材料和试剂

1.一次性手套（Kimberly-Clark，目录号：52816）

2.广场P ETRI菜ES与电网（Simport科学，目录号：D210-16）

3.培养皿ES （ASNOL，目录号：GD90-15）

4. 1.5 ml 管（Trefflab，目录号：96.07246.9.01）

5.一次性手术刀No.11（KAI，目录号：511-A）

6.一次性滴管2毫升（Maruemu，目录号：0806-03）

7.滤纸No.1，70 mm（ADVANTEC，目录号：00011070）

8. H ybond-N+ 膜（GE Healthcare，目录号：RPN119B）

9.解剖针

10.手术胶带（3M，目录号：1530-0）

11.铝箔（UACJ）

12. KimWipe s （CRECIA，目录号：S-200）

13.拟南芥种子

注意：必须使用新鲜种子。为了成功的微嫁接，需要在同一发育阶段的接穗和股票。旧种子在种子萌发和随后的生长时间上表现出变化，阻碍了嫁接的建立。我们主要使用拟南芥生态型 Col-0，但也可以使用其他生态型。

14. Murashige-Skoog 培养基（Duchefa Biochemie，目录号：M0221）

15.蔗糖（WAKO，目录号：190-00013）

16.琼脂粉（Nacalai tesque，目录号：01028-85）

17. MES水合物（Sigma-aldrich，目录号：M2933）

18. 76.9 - 81.4%（v/v）乙醇（KANEICHI，目录号：4987556210311）

19.氢氧化钾（WAKO，目录号：168-21815）

20.漂白剂（KAO，目录号：017598）

21. 1 N KOH（见食谱）

22. 1％琼脂板小号（见配方）

23. 2％琼脂板小号（见配方）

24. Hybond-N+ 膜（GE Healthcare，目录号：RPN119B ）

25. 0.4% 琼脂用于重新悬浮灭菌种子（见配方）

26.滤纸（见食谱）

27.消毒水（见食谱）

28.漂白溶液（见配方）

29.消毒种子（见食谱）

设备

pH计（HORIBA，目录号：F-51）
移液器 P20（INMEDIAM，目录号：FA10003P）
中号icrografting芯片（生物医学科学公司，目录号：BGA-GRC 020 ）（图1）
注意：我们使用微移植芯片作为一次性的。购买的芯片经过消毒，打开包装后即可使用。

超净区创建器（Koken，目录号：KOACH T 500-F）
解剖显微镜（OLYMPUS，目录号：SZX10）
精密镊子（Inox-biology，目录号：11252-00）
Vannas弹簧剪刀（Fine Science Tools ，目录号：15019-10）
植物生长室（Biotron，目录号：LPH-411S）
生物净化台 (AIRTECH, BLB-1306)

程序

注：所有的程序U唱显微镜应进行下无菌条件下小号。我们使用超级洁净区创建器 KOACH T 500-F (Koken)，提供过滤空气流（图 2A）。一个生物洁净工作台可以替代它。在所有程序中，实验者必须戴上手套，并通过用 70% 乙醇饱和的薄纸擦拭对所有设备和区域进行消毒。

的，因为它是难以进行无菌条件下接枝的情况下，所述蔗糖含量的的琼脂培养基需要小号减少到0.2％或更小。即使是难以制备完全无菌条件小号，种子消毒，擦拭设备用乙醇，和清洁实验空间尽可能仍然优选的。

A.小号EED消毒

P花边几十种子到1.5 - ml管，重悬在1ml 10％的漂白剂溶液（有效的氯浓度为0.6％）5分钟，和洗涤用1毫升无菌水5次。
灭菌后，悬浮的种子在0.4％琼脂，并放置在黑暗中，在4℃下至少三天播种前，但不超过1的一周。
注意：要同步种子发芽的时间，在 4°C 下孵育三天以上很重要。

B. 播种（第 1 天）

将 1% 琼脂平板置于室温下。
将H ybond-N+ 膜与其垫分开，并将膜放在 1% 琼脂板上（图 2B）。
将几个微移植芯片放在膜上。
将种子（在4°C 下在 0.4% 琼脂中分层超过 3 天）播种到种子袋上，然后使用移液器 P20 将 0.4% 琼脂装入袋子和根路径（图 2C）。
步骤s B 4 - B 6 a在视频1 中进行了演示。

注：为了避免混淆，在为接穗和股票的种子必须进行播种分别在不同的芯片。

视频1.在微移植芯片上播种

覆盖与芯片的芯片盖（图2C）。
将芯片直立放置在膜上（图 2B）。
用手术胶带密封板。
用铝箔包裹盘子。
注：为了确保在苗黄化获得，双重包裹板。否则，一个光的裂纹将防止所述被黄化苗和子叶不能通过微路径通过在阴气p期间我ncubation。

