脉。
收集血液的次数不要超过三遍。每只小鼠的最大采血量应为0.2毫升血液。所估计的血液体积在成年动物为55 -为70ml / kg体重（巴拉苏罗等人，2010）。
完成采血后，停止了流血使用压力。
洗的频繁约束以避免信息素诱导的应力或交叉感染。
在研究结束时，通过心脏穿刺提取动脉血。
在异氟烷腔中对动物进行终末麻醉。
打开的胸部（胸廓），并且直接从心室获得的血液样本，同时注意不要崩溃的心脏。
组织收集：肝和肾
通过吸入异氟烷对所有小鼠实施安乐死。
解剖出了通过腹部肾脏和肝脏并通过灌注冰把它们洗干净-冷的1 ×经由左心室PBS。
切除肾脏。一个肾脏将用于组织学评估，另一个肾脏用于总RNA提取。
对于组织学分析，除去的上三分之一的肾脏，以确保两个皮层和近髓质肾小球存在并固定在5ml缓冲液PS的片在4 ℃下24-48小时。
对于免疫荧光分析，将三分之一的所述肾片（以确保两个皮质和髓质肾小球存在）进入组织模具和外衣在OCT中。将其绑在干冰上以冻结并储存在-80 °C下。
对于蛋白质和RNA提取，将3 × 2 mm 3的肾皮质和肝脏碎片放入0.5 ml塑料管中，并在液氮2中速冻。储存在-80 °C 。对于长期储存的组织进行RNA提取，放置了在RNA的5个体积组织稳定化试剂，并储存于-80 ℃下。
从肾脏组织中提取和纯化RNA。
要求：d isposable手套，升aboratory ˚F UME ħ OOD，无RNase的移液管和移液管尖端小号，无菌塑料器皿，冷TRIZOL TM ，转子-定子匀化器（ULTRA-TURRAX TM ），冰，圆底ED无RNase的管用于组织均匀化，无RNase水（用DEPC处理过的水，请参见[R eceip小号），桌面离心机，2毫升RNA酶-free Eppendorf管，ñ ANO d ROP ，的PureLink RNA mini试剂盒，ç hloroform，70％è THANOL（100 ％乙醇与无RNAse的水混合），v涡旋。

1毫升添加冷的TRIzol 50 - 100毫克肾组织在一个圆底ED无RNase的管，搅匀在冰上。将探针的尖端浸在裂解液中，同时将探针的尖端紧贴在管壁上，以免产生泡沫。
孵育5分钟- [R OOM温度以允许的核蛋白复合物完全解离。
添加0.2米升氯仿并涡旋。
孵育2 -在室温下3分钟。
离心样品在12 15分钟，000 ×克，4 ℃下。
将混合物分离成一个较低的红酚-氯仿相，相间和无色上层水相。小心地将水相转移到一个2 -毫升Eppendorf管中（重要：避免传输任何相间或有机层的）。
加入一体积的70％乙醇并涡旋。
转印≤ 700 μ升样品到自旋Ç artridge并根据该净化总RNA试剂盒说明书（在此情况下的PureLink RNA迷你试剂盒）。
孔定量FY总RNA使用的Ñ ANO d ROP 。
第一链DNA合成（逆转录）。
要求：我CE，无RNase水，台式离心机，Eppendorf管，高容量cDNA逆转录试剂盒，热循环仪，70％ë THANOL，v ortex。

逆转录反应是根据所用试剂盒（在这种情况下为高容量cDNA反转录）的说明，使用500 ng RNA进行的。

Determin ê在CD40表达的肾脏和肝脏通过qPCR。
用CD40引物（Mn_00441891_m1; Taqman基因表达测定法，来自ABI / ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA）建立反应。

分析抗- CD40-siRNA转澈-执导由5'RACE裂解产物。
要求：G爱，总RNA（来自C1节），热循环仪，cDNA合成试剂盒，5'RACE试剂盒。

合成第一链从5的cDNA μ克总RNA （肾）使用高容量cDNA RT试剂盒与基因特异性引物＃1（GSP1）：5' - GCCGACTGGGCAGGGATGACAGACG 。
将5'RACE试剂盒中的衔接子寡核苷酸连接到cDNA的5'末端。
特别是使用AMPLIFY裂解产物一个到适配器（5'RACE试剂盒）互补的引物和所述嵌套基因-特异性引物＃2 （GSP2）：GSP2：5'-AGCCAGGGATACAGGGCGTGTGC。使用以下PCR程序：1 m，94 °C × 60 s和94 °C × 30 s，55 °C × 30 s和72 °C × 60 s的35个循环，最后扩展为72 °C × 5分钟
检查是否存在310 bp扩增产物的存在，该产物对应于被抗CD40 siRNA特异性切割的CD40 mRNA。
使用20 μ升在1％溴化乙锭的PCR产物进行分析，溴化-染色的琼脂糖凝胶通过电泳与相应的DNA分子量标记物。

siRNA处理的动物肾脏病变的组织学评估。
在本节中，我们将准备肾样品为标准组织学分析（在石蜡中包埋），免疫荧光分析（OCT），以及蛋白质和RNA分析（存储在RNA stabiliz通货膨胀溶液）。

