材料和试剂

1.的Whatmann ˚F ILTER p纸张，180层μ米厚度（马歇雷- Ñ AGEL，目录号：742213）

2. 1.5 ml 管（Eppendorf，目录号：22 36 411-1）

3. 50 ml 和 15 ml Falcon 管（Eppendorf，目录号：0030122178 和 0030122151）

4. FastPrep 2 ml Lysing Matrix管（MP Biomedicals ，目录号：115076200-CF）

5. ProbeQuant TM G-50 微型柱 (GE28-9034-08)

6.萨兰W¯¯说唱

7.醋酸薄膜

8.按照制造商的方案在酸中洗涤玻璃珠（Sigma，目录号：G9268）

9. HCl 37%（Sigma，目录号：320331）

10. Pfu DNA聚合酶（Promega ，目录号：M7741）

11. QIA快速PCR纯化试剂盒（Qiagen公司，目录号：28104）

12. QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen ，目录号：28115）

13.酵母DNA Ë xtraction ķ它（热费舍尔，目录号：78870）

14. E.大肠杆菌gDNA的抽行动（见他，2011 ）

15. Hybond -N 膜（Amersham ，目录号：RPN303N）

16. NTP Set 100 mM （Invitrogen，目录号：R0481）

17. Sarkosyl N- lauroylsarcosina （Sigma ，目录号：L5125）

18. DTT（罗氏，目录号：11583786001）

19. α - 32 P UTP（Perkin-Elmer ，目录号：NEG507H001MC，10 µCi/µl）

20.冷MilliQ水

21.酸性苯酚pH 4.3（Sigma，目录号：P4682）

22.醋酸钠（Sigma，目录号：127-09-3）

23. 100％ë THANOL（JT贝克，目录号：8025）

24.氯仿（Sigma ，目录号：C2432）

25. NaOH颗粒（Sigma，目录号：221465）

26.随机h检测器 50 µM （Invitrogen，目录号：N8080127）

27. dNTP s et（100 mM ）（Invitrogen，目录号：10297018）

28.克列诺˚F ragment（NEB，目录号：M0212S）

29. α - 32 P dCTP （Perkin-Elmer ，目录号：NEG513H250UC，10 µCi/µl）

30. NaCl （Labotaq ，目录号：SO0227005P）

31.柠檬酸钠（Prolabo ，目录号：27833.363）

32. MgCl 2 （Prolabo ，目录号：25108295）

33. EDTA（Sigma，目录号：E5134-1KG）

34. SDS（Amresco ，目录号：0227）

35.磷酸二氢钠一水合物（Sigma，目录号：10049-21-5）

36.磷酸氢二钠（Sigma，目录号：7558-79-4）

37.磷酸钾（默克，目录号：1048731000）

38.的Tris b酶（Sigma，目录号：T1503-10KG）

39.硼酸（Panreac ，目录号：131015.1211）

40.酵母ë XTRACT（Pronadisa ，目录号：1702）

41.葡萄糖（Prolabo ，目录号：24379.363）

42.琼脂糖升流EEO（Sigma，目录号：A0576-100G）

43.红色保险箱（Labotaq ，目录号：8014）

44. DNA 1 Kb 阶梯（Invitrogen，目录号：10787-026）

45. DNA凝胶加载染料6 × （Thermo Scientific，目录号：R0611）

46.变性缓冲液（见食谱）

47.中和缓冲液（见配方）

48. SCC 20 ×（见食谱）

49.转录缓冲液 2.5 × （见配方）

50. TES （见食谱）

51.杂交溶液（参见配方小号）

52.洗涤液 I （见配方）

53.洗涤液 II （见配方）

54.中和溶液（剥离）（见配方）

55.剥离液（见配方）

56. 10 × TBE 缓冲液（见配方）

57. Tris-HCl ，pH 7（见配方）

58.磷酸盐缓冲液，pH 7（见配方）