孵育在22所述板℃下在生长室中约48 - 58小时。
注意：从小号TEP小号乙7至乙9，小心处理板; 不要放下筹码。

图 2. 微移植程序概述。一个。用于微移植的工作台。乙。播种后将微量嫁接芯片置于 1% 琼脂培养基上。一个盘子上最多可以放置 10 个芯片（40 个幼苗）。Ç 。微移植的步骤。在第1天的红色箭头表示端移液器吸头用于种子播种。第 3 天的黑色箭头表示在黑暗条件下孵化的幼苗的钩子。比例尺：500 µm。

C.转移到光照条件下（第3天）

从生长室采取板和解开的铝箔。
将板置于22 °C 下连续光照约 48 小时。
注：由于发芽的定时和所述的发芽拟南芥幼苗生长速度依赖于种子的新鲜度，遗传品系，与实验环境条件，它对于每个实验者来发现最佳潜伏期是重要的暗imnitially观察的黄化的生长幼苗。当钩子经过第二根顶柱时，是为幼苗打开箔纸的最佳时机（图 2C ，第3天）。在我们的例子中，我们打开了盖子的菜时间和观察到使用植物生长立体ü的nDer无菌条件。更实际地，我们也观察到与幼苗生长的裸眼。由于种子萌发和定时幼苗的生长速度变化苗中，箔片应在添去除Ë当所述的的“多数”的钩子的幼苗被第二顶支柱传递如上所述。在我们的例子中，我们获得了大约60 - 90％的幼苗长出荷兰国际集团在嫁接正确一步。等待缓慢-育苗不建议，因为剩下的幼苗下胚轴将拉长太多。作为揭开箔的最佳时机的另一个指标，我们使用了从芯片顶部出现的子叶。当我们看到一对情侣在黄化苗的菜开始以扩大其在芯片上面子叶，这是很好的时机。如果你看到没有任何的苗木出现荷兰国际集团从芯片，再覆盖板和延伸的孵化。

D.微移植（第5天）

经过四天的孵化（两天在黑暗中，两天在光明中），幼苗穿过芯片，子叶在芯片上扩展，如图 2C，第5天所示。

注意：以下程序必须快速执行以避免干燥；每个芯片5 分钟内。干燥，特别是在移植物交界处，显著阻碍移植建立。

将 2% 琼脂平板置于室温下，并在其上放置H ybond-N+ 膜。
笔记：

的2％琼脂板用于进行后-接枝生长吨ö防止过高一个在板的湿度。
Hybond-N+ 膜用于避免根在培养基中生长并使移植变得容易。在我们的测试š几种过滤膜时，的Hybond-N +和硝酸纤维素滤膜没有抑制植物生长。
P花边高压灭菌的滤纸到P ETRI菜和微湿纸与使用处置滴管（图3A）灭菌水。使用前，清洗滴管内几次用无菌水。
注意：过量的小号水抑制移植建立。将R的水ecommended量为约1.1 -每滤纸1.2毫升。

Ť转让（BOT）的芯片到湿的滤纸上并放下它（图3B）。
ř EMOVE芯片盖（图3B，视频2）。
注意：Chip c overs 将不会在以下过程中使用。

视频2.去除芯片盖

˚F或步骤D5 - D10 ，该程序示于视频3。

V IDEO 3.微嫁接procedu重

切割沿狭缝胚轴使用的一次性外科手术刀对股票和接穗份（图的制备的尖端小号3C和3 d）。
笔记：

一把锋利的手术刀对于成功的嫁接至关重要。如果手术刀很钝，请使用新的；Ô therwise，变形的切断端引起由钝手术刀将标志着编LY减少显微移植的成功率。
如果幼苗没有很好地固定在芯片中，请用镊子将下胚轴轻轻推入微路径，然后进行嫁接。
对于股票准备，删除其切割拍摄（图 3C）。
拿起接穗，一拍，从芯片通过抓住之一的子叶瓦特第i个精密镊子，并将其转移到库存放置上另一芯片（图小号3C和3 d）。
注意：不要抢接穗强行用的镊子。大的损伤导致嫁接失败。

通过轻触接穗和库存来调整它们的位置（图对准接穗与股票的用镊子的胚轴小号3C和3 d）。
如果需要，除去水绕所述接枝结使用扭曲金W¯¯ IPE。
注意：嫁接幼苗表面的残留水分，特别是在嫁接处，会抑制嫁接形成并增加不定根形成的频率。在这里，没有必要覆盖嫁接植株带芯片盖，因为它保留的移植结潮湿，抑制移植建立。