要求：一个在部分D2，手套，冰得到的肾脏-冷的1 × PBS，组织模具和盒，镊子，石蜡，石蜡分配器，冷板，PS缓冲液（见ř ecipes），15％小号ucrose，4％多聚甲醛（PFA），OCT，干冰，RNA stabiliz通货膨胀试剂，高-密度聚乙烯（HDPE），50％乙醇，70％乙醇，96％乙醇，无水乙醇，去离子水（中号IL升的iQ或类似的），切片机。

用于标准组织学分析。
除去肾的上三分之一，以确保两个皮层和近髓质肾小球存在并固定在5ml缓冲液PS的片在4 ℃下进行24 - 48小时。将薄页纸放入带标签的盒中（使用铅笔，因为溶剂会溶解墨水），并准备进行石蜡包埋。

浸盒在宽-嘴高-密度聚乙烯（HDPE）1大号罐填充有15％蔗糖24在石蜡块中嵌入前小时。
浸在50％乙醇2 - 3天。
浸在70％的乙醇对一个最小的3小时（但可维持高达至7天）。
浸入96％乙醇中过夜。
浸入无水乙醇中至少3小时。
用清除剂（洗涤二甲苯）为在室温下1个小时。
在60 °C下执行第一个石蜡整夜。
执行第二石蜡在60 ℃下为最小的3小时。
P花边在熔融石蜡少量模具（分配从一个石蜡容器）。用温暖的镊子，转移的组织进入模具切割面朝下，因为它是放置在盒中。
传送所述模具到冷板并轻轻按下的组织平面。石蜡将在薄薄的层中固化，从而固定组织位置。
当组织处于所需方向时，将标记的组织盒作为衬板添加到模具的顶部。用力按。
将热石蜡从石蜡分配器添加到模具中。可以肯定的是有足够的石蜡覆盖塑料盒的脸。如有必要，请在纸盒用石蜡一边冷却，一边保持模具全固体为止。
石蜡solidif IES在30分钟内。石蜡块然后可以被移除和部分编。如果蜡裂纹或组织不能很好对齐，再次融化他们，并开始了。组织块可以在室温下保存多年。
使用切片机（Leica RM 2155）切片组织。
打开水浴，检查温度是否为45 °C 。使用1升新鲜的去离子水，并从猪皮中加入1克果冻（G1890，Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国密苏里州）。放置在切片机新鲜叶片（叶片可被用于以部分最多10块，但如果切片成为问题替换）。刀片应与5 °成d角。到被分段的块被面朝下放置为约15分钟冰块上（冷蜡允许较薄部分）。切后亭，使用镊子拾取部分的色带和它们漂浮在水浴中的水的表面上，以允许对所述样品的膨胀。
插入块与蜡块FAC切片荷兰国际集团的叶片，并对准垂直平面。拨盘设置为切口10 - μ米区段中以平面中的块; 一旦切割顺利，设置为2 - 3 μ中号厚的部分。通过将其切至所需的组织平面面向块，并丢弃石蜡带。
如果块状条带扎好，则再切成四部分，用镊子或细油漆刷将其捡起，然后将其漂浮在45 °C水浴中的水面上。将这些部分漂浮在干净的玻璃载玻片表面上。
如果色带不能很好地条带化，请将其放回冰块上冷却更长的时间以硬化蜡。
如果在放置标本支离破碎我n中的水浴中，那么它可能是太热了。
放置变暖块上的载玻片在一个60 ℃的烘箱中10分钟（因此蜡开始熔化）至键的组织到玻璃上。载玻片可在室温下保存过夜。
用于免疫荧光分析。
将肾脏的另一极放入组织霉菌中，涂上华侨城（OCT），然后将其放在干冰上冷冻。储存在-80 °C 。

P花边少量熔融OCT的（吨在问题冷冻培养基，徕卡价= 14020108926，徕卡生物系统公司，里士满，IL）模具。
使用镊子，转移的组织的模具，切割面朝下。
P我们的液氮2在以聚苯乙烯盒含有50 -毫升管架（不不在液氮淹没管架2 ）。放置OCT模具上的管架和FR EE泽使用的蒸汽。
用箔纸包裹，并在液体N 2中速冻，直至在-80 °C下储存。
用于蛋白质和RNA提取。
代替3- × 2毫米3个肾皮质的成0.5 -毫升的塑料管中并咬合在液氮中冷冻2 。储存在-80 °C 。对于长期储存的组织进行RNA提取，放置在在RNA稳定试剂和存储的五个卷组织在-80 ℃下。