设备

Slot Blot印迹歧管（Hoefer Scientific ，目录号：PR648）
热循环仪（Bio-Rad ，目录号：T100）
纳米d ROP （热科学，目录号：840274100）
Thermoblock加热器 ( Labnet )
真空泵
分光光度计（Eppendorf，目录号：EP6135000923 ）
Falcon 离心机固定转子（Eppendorf，型号：5810R），最大速度 3,220 × g
微量离心机固定转子（Eppendorf，型号：5424），最大速度 17,000 × g
UV交联剂（Stratagene ，型号：UV Stratalinker 1800）
FastPrep-24 TM 5G我nstrument（MP Biomedicals公司，目录号：116005500）
杂交ø VEN（UVP ，型号：HB-1000混杂）
PhosphoImager屏幕和暗盒（FUJIFILM BAS）
STORM-840 成像系统（GE Healthcare）
涡流混合器（Jencons ，型号：VX100），以最大速度使用
盖革计数器（Thermo ，型号：Mini 900）
微波炉
Orbital s haker (Appleton Woods Stuart)，以大约 50 rpm 的速度缓慢摇晃
热火-防护手套
电泳室和电源（Bio - R ad ，目录号：1640300）
凝胶浇铸托盘和梳子（Bio - R ad）

软件

GelQuant.NET 软件 ( http://biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html )

程序

笔记：

程序使用32 P ；适当的设备，设施，以及对放射性工作的培训需要。
处理放射性或 RNA 时应使用过滤器吸头。

整个协议需要 10 天才能完成而不会停止。第m embranes和感兴趣，酵母和DNA片段E.大肠杆菌的gDNA，和酵母细胞沉淀，可以制备和预先存储。市长停止点将在膜制备之后（A）；后标记的RNA杂交，博览会，并扫描（B - d）; 并经过标记的gDNA杂交、展示和扫描 (F)。

准备膜
用 0.1 M HCl处理Slot Blot (SB) 印迹歧管1小时以消除任何污染物。用蒸馏 H 2 O 大量清洗，并在干净的滤纸顶部的通风橱中晾干，以避免污染。
准备与感兴趣的基因相对应的 DNA 片段（即，您要检查的基因正在积极转录并要定量）以加载到膜上：
设计PCR的寡核苷酸，以获得约300的DNA片段碱基是ANALY ž版。
执行应用Pfu DNA聚合酶，以确保DNA产物的保真度的PCR反应（按照制造商的协议）和以获得每单位膜（通常是3-4个50μl的PCR反应进行12膜）100毫微克DNA。模板酵母 gDNA 可以使用试剂盒进行分离。
结合相同的DNA片段的PCR反应中，使用纯化的QIAquick根据制造商的方案PCR纯化柱，并测量了使用DNA浓度Ñ ANO d ROP 。检查的在1％的尺寸琼脂糖凝胶通过加载由测量大约500纳克DNA的Ñ ANO d ROP到连接确保有在没有其他非特异性的条带大小不同的从塔吨EXPE反恐执行（〜300 bp）的。如果有其他条带，您需要执行额外的步骤，通过将所有 DNA 上样到 1% 琼脂糖凝胶上，切割 300 bp 条带，然后使用QIAquick Gel 提取柱进行纯化，以从凝胶中纯化300 bp 条带。
DNA 可在 -20 °C下保存长达1年。
除了你的PCR DNA兴趣，我们建议是您包括其他生物组成的DNA（为阴性对照例如，大肠杆菌基因组DNA）和阳性对照从生物体由基因组DNA的您正在使用（例如，酵母基因组 DNA）。
混合 100 ng DNA和60 μl SSC 20 × （最终浓度为 6 × ），并添加MilliQ H 2 O 至每个样品和膜的最终体积为 200 μl 。
煮沸DNA在95℃下在热块10分钟，并立即p花边冰上。
安装 SB 印迹歧管（见图 1）：
将下部接头连接到真空泵以通过 SB 抽取样品。
将 SB 的中间块放在底部块的顶部，红色橡胶朝下。
在 6 × SSC 中浸湿 11 × 3 cm Whatman并将其放在 SB 的顶部。
小心地将 11 × 3 厘米Hybond N 膜放在顶部，左上角切开以了解膜的方向。
将SB的顶块放在上面，确保SB的数字1和字母A也在左上角，一点一点拧入红色螺丝，确保所有螺丝都同时拧紧时间。小心不要拧得太紧，以免在膜上产生凹痕。
打开真空泵（在最大设置下使用）。