将芯片竖直放置。
Ť转让（BOT）的芯片小心到在2％琼脂制备板的膜在小号TEP D1 ，以使得接枝的植物不对齐。
用手术胶带密封板。
在连续光照条件下，将板置于 27°C 的生长室中四天。
注意：在这种情况下的光强度是在生长室高，盖上金板W¯¯ IPE到强度和减小的光损伤降低至嫁接苗。在我们的例子中，我们将生长室设置在 100 - 140 μmol·m -2 ·s -1连续光照条件下，并用一张 Kimwipe 覆盖板，将强度降低到6 0 - 80 μmol·m -2 ·s -1 。

图 3. 微移植。一个。用于微移植的工作台设置。1、解剖显微镜一台；2、一个n个LED灯；3、灭菌去离子水一瓶；4、解剖针一根；5、精密镊子；6、蒸压滤纸一张；7、一个培养皿；8、一次性手术刀一把；9、一次性滴管一支。乙。在（顶部）和过程中（底部）去除芯片盖之前的微移植芯片。Ç 。详细程序用于在第一天显微移植步骤5.比例尺：500μm左右。d 。显微移植程序的插图。

E.去除不定根（第9 天，嫁接后 4 天）

不定根经常出现在接穗下胚轴上。以下步骤旨在去除它们，我们强烈建议执行这些步骤，因为不定根会阻碍嫁接形成。

注意：以下程序必须快速执行以避免干燥；每个芯片5 分钟内。

从生长室中取出板，用乙醇和纸巾擦拭表面进行消毒。
将板放在立体显微镜下并打开盖子。

˚F或小号TEPS E3到E5，这些过程被示在视频4。

视频4.从接穗中去除不定根

大号AY的显微移植芯片向下使用是否在接穗的胚轴形成不定根镊子和检查。
我˚F不定根正在生长的接穗，切割和除去它们使用Vannas弹簧剪刀或粉碎他们与尖端的镊子（图4A）。
P蕾丝显微移植片直立。
用手术胶带密封板。
将板包裹在Kim W ipe 中，以保护嫁接植物免受强光照射，并将它们放置在 27 °C的生长室中，连续光照两天。

F.将嫁接的植株从微嫁接芯片中拔出（嫁接后第11天，第6天）

离开的在室温下的新的1％琼脂平板上。
从生长室中取出板，用乙醇和纸巾擦拭表面进行消毒。
将板放在立体显微镜上并打开盖子。

˚F或小号TEPS F4到F 6 ，该过程在视频5中示出。

P ULL从显微移植芯片嫁接植株小心使用解剖针或镊子。

V记意5. Ť他吨移植植物的转让（BOT）到一个新的板

观察嫁接的植物。如果您在接穗中看到不定根，请使用Vannas弹簧剪刀或镊子将其移除。
将嫁接的植物转移到新的 1% 琼脂板上 (图 4B)。
用手术胶带密封板。
在连续光照下将板垂直放置在 22 °C的生长室中。

G.移植物建立的确认（移植后第15 天、10 天）

如果您在砧木上观察到健康的根生长和接穗上的真叶扩张而没有进一步的不定根形成（图 4C），则判定嫁接已建立，嫁接的植物可以转移到土壤/培养基上进行后续实验。

图 4. 在移植物建立之前执行的程序。一个。嫁接后4天、去除不定根前后的嫁接苗。箭头表示出现的不定根的位置。乙。嫁接后第6天嫁接幼苗。成功的移植物被转移到一个新的板上。星号表示移植失败。Ç 。嫁接后第10天的嫁接苗显示出真叶和根的旺盛生长。比例尺：500 µm (A)；1 毫米 (B) 和 (C)；5 毫米。

数据分析

我们描述了我们的微移植芯片的协议。我们曾经报道过使用我们的芯片微型嫁接成功率约为48 - 88％（筒井等，2020），而这个成功率承担与日相比较于在传统的显微移植方法拟南芥（特恩布尔等人。2002; Yin等人，2012 年；Marsch-Martí n ez等人，2013 年）。使用该系统，我们通过测试的接枝条件的影响和投资证明芯片的效用IGAT荷兰国际集团的使用突变体品系的基因的作用（筒井等人。，2020）。