在IgG和C3存款的直接免疫荧光分析的肾脏。
要求：OCT包埋肾样品，手套，冰-冷的1 × PBS，低温恒温器，聚-L-赖氨酸-包被的载玻片（默克KGaA公司，CATA登录号：P0425）。或FLEX IHC显微镜载玻片（安捷伦，参考K8020，圣克拉拉，CA，USA），4％PFA（见ř ecipes），丙酮，封闭溶液，缀合的初级抗体（FITC缀合的山羊抗小鼠IgG，FITC缀合的山羊抗小鼠C3），UltraCruz的Tm米ounting米edium ，和DRAQ5。

准备用于免疫荧光分析的肾脏玻片。
切片前，将包含冷冻肾脏的OCT复合模具（D3部分）在-20 °C下放置2 h。确保将肾脏的[切开]表面小心地靠在OCT模具的底部，以使组织切片方向正确。
使用低温恒温器切断为5μm厚的切片，并将它们聚-L-赖氨酸的表面上-包被的载玻片或FLEX IHC显微镜载玻片上。确保其没有褶皱或孔在组织部分，其可以变形的组织形态。作为IF阳性对照，使用人腮腺或神经节样本; 和作为阴性对照，省略了第一抗体从染色处理。对于同种型对照，使用相同同种型，物种的无关免疫球蛋白，和浓度作为初级抗体。
当从低温恒温器去除，保持在室温下20分钟，然后固定该滑动通过浸没入冰冷的纯丙酮20分钟。
洗的用100μlPBS载玻片3次为每次10分钟。
洗的载玻片两次用蒸馏水对每次5分钟。
将玻片在封闭溶液（20％正常山羊血清的1 × PBST + 0.2％的猪皮果冻中）中于4 °C孵育过夜。
洗的用100μlPBS载玻片3次为每次10分钟。
在含有1％正常血清的PBST-果冻缓冲液中，将这些切片与一抗（FITC偶联的山羊抗小鼠IgG以1：300和FITC偶联的山羊抗小鼠C3在1:50）孵育。孵育的载玻片为1个在室温下H以加湿室中以避免所述组织变干，其中W乌尔德导致非特异性结合和高背景染色。
洗的载玻片3次，在PBS中为每次5分钟。一抗可以保存用于后续实验。
安装在带安装介质一滴样品含有1微克/毫升DRAQ5。

在CD40表达的分析的与辣根过氧化物酶（HRP）的免疫染色肾脏。
要求：G爱，石蜡块，高压锅，计时器，1 × PBS，0.01 M柠檬酸盐缓冲液（pH 6），PBS中的1％Triton X-100、0.1％鱼胶，牛血清白蛋白（BSA），二甲苯，无水乙醇，初级抗体（最佳稀释度和温育时间应被确定为使用之前每一级抗体），生物素化的第二抗体（135 μ升正常血清+ 45 μ升生物素化的二级抗体来自ABC染色ķ它在10毫升PBS），加湿室，ABC（一和素-生物素复合物）过氧化物酶的标准染色试剂盒（制备使用前试剂30分钟），DPX封固介质，DAB底物。

对照：P rep单独用稀释剂（不含抗体）作阴性对照，用已知含有目的抗原的组织作阳性对照。

准备用于HRP分析的肾脏玻片。
Deparaffinize的从样品小号通过执行标准二甲苯-乙醇洗涤挠度D5。
洗的载玻片3次，在1％PBS对于每次5分钟。
阻止与甲醇洗涤（30％甲醇的PBS内源性过氧化物酶活+ 1％过氧化氢）为10分钟。
注意：将幻灯片放在平坦的表面上。不要让该幻灯片互相接触。不要让这些部分变干。

洗三次，在1％PBS对于每次5分钟。
促进抗原修复通过加热的高压锅的样品上5分钟（在塑料机架幻灯片）含有10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6，这将破坏福尔马林固定后蛋白质交联。
让其在室温下缓慢冷却30分钟。
在1％的Triton X-100的PBS（PBST）洗涤两次对于每次5分钟。
为了最大程度地减少交叉反应并减少由疏水相互作用引起的非特异性结合，请在4 °C下与PBS-Triton + 0.2％的果冻中的20％正常山羊（NGS）或马血清预孵育2 h。用轻快的动作从滑片上清除多余的液体，并仔细擦拭各个滑片。
;与第一抗体孵育（抗NF-抗CD40以1/100，抗-DC-SIGN在1/50 κB在1/1 ，000）在1％正常山羊血清。在每个玻片上加100 µl，覆盖组织切片；吨ILT每个载玻片从一边到另一边。在湿度箱中于4 °C孵育过夜。
在室温下保持30分钟。
在1 × PBST中洗涤3次，每次5分钟。
加入100 µl生物素化的二抗（以PBST-jelly中的Vectastain ABC试剂盒的浓度为1/200 + 1％NGS ）。在室温下在加湿室中孵育至少45分钟。在该步骤期间，建议制备底物混合物（试剂A =一个维丁+试剂B = b iotinylated HRP）。
在PBST中清洗3次，每次5分钟。充分洗涤以除去痕量叠氮化钠，因为这将在显影时抑制过氧化物酶的活性。
加入底物混合物，比例为1/100，孵育45分钟。
在PBST中清洗3次，每次5分钟。
用PBS洗涤3次，每次5分钟。
孵育所述组织部分小号与在黑暗中3分钟或直至所需的50微升矢量DAB底颜色时监测反应观察下的显微镜。通过用洗瓶中的蒸馏水轻轻冲洗，终止反应，然后在阴性对照中出现背景染色。在相应的收件人中释放DAB。所有的塑料制品而来的对与DAB的接触必须用稀释的漂白处理。
用自来水冲洗5分钟。
用蒸馏水洗涤。
用苏木精复染：
加入苏木精（1份苏木精溶液+ 2份蒸馏水）。
用自来水清洗5分钟。
用蒸馏水洗涤。
用70％乙醇洗涤5分钟。
执行三次洗涤用96％乙醇对每次5分钟。
用无水乙醇进行洗涤三次为每次5分钟。
执行洗涤三次用二甲苯对每次5分钟。
用DPX挂载。
显微镜检查：
切片应由两名不知情的病理学家独立检查，每个肾脏切片至少应有10个视野在高放大倍数下进行研究。

