材料和试剂

分子生物学试剂

的Phusion ħ igh- ˚F idelity DNA聚合酶（New England Biolabs公司，目录号：M0530S）
金星模板（礼物从淳宫胁博士，RIKEN脑科学研究所，日本琦玉）
HIV-1（SF2 等位基因）和 SIV（mac239）Nef克隆（NIH AIDS Reagent Program，HIV #11431；SIV #2476）
全长人类 Tec家族激酶 cDNA 克隆（Dana-Farber/Harvard Cancer Center PlasmID DNA Resource Core，Btk # HsCD00346954；Itk # HsCD00021352）
哺乳动物表达载体，pCDNA3.1（-）（Thermo Fisher，目录号：V79520）

抗体

抗V5 t ag 小鼠单克隆抗体（Thermo Fisher ，目录号：R960-25）
抗V5 t ag 兔多克隆抗体（Sigma，目录号：AB3792）
BTK 抗 pY551 兔单克隆抗体（Abcam，目录号：ab40770）
抗的pTyr抗体PY99（Santa Cruz公司，目录号：SC-7020）
抗HIV-1 Nef的中号onoclonal抗体6.2（NIH AIDS试剂方案，目录号：1539）
山羊一个nti- ř abbit的IgG（H + L），米乌斯/ ħ UMAN广告-TXRD（德克萨斯红偶联物;交吸附于小鼠和人免疫球蛋白; Southern Biotech公司，目录号：4050-07）
山羊一个nti-米乌斯的IgG（H + L），ħ UMAN广告-TXRD（德克萨斯红偶联物;交吸附到人类免疫球蛋白; Southern Biotech公司，目录号：一〇三一年至1007年）
太平洋乙略的山羊抗小鼠IgG抗体（赛默飞世/ Molecular Probes公司，目录号：P31582）
太平洋乙略的山羊抗兔IgG抗体（赛默飞世/ Molecular Probes公司，目录号：P10994）

细胞培养试剂和激酶抑制剂

35 mm 微孔培养皿（MatTek ，目录号：P35G-1.5-14-C）
人胚肾293T细胞（美国典型培养物保藏中心，目录号：CRL-11268）
Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（DMEM；ThermoFisher /Invitrogen，目录号：11965-118）
胎牛血清（FBS；Gemini Bio-Products，目录号：900-108）
胰蛋白酶-EDTA，0.05%（ThermoFisher /Invitrogen 目录号：25300054）
X- tremeGENE 9 DNA 转染试剂（Sigma - Aldrich，目录号：06365787001）
多聚甲醛，16% 水溶液（Fisher，目录号：50980487）
Triton X-100（Sigma，目录号：X100-1L）
牛血清白蛋白（BSA，Sigma，目录号：A3059-500G）
Itk抑制剂，BMS-509744（Calbiochem ，目录号：41-982-05MG）
Itk / Btk抑制剂，依鲁替尼（SelleckChem ，目录号：S2680）

设备

奥林巴斯FluoView FV1000 共聚焦显微镜

软件

Prism v. 8.0（GraphPad Software, Inc.；www.graphpad.com）
ImageJ（美国国立卫生研究院；https://imagej.net/Welcome）
奥林巴斯 FluoView 软件 ( https://www.olympus-lifescience.com/en/ )

程序

基于Venus的BiFC表达载体构建。该程序基于我们发表的针对慢病毒Nef等位基因以及 Tec家族激酶Btk和Itk 的BiFC载体工作（Tarafdar等人，2014 年；Li等人，2020 年），但可以轻松适应几乎任何相互作用的蛋白质组合伙伴。虽然我们的方法使用基于p c DNA3 的表达载体来驱动 293T 细胞中的强蛋白质表达，但也可以根据目标细胞类型和应用替换其他载体。其他细节与引物设计，亚克隆方案，并最终融合构建的序列中所提供的附录。
PCR 扩增 Venus N 端（VN：残基 Val 2至 Asp 173 ）和 C 端（VC：残基Ala 154至 Lys 238 ）的编码序列，其中包含适当的限制性位点和终止密码子，并亚克隆PCR 产物进入哺乳动物表达载体 pcDNA3.1( – )。
以相同的方式PCR 扩增HIV-1 Nef (SF2) 和 SIV Nef (mac239)的编码序列，并将产物亚克隆到pcDNA3.1( – )/VN 构建体中。
PCR-扩增全长人Tec的家族激酶的cDNA克隆含有为适当ligati限制性位点和一个C末端V5表位标签上在帧到所述的pcDNA3.1（- ）/ VC构建体。

