材料和试剂

15毫升锥形底管
DuraSeal实验室薄膜（Sigma，目录号：D3172）
聚丙烯 1.5 毫升管
检测板，96 孔，黑色
分析板，96 孔，透明
PVDF膜（Thermo，目录号：88520）
培养板
雌性和雄性小鼠
PBS 10 × （Apex，目录号：20-134）
葡聚糖（70 kDa的高度吸湿的，应当在保持一个惰性气氛中）（TCI，目录号：D1449）
IGEPAL（Sigma，目录号：I8896）
十二烷基硫酸钠（Sigma，目录号：L3771）
蛋白酶抑制剂混合物（Thermo，目录号：78429）
MilliQ水
BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo，目录号：23225）
甲醇（默克，目录号：1060091000）
氯仿（默克，目录号：1070242500）
Amplex红胆固醇测定K它（Thermo，目录号：A12216）
蛋白质加载缓冲液 4 × （Bio - Rad，目录号：1610747）
2-巯基乙醇（Sigma，目录号：M6250）
Buffer Tris-Glycine 10 × （Apex，目录号：18-238B）
预制 10% 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad，目录号：4561033）
脱脂奶粉
TBST 10 × （Apex，目录号：18-235B）
兔抗 ERG（Abcam，目录号：ab92513）
兔抗PECAM1（Santa Cruz，目录号：sc-1506）
兔抗 PAX6（Millipore，目录号：AB2237）
兔抗TBR1（Abcam，目录号：ab31940）
小鼠抗ACTINB（R&D Systems，目录号：MAB8929）
驴抗兔IGG（Thermo，目录号：A16029）
驴防鼠IGG（Thermo，目录号：A16011）
化学发光试剂盒（Bio - Rad，目录号：1705061）
PBS 1× （见食谱）
18% 葡聚糖（见食谱）
裂解缓冲液（见配方）
运行缓冲液（见配方）
转移缓冲液（见配方）
TBST 1× （见食谱）

设备

Dumont #5 精细镊子（Fine Science Tools，目录号：11251-30）
管杵（Sigma，目录号：Z359947）
CO 2安乐死室
解剖显微镜
冷藏微量离心机
加热块
通风柜
凝胶文件系统

软件

LibreOffice Calc
电阻

程序

胚胎脑解剖
以 2:1 或 1:1 的比例繁殖雌性和雄性小鼠。
每天在光照周期的第一个小时内检查雌性是否存在阴道塞。
用插头将雌性分开，以避免重新插入，并将那天早上注册为胚胎日 (E) 0.5。
在 E15.5 天，按照机构准则对女性实施安乐死。我们结合使用 CO 2窒息和颈椎脱位。见注 1。
取出子宫，将它们放入 PBS 1 × 中，并将每个植入部位分开。应注意保持卵黄囊完整，以尽量减少组织损伤。
在解剖显微镜下，解剖没有胚外组织的胚胎。如果需要进行基因分型，请切下尾巴的尖端或爪子并将其放入管中。见注 2。
使用 Dumont #5 细钳切开胚胎头并剥离覆盖大脑的皮肤和脑膜。参见注释 3 和图 1 。

图1的夹层一个小鼠胚胎大脑。使用 Dumont #5 镊子（左）沿虚线剥去头部皮肤。脑膜层小号覆盖大脑小心地移除以暴露脑（中心，虚线）。从侧面释放轻轻推大脑Ş从头部（右）的整个器官。

通过在颅骨底部切割菱脑并从侧面轻轻推动前脑，将大脑从头部取出。
将大脑放入 1 ml 冰冷 PBS 中的 1.5 ml 聚丙烯管中。

V ascular片段我溶胶化（所有步骤应在冰上进行）
使用无菌 1.5 毫升管杵用五次敲击打乱大脑。
在 4°C 下以 1,500 × g离心20 分钟。
在离心过程中，在 PBS 中准备足够的 18% 葡聚糖溶液，以单独处理收集的每个大脑。
弃去上清液，将沉淀重悬在 500 μl 18% 葡聚糖中。见注 4。
在 4°C 下以 1,500 × g离心20 分钟。
将上清液转移到另一管中。见注 5。
将沉淀重悬在 500 μl 18% 葡聚糖中。
在 4°C 下以 1,500 × g离心这两个级分20 分钟。颗粒是血管碎片。
转移的上清以一个不同的管中，加入1ml的PBS。
将稀释的上清液在4°C 下以 10,000 × g离心10 分钟，然后弃去上清液。颗粒是实质部分。
将血管和实质部分储存在 < -70°C 直至使用。