确定肾脏损害的程度。驴小号狼疮性肾炎的典型肾小球活性病变：肾小球系膜扩张，毛细血管内增殖，肾小球存款，外毛细管增殖，和间质浸润; 以及肾小管间质性慢性病变：使用Carl Zeiss AG（德国Oberkochen ，德国）的Zeiss SteREOLumar V12显微镜观察肾小管萎缩和间质纤维化。级的病变半定量使用评分系统0〜3（0 =没有变化，1 =轻微，2 =中度，3 =重度变化）。
孔定量泰特的数量使用半研究了每种标记物的阳性细胞-表达的定量评价从0到4（0 =没有染色，1 =在该样品的<25％染色，2 =在25染色- 50％， 3 =染色在50 - 75％，和4 =在75染色-在肾（肾小球，容器的不同隔室100％），和间质）。NF κB位于细胞核内，当P65免疫染色阳性。

在米粥样硬化病变的评价乌斯主动脉。
要求：ApoE基因- / -小鼠中，异氟烷室，清扫工具（剪刀：直钝-ended剪刀，直锋利细剪刀，和微-解剖弹簧剪刀;组织钳：直锯齿-尖镊子，直的或弯曲锯齿-尖端细钳子，和直细-尖镊子），注射器，23 G和27个针头，管（一个EDTA涂覆的试管中，血清管，以及两个锂肝素包被的管），冰-冷的PBS，去离子水，RNAzap ， 70％的乙醇，冰，液氮2 ，显微镜，软木床，钉扎床，针，手术刀，ö IL ř编ø ，minutien引脚0.1 -毫米，培养皿，6 ×放大倍数的显微镜。

检查整个主动脉长度中ATH病变的扩展。
用异氟烷对小鼠进行安乐死。
用70％的乙醇喷洒每只小鼠，以免污染样品。
切除整个主动脉（根据Centa等人的方法修改，2019年）并准备用于显微镜分析的样品：
用剪刀从颈状切口切开至耻骨。
通过穿过胸壁的心脏穿刺使小鼠放血（使用23 G针）。此过程通常会产生500 μ升从血液一个20周龄的小鼠。收集4个管（一个EDTA涂覆的试管中，血清管，以及两个锂肝素包被的管）。将其保持在室温下。
打开腹腔。用剪刀在中线和两侧横向切开腹膜腹膜。
打开隔膜和胸腔（尽可能从侧面切开肋骨保持架）。
在右耳中切开切口，以排出灌注液。通过心脏的心尖插入一个27号针的颅方向。保持固定在左心室，同时缓慢用10ml冰冷的PBS灌注针在一个最小的2分钟。
解剖的肝脏，脾脏和肾脏。
切开心脏右侧的气管和食道，而不会损坏主动脉弓。切割膜片和结构附连到内脏的腹膜后。离开的心脏，主动脉，和肾脏原位。折叠起来肺和内脏尾端和盖用餐巾纸开始的腹膜后显微切割的腹部大动脉（下进行显微解剖一个在6显微镜×放大率）。
解剖主动脉分叉（解除了与钳在张力下周围组织和用剪刀剪）。颅骨解剖腹部主动脉。切的从主动脉腹部分支和通过隔膜主动脉裂孔近侧释放主动脉。
去除覆盖胸主动脉的脂肪组织。仔细解剖胸腺背侧，以释放带有分支的主动脉弓。继续在胸腔内尽可能向远侧解剖颈动脉。颈部解剖应包括颈动脉分叉。
在切断主动脉之前，先在去离子水，RNase净化溶液，70％乙醇和PBS中依次冲洗，以清洁仪器。
用镊子将心脏提起。切开靠近心脏的主动脉，然后将整个心脏放入装有PBS的试管中。的心脏可以被存储在冰上几个小时之前continu ING与处理和低温安装的主动脉根部。
在含有1 ml 4％甲醛的试管中于4 °C过夜，将主动脉弓和花边切成两半。
解剖剩余降主动脉，p花边在管，并在液氮中冷冻单元2用于RNA分析。
将心脏放在软木床上，使腹侧朝上。用针头穿过顶端将心脏固定在软木塞上。用解剖钳固定心脏的底部。切去两个心房之间的心脏的心尖2/3用手术刀（倾斜20 °在矢状面和尾部20 °颅在横向平面）。
将主动脉根嵌入OCT化合物中（请参阅F节）。将标本保存在80 °C的拉链锁袋中，直至进行冷冻切片。
“ ê的N面”分析了主动脉弓和braquiocephalic动脉。
清洗从剩余的外膜周的脂肪组织的主动脉下一个显微镜（因为油红O污渍最疏水的和中性脂质如甘油三酯，甘油二酯，和胆甾醇酯，这是至关重要的在这一点上，以除去所有这样的组织）。使用剪刀和镊子，不要操纵或损坏主动脉。始终在需要时通过使用额外的PBS来保持主动脉湿润。
放置在清洁和固定主动脉一个1.5 - ml管（每管一个主动脉）。
向每个试管中加入1 ml 78％的甲醇，并在倾斜的滚筒上轻轻移动5分钟。更换甲醇溶液，然后重复此步骤两次。
丢弃甲醇，并加入1毫升新鲜的Oil RedO 。
孵育倾斜辊上的管50 - 60分钟。
转移主动脉干净的管中并用1ml 78％的甲醇洗两次，每次5分钟的翻转机罗尔ř 。
丢弃甲醇，并用1 ml PBS重新填充试管。
注意：如有必要，在此步骤中，主动脉可以保存在4 °C下。