笔记

在将嫁接植物从芯片中拔出之前的所有过程中（嫁接后第 11 天，第 6 天），平板应始终保持水平并小心处理以防止将微嫁接芯片放下。
要获得通过显微移植芯片的微路径生长的幼苗，请使用足够长的大种子。为了得到良好的生长大尺寸的种子，种子繁殖植物必须与要生长充足的水，服务，以形成一个坚固的根系统和厚茎。拟南芥在干燥条件下生长良好，而不是在潮湿条件下。此外，继续浇水，直到大部分种子都是成熟; o否则，会形成未成熟的种子并在种子库中混合。
当s Ó瓦特荷兰国际集团在种子口袋种子，完全填充的空间中的口袋和用0.4％琼脂的根路径。太少一个的0.4％琼脂的原因不完全供给幼苗生长，并且t ○○多一个的0.4％琼脂诱导浮置的种子供应小号覆盖时从袋与一个芯片盖。
有时 0.4% 的琼脂会变成固体。0.4%琼脂经高压灭菌，室温搅拌冷却后，即为液态。如果0.4％琼脂仍变为固体时，可以使用后搅拌或REDUC荷兰国际集团的琼脂浓度。
有时，由于幼苗生长的力量，芯片被抬起或向后落下。在这些情况下，根部与培养基分离并且幼苗生长被阻止。此外，牛逼他下胚轴开始向micropath由向地外弯曲。这些幼苗不适合嫁接。如果芯片只放置很短的时间并且没有此类问题，则可以继续进行嫁接程序。
芯片盖应与微移植芯片上边缘的线对齐。移除芯片盖时，幼苗可能会通过将自身附着在盖上而从微移植芯片上脱落。为避免这种情况，请从一侧轻轻取下芯片盖。即使我˚F幼苗COM ë断，对花边胚轴放回芯片的micropaths并执行接枝。
为了减少损失，以苗，尽量不给碰下胚轴，特别是在移植区不拔苗。当操纵和调节苗，抢的位置的仅一个的子叶，钩与所述镊子的幼苗或轻推苗来调整它们的位置使用镊子的侧面，而不是尖。
嫁接后，接穗有时漂浮由于静电Ø ñ的P ETRI菜肴和连接到盖子。这样的接穗是无法恢复的。为了避免这些事故的发生，是有效的清洗了使用前用无菌水的盖子里面。

食谱

1 N 氢氧化钾
将 2.8 g 氢氧化钾溶解在 50 ml 去离子水中。

1% 琼脂平板
溶解2.3克Murashige-Skoog培养基，将5g蔗糖，在1份去离子水和0.5g MES水合物。
使用1 N KOH将pH 值调整为 5.7 。
甲DD 10克琼脂粉末和高压釜。
冷却介质到约60 ℃，并倒33毫升在一个正方形下AB培养皿IO-洁净工作台。
以除去过量的水分从所述板，干燥它们30 - 45分钟，其盖半开。
这些板可以在 4 °C下储存长达1个月。
2% 琼脂平板
溶解2.3克Murashige-Skoog培养基，将5g蔗糖，在1份去离子水和0.5g MES水合物。
使用1 N KOH将pH 值调整为 5.7 。
添加20 g 琼脂粉和高压釜。
冷却介质到约60 ℃，并倒33毫升在正方形P下AB ETRI盘IO-洁净工作台。
以除去过量的水分从所述板，干燥它们30 - 45分钟，其盖半开。
这些板可以在 4 °C下储存长达1个月。
Hybond-N+ 膜
切的Hybond-N +膜进入正方形的约 1厘米× 3厘米且p花边它们放入一个玻璃P ETRI菜。然后，对膜片进行高压灭菌，并在 60°C 的烘箱中干燥过夜。

0.4% 琼脂，用于重新悬浮灭菌种子
将 0.4 g 琼脂粉溶解在 100 ml 去离子水中，并用搅拌棒高压灭菌。冷却蒸压0.4％琼脂至室温瓦特往往微不足道搅拌下，这防止了介质从耶林。

过滤纸
P花边滤纸到玻璃P ETRI菜，高压灭菌它们，然后在烘箱中60℃干燥干燥它们。

无菌水
高压灭菌去离子水。

漂白液
将 1 毫升漂白剂与 9 毫升无菌水混合。此溶液必须在使用时配制，不能储存。

致谢

本程序源自 Tsutsui等人。(2020)。Notaguchi等人先前发表的研究中使用了该协议。(2020) 。这项工作得到了支持日本科学授予在援助科学研究（18KT0040，18H03950的推广，并20H03273）和佳能基金会（R17-0070）至MN我们非常赞赏筒井的所有作者等. （2020年）和Y.袴，M.服部，R.增田，M.石原，一吉川，和A.八木的技术支持。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突有关日是工作。

参考

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