用于评估馏分富集的蛋白质印迹法
将 100 μl裂解缓冲液直接加入冰上的沉淀中。应当小心，以保持冻结直到沉淀的裂解缓冲液通过保持加入的干冰上或液氮的管。
通过上下吹打来溶解样品，直到溶解物看起来均匀。见注 6。
通过将所有裂解物从第一个管转移到第二个管，池对应于同一样品的相同部分的颗粒。通过移液溶解第二个颗粒。见注 7。
将 10 μl裂解物转移到不同的 1.5 ml 管中进行蛋白质定量。保持在 < -70°C。
对每个要平行分析的样品重复步骤 C1- C 4。始终与实验样品一起处理控制。
将 2-巯基乙醇加入上样缓冲液中，使其浓度为 5%。
将 15 μg蛋白质的等分试样与 1/3 体积的上样缓冲液与 2-巯基乙醇混合，并在 98°C 下加热 5 分钟。
加载到10％聚丙烯酰胺凝胶并运行用于在30的范围内适当的时间来解决的蛋白质kDa的和150 kDa的在运行缓冲液。
在甲醇中孵育 PVDF 膜 5 分钟以进行活化。
在转移缓冲液中以 300 mA 将蛋白质转移到活化的 PVDF 膜中 1 小时。
通过在 5% 脱脂牛奶、0.01% Tween 20 TBS 1 × 中孵育 2 小时来封闭膜。
用在封闭缓冲液中以1:2 , 000稀释的一抗孵育膜。
在 TBS 1 ×中的 0.01% Tween 20 中清洗膜3次，每次 10 分钟。
与在封闭缓冲液中以 1:10,000 稀释的二抗一起孵育。
在 TBS 1 ×中的 0.01% Tween 20 中清洗膜3次，每次 10 分钟。
混合化学发光试剂盒中的溶液并覆盖膜 1 分钟。
在凝胶文档系统中印迹多余的溶液和图像。
的代表性印迹证实了在血管级分，并在实质分数一个神经元祖标记的内皮标志物的富集示于图2 。

图 2. 血管和实质部分的富集。血管 (V) 和实质 (P) 部分中内皮 (PECAM1、ERG) 和神经元祖细胞 (PAX6、TBR1) 标记物的蛋白质印迹分析。请注意，该PAX6信号在血管片段检测，表示脑内皮细胞表达PAX6（瓦苏德万等人，2008）和/或血管粘附神经/神经胶质祖细胞（谈等人，2016）。

脂质提取
将 100 μl裂解缓冲液直接加入冰上的沉淀中。应注意保持沉淀冷冻，直到通过将管保持在干冰或液氮上来添加裂解缓冲液。
通过上下吹打来溶解样品，直到溶解物看起来均匀。见注 6。
通过将所有裂解物从第一个管转移到第二个管，池对应于同一样品的相同部分的颗粒。通过移液溶解第二个颗粒。见注 7。
将 10 μl裂解物转移到不同的 1.5 ml 管中进行蛋白质定量。保持在 < -70°C。
对每个要平行分析的样品重复步骤 D1-D4。始终与实验样品一起处理控制。
在通风橱中，向 90 μl裂解液中加入 400 μl甲醇，然后加入 800 μl氯仿。见注 8。
用DuraSeal实验室薄膜密封管。见注 9。
涡旋每管 1 分钟，使两相混合均匀。
使用加热块或浴在 60°C 下加热 30 分钟。
涡旋 1 分钟。
在 4°C 下孵育过夜以使相分离。
在 4°C 下以 1,500 × g离心20 分钟。
转移400 μl的疏水相（底层）的在至新管。为避免有机相被水相污染，在将空气引入溶液之前，将一些空气推入移液管尖端，然后将其释放到下相的上部。
将 50 μl有机相转移到新管中并在惰性气氛下蒸发。蒸发后，应看不到结晶。应以这种方式为每个样品准备两管，以重复测量胆固醇。