准备一个钉扎床：将25片× 25毫米石蜡的蜡膜，包裹着黑色电人绝缘胶带，在软木床，以便为主动脉一个黑暗的背景。在固定床的背面放置一个标签，并使用一支铅铅笔写下鼠标的识别号（正常的笔墨水会在染色过程中消失）。
将固定的主动脉弓转移到固定床上，并在上面放一滴PBS。
除去外来脂肪的任何少量残留的染色剂（通过显微镜检查仔细观察）。
纵向切开主动脉以暴露内膜表面。引进一对微的尖端-解剖弹簧剪刀到动脉腔和从上升拱到左锁骨下动脉切开主动脉弓的外曲率。开始削减外上升圆弧的曲率在所述远侧方向和继续切开分支，包括头臂动脉。Ç ontinue到沿胸主动脉的长度切断。
切开较小的曲率，然后折叠打开主动脉以显示内膜表面。
使用Minutien昆虫图钉的钝端将打开的拱形图钉在固定床上。到位后，将插销轻轻弯曲，使其远离样品。将主动脉平放在床上，而不拉伸标本。将固定的弓形朝下存放在4 °C的装有PBS的培养皿中。
采集我法师用Zeiss steREOLumar连接到RGB相机V12显微镜（PROGRES CF扫描）。将标尺放在主动脉旁边以校准图像。
孔定量泰特atherosclero的延伸抽动斑块。
使用图像分析软件（ImageJ的），以确定所述损伤面积和总内膜表面。大号esion孔定量吨通货膨胀应执行以盲方式，并且它是可取的第二研究者确认š结果。

