材料和试剂

显微镜载玻片75 × 25 × 1 mm（VWR，目录号：16004-368 ）
玻璃盖玻片18 × 18毫米1.5号（VWR，目录号：48366-205）
自粘增强标签（每个，目录号：32203）
注射器5 ml（BD，货号：309603）
18 G或更低的针（BD，目录号：305195）
解剖针（Fisher Scientific，目录号13820024）
培养皿100 × 15毫米（VWR，目录号：25384-088）
培养皿35 × 10毫米（Corning，目录号：351008）
p {w ^ + ，SGS3-GFP} （布卢明顿果蝇库存中心，目录号：5884，5885 ）或p {w ^ + ，SGS3，红色荧光蛋白} （安德烈斯实验室，内华达大学拉斯维加斯分校，美国）3届龄幼虫
高真空M润滑脂100克（Apiezon ，Sigma，目录号：Z273589）
移液器吸头（P200）
SYLGARD TM 184硅胶弹性体套件0.5千克（Dow Chemical，Sigma ，目录号：4019862）
氯化钾（Sigma，目录号：P3911-500G）
氯化钠（Bio Basic，目录号：CA99501-558）
氯化钙2· 2H 2 O（Sigma，目录号：C-5080-500G）
Tris-HCl（VWR，目录号：0234-1KG）
果蝇林格氏液（见配方1）
小号ilicone夹层板（见配方2 ）

设备

杜蒙＃5细钳（Fine Science Tools，目录号：11251-20）
体视显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica MZ6 ）
旋转盘共聚焦与Olympus IX81显微镜（Quorum Technologies，Puslinch ，安大略省，加拿大）

软件

Volocity 6.3（Quorum Technologies，Puslinch ，ON，加拿大）
Adobe Creative Cloud Photoshop（Adobe，美国加利福尼亚州圣何塞）
Microsoft Office 365 Excel（Microsoft，美国华盛顿州雷德蒙德）

程序

解剖和样品制备
选择3次龄用解剖针和徘徊幼虫转移到35 -毫米培养皿果蝇林格的r溶液。用细镊子握住幼虫，并在果蝇林格氏液中旋转，以洗净任何食物。3 RD龄幼虫徘徊是那些从食品源移开; 吨哎可以容易地定位在小瓶或瓶子壳体苍蝇的一侧。
注：我t是最好挑选幼虫还在移动，并有留在肠道的食物。如果果蝇食品食谱中包括糖蜜，则可以通过幼虫中间的深棕色轻松识别出肠道中的食物。否则，也可以在果蝇食品中添加食用食用色素，以帮助在正确的阶段识别幼虫。停止运动或肠道内没有食物的幼虫准备进行化ari。因此，它们的分泌颗粒将被分泌出来，并且在确定分泌颗粒大小时将无用。

将单独的干净幼虫用细镊子转移到硅胶解剖板上的果蝇林格氏溶液（50μl ）的液滴中。
在幼虫下用细镊子解剖幼虫。用不占优势的手用镊子轻轻按住幼虫，以固定幼虫。用惯用的手捏住幼虫的嘴钩，然后拉动以除去唾液腺。
使用镊子将多余的组织从唾液腺中清除（图1A），并如图所示安装样品（图1B和1 C ）。

图1的安装果蝇大号arval小号alivary ģ土地用于大号香港专业教育学院中号icroscopy。A.用10倍物镜拍摄的幼虫唾液腺（半透明）和伴随的脂肪体（不透明）的DIC图像。B.将幼虫唾液腺安装在带有自粘增强标签的显微镜载玻片上。C.用真空油脂将幼虫唾液腺安装在显微镜载玻片上。

使用自粘增强标签安装样品快速且一致（图1B，第6步）。但是，为防止缺氧，如果需要更长的成像时间（> 30分钟），则应使用真空油脂安装样品（图1C，步骤7）。
P花边在显微镜载玻片一个自粘标签加固。确保该标签完全粘附在幻灯片。移取8 µl果蝇林格氏液到标签中间。将唾液腺转移到溶液中（每个标签3-5对唾液腺）。P花边上盖玻片并密封与快干滑动ING指甲油。样品最长可使用30分钟（解剖时间为10分钟）。
分配真空润滑脂成5 -毫升注射器。使用小口径的针。通过使用注射器在显微镜载玻片上画一个正方形来分配真空润滑脂。留一点缝隙，不要完成正方形。移液器30微升果蝇林格氏液中的广场中央。将唾液腺转移至溶液中（最多8对）。P花边上盖玻片并轻轻向下推用细镊子，直到真空润滑脂密封样品。密封采用快干幻灯片ING指甲油。样品最长可使用50分钟（解剖时间为10分钟以下）。

影像学
将幻灯片转移到旋转盘共聚焦显微镜的阶段。
在采集模式下打开Volocity 6.3。图像样本与所述60 ×物镜。使用对应设置获取图像中的用于SGS3-GFP或SGS3-DsRed的绿色或红色通道，分别。
以每片0.3 µm的量捕获Z中的20 µm 。为每对腺体成像至少三个代表性细胞（图2）。

图2.分泌ģ ranules的果蝇大号arval小号alivary ģ土地。果蝇幼虫唾液腺细胞的一个Z切片的代表性旋转盘共聚焦图像，表达分泌颗粒标记Sgs3-DsRed。