胆固醇测量
准备所有试剂中的Amplex红胆固醇分析ķ它，按照制造商的说明。
将 50 μl反应缓冲液 1 × 添加到含有蒸发有机相的管中。
涡旋 1 分钟。见注释 10。
转移到黑色 96 孔板。
构建以下胆固醇标准曲线的制造商的说明。将 50 μl转移到黑色 96 孔板中。
按照制造商的描述设置反应混合物，并在每个含有样品和曲线的孔中加入 50 μl 。
在 37°C 下孵育 30 分钟。
测量的与在560nm处的激发和发射在590nm的荧光。

蛋白质测量
在冰上解冻的样品等分试样和制备100微升通过添加90 10倍稀释的微升的的MilliQ水到每个管中。
按照制造商的指示，通过稀释 BSA 标准来构建 BSA 曲线。
将 25 μl的每个样品和曲线点转移到透明的 96 孔板中。
通过以 50:1 的比例混合缓冲液 A 和缓冲液 B，为所有样品和曲线准备足够的反应混合物。
向每个孔中加入 200 μl反应混合物。
在 37°C 下孵育 30 分钟。
测量562 nm 处的吸光度。

数据分析

使用所述的LibreOffice Calc软件通过内插到适当的标准曲线来估计每个样品中的胆固醇和蛋白质浓度。这些值对应于 50 μl提取物中的胆固醇含量和 1 μl裂解物中的蛋白质（考虑 10 倍稀释）。
将胆固醇水平乘以 16 以获得 800 μl氯仿中的水平，将蛋白质水平乘以 50 以获得整个裂解物中的量。
将胆固醇水平表示为每微克蛋白质的微克胆固醇，以比较不同的样品。
比较 R 统计环境中的组。两组比较时，进行t检验；如果要分析两个以上的组，请使用带有 Tukey 后检验的方差分析。在图 3 中，我们比较了血管和实质部分中的胆固醇水平。由于两个部分来自同一样本，因此进行了配对t检验。

图 3. 大脑组分中的胆固醇含量。使用基于葡聚糖的离心分离血管和实质部分，并确定每个部分中的胆固醇含量。* P < 0.05；配对t检验。

笔记

E15.5 是该协议在我们手中起作用的最早时间点。这可能是由于该过程依赖于高密度的内皮-周细胞-星形胶质细胞末端复合物，其在 E15.5 左右开始成熟。
由于基因分型无法在短时间内完成，因此所有胚胎都需要进行处理以分离血管片段，即使预计只有部分胚胎具有有用的基因型。基因分型后，我们使用了从与所需的基因型的胚胎样本不排除任何样品。
Ť他最简单的办法就是把侧着脑袋是要抢的正上方推定耳钳一个皮肤，并开始与其他镊子剥离皮肤的其余部分。就在皮肤下方并覆盖大脑的是半透明的脑膜。要移除它们，请用一个镊子小心地夹在前脑半球之间，然后用另一个镊子剥离膜（图 1 ）。
组织看起来呈凝胶状，但均匀分布在葡聚糖溶液中。在我们手中，它看起来更像是匀浆，而不是轻微破碎的组织。
实质部分将保留在上清液中，而血管碎片将被沉淀。应注意尽可能多地恢复实质。
在裂解缓冲液中解冻沉淀后，裂解迅速发生，但在血管部分裂解后可能存在纤维物质。我们将其包含在脂质提取中，但通过离心将其去除以用于其他应用，例如蛋白质印迹。
这种策略用于汇集粒料可以用于在不增加混合几种不同样品的体积; 如果检测方法需要的材料多于从一个胚胎大脑中获得的材料，这将非常有用。当收集样品为新的应用，我们总是使用1个池测试新的测定法- 3个样品，以确定检测极限。在我们手中，来自 1 个胚胎大脑的样本足以用于胆固醇测定和蛋白质印迹。
聚丙烯管可能与氯仿发生反应，尤其是在加热时。如果管子改变形状，应使用小玻璃管代替。在我们手中，聚丙烯管通常能承受此过程的条件，但玻璃管可能更可取。
DuraSeal是一种耐溶剂的封口膜替代品，可防止加热过程中溶剂蒸发。Ť重稀土层应当施加吨ö紧密地密封所述覆盖管帽用薄膜方管和扭曲并回收两次。如果操作正确，倒置试管时不应泄漏氯仿。
定量重悬沉淀的脂质很重要。我们使用了涡旋，但通常使用浴式超声波仪15 分钟。设置此程序时，应测试再悬浮的时间和类型。