计算拱的总面积：在ImageJ中，选择“多边形选择”工具，然后通过重复单击来包围拱的总面积。在选择“度量” ANALY ž ê菜单显示在结果窗口中的总足弓部位。
计算无病变区域：在ImageJ中，选择“徒手选择”工具，并在按住Alt键的同时将所有斑块（橙红色染色）包围在拱形区域中。单击“度量” ANALY ž ê菜单显示了在结果窗口中自由病变区域。
计算的通过减去无病变从总足弓区域和分割结果相对病变区域由总足弓区域。
主动脉根的冷冻切片。
在-20设置在低温恒温器温度℃，并且截面厚度〜10 μ米。将包含主动脉根的OCT b锁安装在标本架上，并使心室组织朝外。在开始切割时，微调-调整截面表面的对齐方式，使其平行于样品架。
删除了周围多余的华侨城，使其更容易收集的部分无褶皱。主动脉根应垂直于刀片放置。
收集普通显微镜载玻片上的初始对照切片并丢弃。第一部分应仅包含心肌组织。进度由200切片μ米。收集切片并在光学显微镜下检查进度。
当越来越接近左心室流出道，检查每100 μ米的显微镜下。当观察到血管壁的初始指示，放慢步伐〜50 μ米。当第一个主动脉瓣出现时，这将是收集部位的零点。可能很难准确地看到瓣膜何时出现，但是准确的定位对于在相同区域进行病变比较至关重要。
将样品向零位阀倾斜，以使剖面与其他两个阀对齐。这是获得真正的跨至关重要-主动脉的部分。使主动脉根的图，表示阀，因为它们出现，并且计数每10 - μ是m部分被切断从点零向前。当出现第二个主动脉瓣膜时，再次从瓣膜上稍微倾斜样品以使样品与第三个瓣膜对齐。从第一主动脉瓣小叶出现在主动脉瓣叶的所有3出现在距离一起不超过80 μ米。前5 - μ微米厚部分与3个主动脉瓣叶被安装到载玻片上。相邻的8个部分（包括第一个部分）被一个个地收集到8个载玻片上，并按从1到8的顺序进行标记。第9个部分被收集到第一个载玻片上，第10个部分被收集到第二个载玻片上，依此类推类推，直到每个的8个载玻片š保持8个部分。在8个收集在每个载玻片上的冷冻切片覆盖的400的距离μ米。
将收集的切片在4％甲醛中固定用于油红O染色10分钟，并用冰-冷的纯丙酮固定10分钟以进行免疫组织化学或免疫荧光分析。在室温下干燥30分钟。存储的部分在-20 ℃下。
捕获的直接图像使用一个Ñ RGB相机（PROGRES CF扫描）附接至光显微镜（Nikon E800）。保存高分辨率图像，最好以标记图像文件（TIFF）格式保存。
使用ImageJ进行形态学图像分析。
病变孔定量吨通货膨胀应执行以盲方式，并且最好是使第二研究者证实了获得的结果。

使用面积孔定量牛逼通货膨胀功能在图像分析软件通过环绕主动脉血管的外弹力层定义总的血管面积。在ImageJ中，选择“多边形选择”工具，然后通过重复单击来包围区域。该ñ在选择“测量” ANALY ž ê菜单。总血管面积显示在结果窗口中。
继续孔定量泰特的ATH病变在容器的内膜层，由内弹性层和管腔边界限定。通常，将主动脉瓣上的病变排除在测量范围之外。在ImageJ中，选择“徒手选择”工具，并在按下Alt键的同时将所有斑块包围起来。在选择“度量” ANALY ž ê菜单显示在结果窗口中的无病变血管面积。
通过减去总血管区中的自由病变区域和分割结果计算相对病变区域由总血管面积。根据放大率校正在图像分析软件的结果，以便用得到的在绝对病变区域微米2 。

数据分析

胆固醇缀合的，特异性的抗CD40的siRNA显示出有效的转染效率d endritic Ç厄尔（DCS），而不降低细胞活力（评价通过碘化丙啶）。这里，我们证明CD40表达的抑制和亚细胞轨迹莉莎和灰抗- CD40-siRNA转澈在DC的细胞质在45分钟后转染（Ripoll会面等人，2013 ）。5'RACE证实了CD40 mRNA的siRNA切割的特异性。

（在沉默实验Ripoll会面。等人，2013 ），（由证实我们首先成熟的DC用LPS的增加CD40，CD80 ，和CD86细胞表面表达如通过流式细胞术测量的），并转染它们与抗- CD40-siRNA转澈，这引起了35％在CD40的表达降低为与加扰控制，以及在TNF释放的显著相比减少 α，MCP1 ，与IL6。此外，增加LPS CD40 mRNA表达几乎20倍（在所述肾）和35倍（在所述肝脏）与比较在上午对照水平乌斯模型。CD40 mRNA表达回到基线后24小时的肾脏和后48在肝脏小时。单个抗- CD40-siRNA转澈给药65％和60％降低肾和肝CD40 mRNA表达，分别，3天为与对照值相比，具有效果持续长达5天。

（在狼疮性肾炎模型Ripoll会面。等人，2013 ），Cy5.5标记的抗- CD40-siRNA转澈被定位在从肾小管细胞的肾脏（图1）。在这种疾病模型，我们研究的抑制作用抗- CD40-siRNA转澈对动物的生存，肾功能，炎症介质，抗DNA antibod Ÿ水平，以及肾脏病变。对于这些实验，将小鼠分布在给五组中的一个进行不同的处理：

CYP组（n = 9）：50mg / kg的我.P 。每10天CYP
CTLA4组（n = 9）：50微克IP CTLA4（ORENCIA，阿巴西普，Bristol Myers Squibb的，Uxbridge的，UK）每周三次
抗- CD40-siRNA转澈-1W组（n = 9）：50微克IP 。抗- CD40-siRNA转澈每周一次
抗- CD40-siRNA转澈-2W组（n = 8）：50微克IP 。抗- CD40-siRNA转澈两次一个星期
对照组（n = 15）：50微克腹膜内。SS -对照的siRNA澈两次一个星期

