材料和试剂

1. 3.15％葡萄糖酸洗必泰和70％异丙醇棉签（PDI，目录号：S40750） 2. 8周大的C57BL / B雄性小鼠 3. USP异氟烷（Patterson兽医，目录号：14043070406） 4.干冰（或液氮） 5.丁丙诺啡（帕特森兽医，目录号：07-892-5235） 6. 3-0 PROLENE ® polyprorylene缝线（Ethicon的，目录号：8665G） 7. 10％福尔马林溶液（Sigma，目录号：HT501128） 8. HistoPrep TM 70％乙醇（Fisher Scientific，目录号：HC1500）设备

直径5毫米的不锈钢金属棒（Uxcell ，目录号：UX657206）
注意：该米等人杆应当选择，以便其直径以匹配上课肌肉大小。检查和测量肌肉和的大致宽度Ë nsure该杆的直径比所有经历冷冻损伤动物的肌肉的宽度小。

手术剪刀和镊子（Roboz Surgical Instrument Co ，目录号：RS-5910； Symmetry Surgical，目录号：30-1185 ）
不锈钢手术刀，＃15（赞成医疗保健，目录号：MDS15215）
动物剪（肯特科学公司，目录号：CL7300）
玻璃瓶（Fisher Scientific，目录号：03-339-26A）
光学显微镜（奥林巴斯，目录号：UCMAD3）
Shandom切片机（Thermo Scientific ，目录号：A78100001K）
软件

ImageJ（国立卫生研究院，http://imagej.nih.gov/ij）
GraphPad Prism版本9（GraphPad软件，https : //www.graphpad.com ）
程序

冷冻伤
手术前要对手术器械和金属棒进行消毒。
使用异氟醚麻醉小鼠。
使用限幅器的整个腿清除头发和皮肤消毒前向的与感兴趣的肌肉氯己定和酒精棉签（图URE 1步骤3）。
使用无菌技术，使皮肤和肌肉筋膜的切口，并使用外科剪刀或暴露下面的肌肉一个解剖刀（图URE 1步骤4a和4b）。
注意：皮肤切口的大小应根据所使用的肌肉和金属杆的尺寸来调节（参见图1小号TEP图4a ）; 它必须允许皮肤缩回足够宽，以使切开的皮肤边缘不会碰到金属棒。这通常需要一个切口，在纵向方向上的肌肉的跨度超过80％，与所述切口对齐的与下面的肌肉的中心。

冷却在干冰金属棒5分钟，擦拭用的氯己定和酒精棉签杆小号，并应用金属棒的平坦端至肌肉对的给定时间量的中心（参见图URE 1个步骤5 ）。
注：规范大小的维持伤害持续时间的与杆的接触不断。调节持续时间，以实现所述injur的期望程度ÿ 。建议在伤后10 d内持续5 s进行组织学评估；10个小号建议用于评价14 - 21D伤后。可能需要进行初步研究，以为您的动物模型和研究设计确定最佳的冷伤害持续时间。

缝合皮肤和肌肉筋膜关闭使用切口3-0 PROLENE ® polyprorylene缝合（图URE 1步骤小号6a和6b）。
提供了适当的术后镇痛动物，雅阁荷兰国际集团以相关指引，并仔细LY和定期LY OBSERV Ë他们手术后至少48小时。
例如：每12小时皮下注射0.05 mg / kg丁丙诺啡48小时。

图1.使用冷却的不锈钢金属棒诱导冷冻伤。诱导后用足够的麻醉的动物，冷冻损伤可通过以下步骤来造成：切除的皮肤在整个腿（3）的毛发和灭菌，肌肉的曝光（4a和4b），所述冷却的应用金属棒覆盖肌肉（5），并闭合皮肤切口（6a和6b）。

B.肌肉收获

根据机构指南对小鼠实施安乐死。
注意：颈椎脱位是euthan的优选方法中定义的成年小鼠以最小化e的结束之间的时间uthanasia和肌肉收获。

在皮肤上打开先前的切口，并在腱鞘处从肌腱上去除受伤肌肉的整个长度。
将肌肉放入玻璃瓶小瓶中的10％福尔马林溶液中。
48小时后，用70％的乙醇代替福尔马林，以备将来切片，并将样品保存在室温（RT）下，避免阳光直射和暴露在热源下。
创建五个6-8微米厚的石蜡包埋的受伤部位在载玻片上的横截面使用切片机。
按照标准程序进行苏木精-伊红（HE）染色。
C.组织学评估在光学显微镜下，确定可通过位于中心的细胞核识别的再生肌纤维。避免计算多核肌纤维（绿色箭头）和炎性细胞（红色箭头）（图2）。
取高倍视野图像（在使用20 ×或40 ×目标的建议）跨越整个损伤坐即
使用I mageJ或等效软件，每个样品测量总共至少1,000条不同的再生纤维的横截面积（CSA）。
图2.鉴定HE- stain横肌切片中的再生肌纤维。A.再生的肌纤维（黄色圆圈）通过位于中心的核（黑色箭头）与周围的成熟肌纤维区分开。在损伤后第5天（DPI 5），具有位于中心的核的再生肌纤维在炎性病灶中（红色箭头）（A）。B.损伤后第10天（DPI 10），再生的肌纤维已经形成了组织结构，其炎症浸润明显减少。这两个图像都是8周大的C57BL / B雄性小鼠胫前肌的图像，造成了5 s的冷冻损伤。比例尺= 100μm 。

数据分析

计算的CSA至少1 ，每个样品000不同的再生纤维。创建用于各种纤维尺寸的频度分布的列联表（图3A）（100微米的步骤2的所有样品的被推荐用于足够的统计分辨率）和绘制平均频率或频率直方图百分比的组的频率（图2B）。计算给定组的每个样本的平均CSA （图2C）。使用不成对的执行统计分析在S tudent的吨-test或单因素ANOVA来评价组间统计学显著变异的存在。数据可以表示为均值±标准差（SD）或均值标准误（SEM），并且显着性可以设置为P值<0.05。

图3.数据分析和表示。A. Ç含有每1000种的肌纤维的数量ontingency表不同再生纤维具有的横sectio纳尔面积（CSA）的给定范围内。的范围内通过100微米分离2个步骤在该实施例中。B. ħ istogram示出的平均百分比不同的肌纤维的频率CSA的范围7个样品。C. ģ拉夫的平均肌纤维的平均值和标准误差的CSA的7个样品。

致谢

该方案源自“骨骼肌中ARNT的丢失限制了衰老过程中的肌肉再生” （Endo等人，2020年）。这项工作由美国国立老龄研究所（IS-K76AG059996），美国糖尿病与消化及肾脏疾病研究所（AJW的P30 DK036836），格伦医学研究基金会（AJW）和研究与教育委员会拨款资助（IS）来自美国国家老龄研究所（Boston Claude D. Pepper Center）的支持（P30AG031679至SB）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

所有动物手术均已获得布里格姆妇女医院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并在美国国立卫生研究院（NIH）的指导下进行。IACUC批准ID：2016N000375，有效日期为2020-2023。

参考

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