食谱

PBS 1 ×
用MilliQ水将100 ml PBS 10 ×稀释至 1 L

18% 葡聚糖
为了准备足够处理一个大脑，将 9 mg 葡聚糖 70 kDa溶解在 500 μl PBS 1 ×

准备足够的体积来处理所有大脑，考虑到 1 毫升的多余体积

裂解缓冲液
50 mM Tris

150 毫米氯化钠

1% 国际环保署

0.1% 十二烷基硫酸钠

蛋白酶抑制剂 1 ×

运行缓冲区
将 100 ml Tris-Glycine 10 ×和10 ml SDS 10% 混合，并用MilliQ水调至 1 L

传输缓冲区
将 100 ml Tris-Glycine 10 ×和200 ml 甲醇混合，并用MilliQ水调至 1 L

TBST 1 ×
用MilliQ水将100 ml TBST 10 ×稀释至 1 L

致谢

NS 由 AHA 博士后奖学金支持 20POST35120371。该协议基于 Boulay等人。(2015) 。

利益争夺

作者声明不存在竞争利益。

伦理

此处描述的动物程序遵循 AVMA 指南，并已获得加州大学旧金山分校机构审查委员会的批准（AN177934 2019-2022）。

参考

Armulik , A.、Abramsson , A. 和Betsholtz , C. (2005)。内皮/周细胞相互作用。Circ Res 97(6): 512-523。
Boulay, AC, Saubamea , B., Decleves , X. 和 Cohen-Salmon, M. (2015)。小鼠脑血管的纯化。J Vis Exp ( 105)：e53208。
Daneman，R.，周，L.，Agalliu ，D.，Cahoy ，JD，Kaushal，A和巴赫斯，BA（2010）。小鼠血脑屏障转录组：了解脑内皮细胞发育和功能的新资源。PLoS一5(10)：e13741。
Gavins , F., Yilmaz, G. 和 Granger, DN (2007)。脑微循环中血细胞-内皮细胞相互作用的进化范式。微循环14（7）：667-681。
Santander, N., Lizama , CO, Meky , E., McKinsey, GL, Jung, B., Sheppard, D., Betsholtz , C. 和 Arnold, TD (2020)。缺乏 Flvcr2 会损害脑血管生成而不影响血脑屏障。J Clin Invest 130(8): 4055-4068。
Tan, X., Liu, WA, Zhang, XJ, Shi, W., Ren, SQ, Li, Z., Brown, KN 和 Shi, SH (2016)。血管对腹侧端脑祖细胞和新皮质中间神经元产生的影响。开发单元36(6)：624-638。
Vasudevan, A., Long, JE, Crandall, JE, Rubenstein, JL 和Bhide , PG (2008)。室特异性转录因子协调胚胎大脑中的血管生成梯度。Nat Neurosci 11(4): 429-439。
Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann , JM 和Decleves , X. (2007)。使用优化的离体大鼠脑微血管策略在血脑屏障上表达药物转运蛋白。大脑研究1134(1): 1-11。
兹洛科维奇，BV（2008 年）。健康和慢性神经退行性疾病中的血脑屏障。神经元57（2）：178-201。