图1.在狼疮性肾炎模型，Cy5.5标记的抗- CD40-siRNA转澈被定位在从肾小管细胞的肾。A.孔定量牛逼的肾脏内的通货膨胀哲-siRNA给予我。v 。/我。p 。在狼疮小鼠中。B.代表肾显微照片（× 400）：1）b ASAL自发荧光; 2）我。v 。行政; 和3）我。p 。行政。数据表示为四个独立实验的平均值± SEM。* P <0.05 vs.基础。doi：10.1371 / journal.pone.0065068.g005。

动物存活（通过Kaplan - Meier法）为100％的CYP，CTLA4 ，和CD40-2w基; 随访结束时，CD40-siRNA-1w组为88％，未治疗组为73％。与siCD40-2w处理的小鼠显示蛋白尿或蛋白尿没有增加并显示一个剂量依赖性降低在总IgG，抗dsDNA抗体，以及所有的IgG级分。该升的IgM，IgA的的evels ，和IgE的，以及促炎细胞因子例如IL2，TNF，IFN γ ，MCP1 ，与IL6 ，也减少了在该抗- CD40-siRNA转澈-2W基。使用0到3的评分系统对组织学病变进行半定量评分（对照组= 8 ± 1.5; CYP = 4.3 ± 1.1 ; CTLA4 = 1.6 ± 0.7; 抗- CD40-siRNA转澈-1W = 3.8 ± 1.5; 抗- CD40-siRNA转澈-2W = 1.6 ± 0.6），以及IgG和C3肾小球沉积物在所有治疗组（图减少小号2和3）。抗- CD40-siRNA转澈-2W组显示出一个不存在的额外的毛细血管增生，间质浸润，肾小管萎缩，和间质纤维化。除siCD40-1w外，所有治疗组小管间隙中的CD3 +浸润细胞均显着减少。此外，肾脏表达水平的CD40，C3（局部补体合成的体现）的，以及促炎细胞因子瓦特ERE减少在抗- CD40-siRNA转澈-2W小鼠（图4）。另外，显著减少在CD40蛋白表达在间质，肾小球中观察到，和肾脏血管隔室和在所述circulati上中抗CD40-siRNA转澈-2W基。

最后，我们使用CD40沉默策略来降低atherosclero的进展抽动（ATH）病变的ApoE - / -小鼠（Hueso等人，2016 ）。我们分布在小鼠中，以8个治疗组：

基础B / 8w（n = 5）
ss- control siRNA Chol / 10 w（n = 5）
ss- control siRNA Chol / 24w（n = 5）
加扰的寡核苷酸对照SC / 14w（n = 5）
一个nti - CD40-siRNA Chol / 10w（n = 5）
一个nti - CD40-siRNA Chol / 14w（n = 5）
一个nti - CD40-siRNA Chol / 24w（n = 10）
车辆（n = 5）

与油红染色整个主动脉的“前位”分析Ø证实，ATH斑块面积的数量和延长反下降- CD40-siRNA转澈/24瓦特与比较控制值。少F4 /是在血管壁检测从抗80浸润巨噬细胞- CD40-siRNA转澈/24瓦特动物，这表明对于CD40在巨噬细胞的斑块的募集的作用。最后，NF-少κ乙+抗内膜检测细胞- CD40-siRNA转澈/24瓦特小鼠，这表明CD40沉默的保护作用可以通过NF-介导κ乙信令。由于策略旨在到全身烯丙基silenc ê CD40 ，在CD3的脾种群的减少+ CD40 + （T淋巴细胞）和CD11b + CD40 + （单核细胞）的细胞中观察到在抗- CD40-siRNA转澈/24瓦特动物，这表明在粥样硬化病变的减少中号AY与抗炎机制在血管壁相关联经由全身效应。

图2. Histopat ħ ological病变的由CD40的siRNA沉默狼疮性肾炎模型。A.共刺激封锁减少ð狼疮性肾炎病变。乙。代表性的显微照片（× 200）的各组肾脏的组织学。数据是快捷ED作为该平均值± SEM。* P < 0.05，与。未经处理，P < 0.01vs 。未经处理。doi ：10.1371 / journal.pone

图3.免疫组织化学分析的肾IgG和C3中的由CD40的siRNA沉默狼疮性肾炎模型。肾IgG和C3的A.存款孔定量达ED通过共聚焦显微镜（MFI）。所有治疗均减少了肾小球沉积。B.代表p C3沉积物（的hotomicrographs × 630）为每个组。数据表示为在平均值± SEM。* P < 0.05，与。未经处理，P < 0.01vs 。未经处理。doi：10.1371 / journal.pone.0065068.g006 。

图4.全身循环炎性细胞因子和局部CD40免疫染色。A.狼疮性肾炎促进了CD40的表达中的血清; 这种免疫调节蛋白在所有疗法中都减少了。狼疮肾炎也引起其他炎症细胞因子的增加; 具有抗治疗- CD40的siRNA降低了其中的一些。B.免疫定位和孔定量吨在不同肾隔间的CD40蛋白质的通货膨胀; Chol-siRNA降低CD40表达，尤其是在间质细胞和血管中。数据表示为在平均值± SEM。一个P < 0.05，与。未经处理 B对。CTLA4 ; ÇVS 。CYP ; 和d比。siCD40-2w。doi：10.1371 / journal.pone.0065068.g007。