图 1. 标准使用的 Hoefer PR648 Slot Blot (SB) 设置（取自 Hoefer PR648 手册）

印迹：
加入500 μ升6 × SSC至每个孔，并确保液体被正确地通过膜和吸入的Whatmann纸。
等到孔变干。
每个煮DNA样品添加，以前放在冰上，进入分配好，小心不要触及孔的两侧，并等待其干燥。
一旦所有的DNA已通过SB吸入，打开真空泵出并拧开SB。
在变性缓冲液中浸湿12 × 4 cm Whatmann ，小心地将膜放在上面，DNA 朝上。在室温下孵育 10 分钟。
使用中和缓冲液重复前面的过程 (4e) ，但孵育 5 分钟。
将膜放在干燥的Whatmann上并用铅笔标记。
固定DNA通过UV膜-在70000交联μ Ĵ /厘米2 。在Whatmann滤纸之间完全干燥后，膜现在可以储存长达一年。

ñ OTE ：从步骤上B9病房，你需要工作放射性设施。

连续反应：
在 25 - ml YPD 培养物或类似物中培养酵母菌株，直到它们从过夜生长的5 - ml小培养物的稀释液中达到0.5的 OD 600nm 。请确保您有细胞相同体积的整个样本。
离心3 ，220 ×克在室温下3分钟，并弃去上清液。在这一点上，你可以刷冻结你的细胞在液氮中，并存储该粒料在-80 ℃的冰箱中长达1一个月。
准备转录组合：60 μ l转录缓冲液、8 μ l NTP（A、C、G），每个 10 mM ，每个样本3 μ l 0.1 M DTT。不要添加 UTP。置于冰上直至使用。
将细胞沉淀重悬在 5 ml 0.5%肌氨酰中。
离心机中以1 ，800 ×克在室温下3分钟，并弃去的仔细上清液。
重悬在1毫升0.5％的沉淀十二烷基肌氨酸钠和移动到1.5 -毫升Eppendorf管中。
离心700 ×克在室温下4分钟并弃去的上清液用移液管。
离心机的样品再次在700 ×克和RT下搅拌1分钟，以除去任何剩余的上清液。
重悬于60 μ升的MilliQ ħ 2 O和孵育在30 ℃下，直到所述样品是温暖。
将每个样品8 μ l α- 32 P UTP（Perkin-Elmer NEG507H001MC，10 µCi/µl）添加到转录混合物中，并置于 30 °C进行预热。
一旦所述样品和转录混合物是温暖的（30约5分钟℃下），加入79 μ升转录混合到每个样品中并孵育，精确至5分钟，在30 ℃下。为此，最好在样本之间留出 30 秒。
在5分钟后的孵育，迅速加入800 μ升冷的MilliQ ħ 2在冰上O和地方以停止反应。
离心3 ，500 ×克1分钟，在4 ℃下，如果可能的（如果不是，在RT）并弃去上清液。此时，您可以停止并在 -20 °C 下冷冻样品，然后再继续。样品应尽快使用，因为在32 P将随时间衰减。几天内使用。