为每种基因型至少成像三个独立的腺体。

数据一nalysis

孔定量牛逼通货膨胀和统计分析
在分析模式下启动Volocity 6.3。打开通过采集保存的文件。创建用于解卷积的点扩展函数（PSF）文件（“操作”>“新建”>“计算出的PSF…” ）。输入与采集设置相对应的值（图3A）。

图3. Volocity 6.3中的反卷积。A.用于在Volocity 6.3中创建新点扩散函数文件以对来自红色通道的数据执行反卷积的设置。可能需要针对其他设置调整值。在这里，由于我们系统中使用的检测器将图像进一步放大了1.5倍，因此物镜放大倍率提高了1.5倍（从60 ×到90 × ）。B.反卷积的数据将在Volocity 6中被列为新通道。3 。

对获取的数据运行反卷积（“工具”>“迭代还原” ）。设置的置信限至99％，并且所述迭代限制到30，一种新的信道（去卷积的数据）将在右侧面板（图3B）来生成。
将Z堆栈拆分为单个图像（工具>拆分卷，选择将图像组织到文件夹中；图4A）。包含两个子文件夹的新文件夹将在左侧面板中生成（图4B）。对第二个子文件夹中的反卷积图像执行分析。

图4 。拆分V olumes。A.分割卷功能可以将原始数据和解卷积后的数据的Z切片组织到不同的文件夹中。B.分割音量功能后，在Volocity 6.3左面板上创建的图像文件夹。

选择第一张图像（z = 1），然后转到“测量”选项卡。将“查找对象”和“分离触摸对象”任务拖到屏幕顶部的“测量协议”面板中（图5）。确保两个任务都在相同的协议下，仅生成一组测量值。
点击旁边的齿轮图标在找对象的功能。对于“阈值” ，使用下拉菜单，选择“自动” 。在“偏移阈值依据”字段中，输入-10％。在最小对象大小字段，输入4微米2 。按确定。下的单独的触摸物体的功能，输入12微米2的对象大小引导场（图5）。此设置适用于野生型唾液腺中的分泌性颗粒。该值需要调整为具有非常大或非常小的分泌颗粒的基因型。

图5.测量分泌颗粒的功能。屏幕快照显示了协议，该协议包含Volocity 6.3中的“查找对象”和“单独的触摸对象” （左上方）。通过阈值设置“查找对象”功能的设置（右下）。

点击测量从步骤4和5，检查所产生的作用下强度和V olume测量，然后按OK。所标识的对象将以在步骤4和5（图6A）创建的协议中选择的颜色进行概述。对象列表应填充在右下方的面板中（图6B）。可以保存该功能（Measurements>保存协议… ），然后再恢复该功能（Measurements> Restore Protocol ... ）。

图6.测量分泌颗粒的大小。A.使用步骤4-5中所述的方案，紫色概述的分泌颗粒（红色）。B.分泌颗粒横截面积的输出。

转到对象列表。在双击区（微米2 ）选项卡，直至对象按照大小降序排列。选择所有不包括所述数据的那些是小于4μm 2 。复制数据并粘贴到Excel 365中以进行统计分析。
对于z = 10和z = 20重复步骤4-7，以说明整个细胞中分泌颗粒横截面积的变化。如果保存了测量协议，则可以通过第6步中描述的Restore Protocol…功能来避免步骤4-5 。
对来自同一唾液腺的三个代表性细胞重复步骤4-8 。
对于每种基因型，对三个独立的唾液腺重复步骤4-9。
合并Excel 365中每个基因型的所有数据。
箱形图（插入>插入统计图>箱形图和晶须图）可用于通过横截面面积可视化分泌颗粒大小的分布（图7）。

图7.显示分泌颗粒大小分布的箱形图。野生型唾液腺中按横截面积的分泌颗粒大小分布。从底部到顶部的盒子的每一行代表的25个，50个（中位数），和75个百分点的人口。X表示样品的平均值。底部和顶部晶须代表由1.5 ×四分位间距确定的最小值和最大值。晶须之外的点是被视为统计异常值的样本。n = 3597个唾液腺细胞的分泌颗粒横截面（每个细胞3个Z切片，总共9个Z切片）。

吨-Test（数据>数据分析> t-检验：双样本异方差假设）可用于评估统计学差异在分泌颗粒横截面面积两种基因型之间。

菜谱

果蝇林格氏液（pH 7.2）
KCl 182 mM
氯化钠 46 mM

CaCl 2 · 2H 2 O 3 mM

Tris-HCl 10毫米

硅胶解剖板
混合基料和固化剂从所述（1：1，10 SYLGARD 184套件重量：重量）直接在100 -毫米P用刮刀ETRI菜。所有程序均应在通风橱中进行。
允许到通风柜内固化48小时。

致谢

该协议改编自我们先前的工作（Ma等，2020）。我们认可以下资金来源：SickKids Restracomp学生奖学金，加拿大卫生研究院战略培训奖学金＃TGF-53877，多伦多大学开放奖学金和加拿大自然科学与工程研究理事会研究生奖学金–博士生奖学金（对马成一教授）；加拿大卫生研究院拨款＃PJT-162165和＃MOP-119483以及加拿大卫生研究院遗传研究所＃IG1-115714（授予Julie A. Brill）。

利益争夺

没有竞争利益可以宣布。

参考

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