菜谱

退火b uffer 10 ×
1的1M Tris-HCl（pH 7.5）中5米升

5M的NaCl 2米升

DEPC处理过的水43米升

经DEPC处理的水
二pirocarbonate （DEPC）0.1％1米升

蒸馏水1 ，000米升

拌匀，并留在室温下1个小时

高压釜

使用前让其冷却至室温

1 M Tris-HCl，pH 7.5
Tris 121.14克

蒸馏水800米升

调整的pH值至7.5用浓HCl的适当体积

带来的终体积为1 l在去离子水

12％丙烯酰胺凝胶
对于15米升，足以让一个13厘米× 15厘米× 0.75毫米厚凝胶：

10 × TBE 1.5百万升

40％的丙烯酰胺（丙烯酰胺：双丙烯酰胺= 29：1）4.5米升

蒸馏水和去离子水9 m l

搅拌混合，将n添加：

10％过硫酸铵150 μ升

TEMED 15 μ升

简单地混合加入最后2种成分后，倒了立即凝胶

非-变性凝胶缓冲液
蔗糖50％

溴酚乙LUE 0.25％

二甲苯氰0.25％

PBS中的4％PFA溶液
注意：甲醛是有毒的

要求：手套，防护眼镜，˚F UME罩

地方PBS 1 × 800米升在搅拌盘上的玻璃烧杯中在通风橱
在搅拌的同时加热到60 °C （注意不要沸腾）
加40克低聚甲醛粉
通过从移液管中逐滴加入1 N NaOH缓慢提高pH值，直到溶液澄清为止
冷却溶液并过滤
用1 × PBS将溶液的体积调节至1 L
重新检查pH值，并用少量稀盐酸调节至6.9
溶液可以等分并冷冻或在2.8 °C下保存长达一个月
0.1 M柠檬酸盐储备缓冲液，pH 6
蒸馏水800米升

柠檬酸（MW = 192.1 g / mol）11.341 g

柠檬酸钠（MW = 294.1 g / mol）12.044 g

调节的溶液，以在利用HCl或NaOH最终所需的pH

加蒸馏水至1 ，000毫升

在室温下储存（保质期长达3个月）

0.01 M柠檬酸盐缓冲液
0.1 M柠檬酸盐缓冲液100 ml

蒸馏水至900毫升

完整Ç ulture米edium
RPMI 1640培养基500毫升

100U / ml的p enicillin

100 μ微克/毫升小号treptomycin

2 M L-谷氨酰胺

10％的热量-灭活并过滤的FBS

20 ng / ml GM-CSF

0.3％的油红Ø小号滴答小号olution
油红O 0.3克

异丙醇99％100毫升

将溶液在56 °C溶解1小时

用Whatman No.1滤纸过滤溶液并保持在4 °C

该解决方案稳定1年

油红O工作溶液
在通风橱中准备

股票小号olution 60毫升

蒸水40毫升

用Whatman 1号滤纸过滤溶液

溶液稳定时间不超过2小时，使用前必须准备15分钟

磷酸盐缓冲小号艾琳（PBS），pH 7.5中
0.1M的p hosphate

0.15 M氯化钠

PBS-Triton（PBST）
海卫一X 2毫升

PBS 1 ，000毫升

PBST /果冻

猪皮果冻0.1克

PBST 50毫升

PS缓冲
福尔马林10％200毫升

水，质量中号IL升的iQ或类似200毫升

热60 - 70 ℃下

加入1粒NaOH

在水中冷却至24 °C

加入37.5克D +蔗糖

加入2mL的0.5M EDTA和2.5ml BHT（b utylated hidroxytoluene ）

用1 M NaOH调节pH到7.4

添加的MilliQ水至500ml和FILT ER使用滤纸与介质滤过率粒子保留的10 - 20微米

二抗（1：200稀释）
抗体0.5 μ升

血清Ñ ormal克燕麦（或马）20％1 μ升

PBST /果冻98.5 μ升

血清正常山羊或马20％
从正常山羊或马血清20 μ升

PBST / 80果冻μ升

致谢

这项研究是部分由资助研究所德Salud的卡洛斯三世（通过共同出资的通过项目欧洲区域发展基金。ERDF，一个方式来构建欧洲）PI11 / 00556，PI14 / 00762 ，和PI18 / 01108和REDinREN （12 / 0021）。我们感谢REDinREN和CERCA程序/ Generalitat德加泰罗尼亚机构支持。

利益争夺

没有利益上的冲突。

伦理

该实验按照动物实验与欧盟法律进行，分别由CEEA批准：动物实验伦理小号委员会，制度伦理委员会UB动物研究。

参考

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