RNA分离
Ñ OTE：甲市售RNA提取试剂盒可替代地使用。

重悬在400个粒料μ升TES并转移到一个FastPrep管含有400成μ升玻璃珠和400 μ升酸苯酚。
打破所述细胞使用的FastPrep （30级3个循环小号在室温在5米/秒）。
以 16,200 × g离心 5 分钟（如果可能，在 4 °C 下；如果没有，则在室温下）。
将上清转移到Eppendorf管中，并添加400 μ升氯仿。
以 16,200 × g离心 5 分钟（如果可能，在 4 °C 下；如果没有，则在室温下）。
转移的上清液至新鲜的Eppendorf管中，加入1ml的100％乙醇和40 μ升乙酸钠3M pH5.5的。
在-20 °C 下过夜沉淀 RNA 。
第二天，如果可能，在 4 °C下以 16,200 × g离心15 分钟（如果不是，则在室温下）。在此期间，启动预杂交所制备的膜（步骤D1），使得所述标记的RNA可用于立即。
丢弃上清液。
如有可能，用 1 ml 70% 乙醇洗涤，并在 4 °C 下以 16,200 × g离心5 分钟（如果没有，则在室温下）。
丢弃的上清液，然后再次离心和消除任何剩余的乙醇。
干燥的在室温下为丸粒5 - 10分钟。
添加100 μ升的MilliQ ħ 2在65 O和孵育℃（对于约5分钟），涡旋每30级样品小号，直到所有的RNA被重悬。
添加25 μ升的NaOH 0.2N的孵育在冰上5分钟。此步骤片段RNA和帮助小号它到与在膜上的DNA杂交。
中和通过加入25 μ升的HCl 0.2 N.

杂交
通过在65温育预杂交每个膜℃下15内部-毫升猎鹰管含有5为至少1小时毫升杂交溶液（该时间越长，效果越好）。确保将带有固定 DNA 的膜朝试管内部放置，并尽量减少膜的重叠。50 - ml F alcon 管可用于较大的膜，这样它们就不会重叠。对于这一步和接下来的步骤，使用了杂交炉；的猎鹰其中插入玻璃管中，并ROTAT管版。如果你只有几个膜，你可以直接使用玻璃管。确保拧紧盖子以防止泄漏。
一旦 RNA 准备好，丢弃杂交溶液并加入 3 ml 新鲜杂交溶液和标记的RNA。
孵育在65 ℃48 ħ而rotati纳克。
在 4°C 下储存，重复使用或保存标记的RNA。内重用1一周，因为你将失去的信号随着时间的推移。重用时，在加热烘箱中以确保杂交溶液即它液化，。
用 5 ml 洗涤液 I 冲洗膜。将溶液丢弃在适当的放射性容器中。
加入5毫升的新鲜洗涤溶液I和孵育20分钟，在65℃ ，同时rotati纳克。
弃去溶液，加入 5 ml 洗液 II ，65°C 孵育 10 分钟。
重复上一步。
小心取每个膜出的猎鹰管和除去多余的液体用与固定的DNA侧FAC将其放置前棉纸荷兰国际集团在一张萨兰的瓦特说唱。P花边一个预先切割12 ×在上面4厘米酯膜，敷萨兰瓦特周围的膜说唱，确保其被无折痕形成。
P花边的膜包裹在具有富士屏幕的盒并暴露在室温左右72小时（盖革应表明2 -每膜5厘泊）。确保是在DNA -膜固定面朝上，并与屏幕接触。我们建议将薄膜的切边放在左上角。
扫描富士屏幕后，将膜必须剥去和杂交ð与基因组DNA的第二时间来归一化信号。

剥离
孵育在5ml的50mM的NaOH每个膜在15 -毫升猎鹰在45管30分钟℃烘箱杂交内部而rotati纳克。
弃去 NaOH 并在相同条件下再加入 5 ml 中和溶液 15 分钟以中和膜。
将膜转移到单个玻璃托盘上，该托盘可容纳 100 毫升先前在微波炉中煮沸的剥离溶液。操作沸腾溶液时要小心；使用耐热手套。
在室温下在轨道振荡器上以低速将膜在沸腾的剥离溶液中孵育 10 分钟，以确保没有液体损失。
用蒸馏水 H 2 O洗涤膜一次，并在室温下在干净的滤纸上晾干；保存它们或继续下一步。测量膜用盖革计数器，以确保radioactiv Ë信号已经消失。
当他们准备重新杂交，转移剥离膜到新鲜15 -毫升猎鹰管和预杂交（小号TEP D1）。

基因组 DNA 的放射性标记
酵母提取物使用优选的方法（试剂盒可以使用）和稀1基因组DNA μ克在37的终体积μ升的MilliQ ħ 2 O.
煮沸95 5分钟上℃的热块，并立即转移到冰上。加入5个微升随机六聚体，5微升每10毫的dNTP（A，T，G），1微升Klenow酶˚F ragment ，和5微升α- 32 P的dCTP仪（Perkin-Elmer公司NEG513H250UC，10微居里/微升）。
孵育在37 ℃下在45分钟热块。
纯化标记的基因组DNA使用一个ProbeQuant TM下列制造商的方案G-50微柱。
如果要立即使用，将标记的DNA 在 95°C 下煮沸5 分钟；如果不是，则在 -20°C 下冷冻。应尽快使用标记的DNA，因为32 P 会随时间衰减。几天内使用。
获得的标记DNA足以用于 12 个膜。用MilliQ H 2 O稀释获得的 DNA，直到获得每膜20 μl 。例如，如果您有 12 个膜，则需要将 190 μl MilliQ H 2 O 添加到所得的 50 μl标记DNA 中，以获得每张膜20 μl DNA。
加入3毫升的新鲜杂交溶液和20微升稀释标记的DNA与15 -毫升猎鹰含有该膜，在65和杂交24小时℃下。
执行与上述相同的步骤（程序D中的步骤）。
过夜或更长时间暴露在膜根据所获得的信号（48小时，如果盖革表示5 - 10厘泊）。

扫描膜和孔定量牛逼通货膨胀
使用 STOR M-840 成像系统或类似系统扫描Fuji 屏幕。
小心记住薄膜的顺序，不要让富士屏幕长时间暴露在光线下，因为光线会擦除屏幕。
如果观察到的信号不够高，可以将屏幕重新曝光更长时间。
孔定量泰特使用自由GelQuant.NET软件（放射性信号http://biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html）或类似的。
归一化的RNA radioactiv两者均强度与DNA radioactiv两者均强度。

图 2. 典型 TRO 实验的结果。A.标记RNA 杂交后的膜。顶部和底部膜具有交联在其上的相同的DNA片段：所述的几个片段PGAL1-YLR454w基因构建体，正（酵母克d NA）和阴性（E.大肠杆菌克DNA ）控制，和的几个片段GAL1基因。顶部膜与来自 WT 酵母细胞的标记RNA杂交，底部与突变 (Mut) 酵母细胞杂交。本例中的突变体对应于pdf1Δ 。B. A 中显示的相同膜被剥离并与标记的酵母gDNA重新杂交。C.图显示的孔定量吨A和B中所示的结果的通货膨胀

数据分析

STORM 或类似成像系统拍摄的phosphoimages应为 .gel 格式。
首先，我们需要孔定量泰特所述标记的RNA膜（如看到˚F igure 2A），升OAD图像入GelQuant.NET程序（参见图3），并调整通过按压.GEL规模按钮对比度。然后，旋转和CENTE ř使用“旋转90”的图像和变焦按钮。
接着，前进到孔定量泰特周围绘制所讨论的行红色小正方形的每一行。然后，按Ç ONTROL按钮底部面板上，以确保该使用相同的尺寸d广场的所有行，然后按q uantify按钮。一些应出现在右手侧，其对应于孔定量吨的平方减去背景的通货膨胀。我们通常使用自动本地背景选项（右下角），但您可以通过单击手动背景选项来确定自己的背景。
通过拖动固定的红色方块并按下 quantify 在下一行重复此操作；重复，直到你有孔定量达ED各相关线（阳性和阴性对照不需要是孔定量达版，他们只需要可见或缺席，分别）。
在右上角，你会看到对应的音量孔定量一系列数字，牛逼你行的通货膨胀。您可以通过数字下选择中的这些号码复制到剪贴板中，突出的数字是要复制，并在底部按下剪贴板按钮。然后，这些数字拷贝我n要一个ê艾克赛尔片。
重复上述步骤2-5的DNA -标记的膜（如看到˚F igure 2B）。这些数字应该更相似。
一旦你为每个片段的所有号码，并在每个膜ë Xcel公司，你现在可以完成ANALY ž荷兰国际集团他们。首先，通过加载到膜上的每个 DNA 片段中的尿苷（或胸腺嘧啶）的数量对 RNA 膜进行标准化，因为这会影响获得的标记信号的数量。然后，将 RNA 编号标准化为 DNA 膜。最后，使用 OD 数将它们标准化为每个样本中收获的细胞数。
我们重复每个实验3次，并执行一个小号tudent的吨-相对于所述突变体，以确定所研究的每个DNA片段活性的RNA聚合酶显著变化对在WT的每一片段的测试。

图3.截图GelQuant程序用于QUANT itate杂交标记的RNA信号。在右上角，可以找到.GEL 比例、缩放、亮度和对比度按钮。在顶部，可以找到打开、另存为、旋转等按钮。在底部，按钮来绘制红色孔定量吨通货膨胀平方（Z），可以发现，与它旁边，所述Ç ONTROL按钮其被选择以允许相同的红色正方形被拖动在不同的频带对孔定量塔季翁。将q uanti泰特按钮旁边，其选择的时候，会给页面右侧的数字。在右下角，可以找到自动本地背景选项，上面是剪贴板选项。

食谱

ñ Ø TE：蒸压所有股票的解决方案，以sterili ž即

变性缓冲液
1.5 M 氯化钠

0.5M氢氧化钠

中和缓冲液
1 M 氯化钠

0.5 M Tris-HCl ，pH 7

SSC 20 ×
150 毫米氯化钠

20 mM 柠檬酸钠

加入HCl 直至 pH 值为 7

转录缓冲液 2.5 ×
550 mM Tris-HCl ，pH 7

500毫米氯化钾

80 mM 氯化镁2

测试服务
10 mM Tris-HC , l pH 7.5

10 mM EDTA ，pH 8

0.5% SDS

杂交方案
0.5 M 磷酸盐缓冲液，pH 7

7% SDS, 0.5 M EDTA pH 8

洗涤液Ⅰ
1 × SSC

0.1% SDS

洗涤液Ⅱ
0.5 × SSC

0.1% SDS

中和溶液（剥离）
550 mM Tris-HCl ，pH 7

0.1 × SSC

0.1% SDS

剥离液
55 mM 磷酸钾，pH 7
0.1% SDS

10 × TBE 缓冲器
13 M Tris 底座

450 mM 硼酸

25 mM EDTA ，pH 8

Tris-HCl 1M ，pH 7
1 M Tris 底座

加入 HCl 直至 pH 值为 7

磷酸盐缓冲液 1 M ，pH 7
99.4 克Na 2 HPO 4

41.4 克 NaH 2 PO 4 · H 2 O

检查pH 值为 7

致谢

这项工作由西班牙经济和竞争力部和欧盟基金 (FEDER) [ BFU2016-77728-C3-1-P ]资助。

原研物品，其中使用该协议是贝格利等。（2019 年）。

利益争夺

没有人声明。

参考

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核心，LJ，瀑布，JJ 和 Lis，JT（2008 年）。新生 RNA 测序揭示了人类启动子的广泛暂停和不同起始。科学322(5909)：1845-1848。
Garcia-Martinez, J.、Aranda, A. 和Perez-Ortin , JE (2004)。Genomic run-on 评估所有酵母基因的转录率并确定基因调控机制。Mol Cell 15(2): 303-313。
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