293T细胞培养和转染
在含有5% CO 2气氛的 37°C 加湿培养箱中，在补充有 10% 胎牛血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 中培养 293T 细胞。使用10米升每10 DMEM -厘米培养皿和维持细胞以2-5的密度× 10 4细胞/ cm 2 。当培养物达到80％confluenc Ë ，取出的通过用1.0M孵育用过的培养基和分裂1:10升0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液1在37℃分钟，以产生单细胞悬浮液。加入 10 ml新鲜培养基并以 500 × g旋转5分钟。重悬在10毫升的细胞沉淀升新鲜的培养基和转印1.0米升细胞悬浮液到新10 -厘米培养皿与一个附加10米升新鲜培养基中。对于转染，每个MatTek板接种 2.5 × 10 5 个细胞并培养过夜。
根据制造商的方案，使用 X- tremeGene 9 DNA 转染试剂用BiFC表达载体转染细胞。简而言之，将 3 µl X- tremeGene 9 与 97 µl DMEM 混合，加入每个BiFC表达质粒（每个 VN 和 VC 构建体 0.5 µg），并在室温下孵育混合物 15分钟。孵育后，将转染复合物逐滴添加到MatTek培养板中。根据需要在转染后4小时用抑制剂或 DMSO 载体溶剂（0.1% 终浓度）处理细胞。

免疫荧光染色
转染后40 小时，用 2 ml l 4% 多聚甲醛替换培养基固定细胞，并在室温下孵育 10分钟。洗涤细胞，用2M升PBS（pH为7.4）中5分钟，并偶尔轻轻摇动用手。
用 2 ml 0.2% Triton X-100 在 PBS 中渗透细胞15分钟。用 2.0 ml l PBS洗涤细胞两次，每次5分钟。
用 2 ml 2% BSA 的 PBS室温封闭细胞1小时或 4°C 过夜。
将细胞与抗 V5（激酶标签）和抗Nef或抗pTyr （或抗Btk pY551/抗Itk pY511）抗体在 250 µl PBS 和 2% BSA 中按 1 :1,000 稀释，室温孵育1 小时温度。用 2 ml PBS洗涤细胞 3 次，每次5分钟。
分别以 1:500 或 1:1,000的稀释度，用与德克萨斯红或太平洋蓝偶联的适当二级抗体孵育细胞。用 2 ml PBS洗涤细胞 3 次，每次5分钟。将细胞保存在 2 ml l PBS 中进行成像。
注意：该协议是为 3 色成像开发的，允许同时检测每个相互作用伙伴（激酶和Nef ）的相互作用（金星互补）和蛋白质表达，或相互作用、激酶表达和激酶活性（整体细胞磷酸酪氨酸含量或激活环自磷酸化）。

荧光成像和分析
使用多采集图像-色共聚焦显微镜，具有60 ×物镜使用X-Y扫描模式。奥林巴斯FluoView1000，我们使用紫色激光来检测太平洋蓝（405纳米），绿色激光来检测荧光互补（金星; 543纳米），和红色激光来检测德克萨斯ř ED（633纳米）。
执行使用基于Java的图像处理程序，ImageJ的，数据下所述单细胞的图像分析一个nalysis 。

数据分析

作为一个例子，下面的协议使用的ImageJ到孔定量泰特用抗染色的细胞的平均荧光强度（MFI）磷酸酪氨酸（抗的pTyr ）和抗Btk的抗体。然后计算最少 100 个细胞的pTyr与Btk MFI的比率，作为细胞群中激酶活性的量度。相同的方法可用于孔定量泰特其它MFI比率，如相互作用（附设标准化为伴侣蛋白表达荧光）。

文件/打开：Ó笔的Btk蛋白表达和共聚焦图像对（图2）。最小化pTyr图像并且不要再次单击它。单击Btk蛋白质图像窗口。

图形用户界面描述已自动生成

˚F igure染色的293T细胞的2.共聚焦图像的Btk蛋白表达和的pTyr ImageJ中打开。染色细胞的Btk蛋白被示出在左侧（青色），用的pTyr右侧（红色）显示。这些图像来自共表达Btk和 HIV-1 Nef 的细胞。

图像/类型：更改为 8-bit ，这会将图像转换为黑白（图 3 ）。

图形用户界面描述已自动生成

˚F igure 3.转化的Btk蛋白图像的8位灰度。在控制栏中，单击图像，然后单击 8 位，这会将图像转换为 8 位灰度图像（右图）。

图像/调整/阈值：通过移动两个滑块设置最小/最大以包括染色但最小化背景和过度曝光来设置级别。选中“深色背景”框。单击“设置”和“确定” 。” 关闭阈值框。红色突出显示的区域显示将包含在分析中的像素（图 4 ）。

图形用户界面描述已自动生成

˚F igure 4.设置阈值。单击控制栏中的图像，选择调整，然后选择阈值。将出现左上角的框，将包含在分析中的像素将在图像上以红色显示（右）。点击设置；显示的下方框将出现。单击确定完成。

分析/设置测量：选择这些选项（图 5 ）：
面积、最小和最大灰度值以及平均灰度值。
将“重定向到”框设置为“无”。

图形用户界面，应用程序描述已自动生成

˚F igure 5.设置分析参数。从控制栏中，点击分析，然后设置测量；所示的对话框上的左边会出现。选择显示的参数。

分析/分析粒子（图 6 ）：
大小：确定将被分析的单元格区域。通常，[20-infinity] 和 [50-infinity] 分别适用于293T 细胞的400 ×和 100 ×图像。
选中“像素单位”框。
圆度：从 [0.0 - 1.0] 开始以排除背景斑点和噪音。
显示：选择“轮廓”选项以显示选定用于测量的区域的位置和大小（通过调整上面的大小/圆度值来控制）。
选中“显示结果”框并取消选中“清除结果”框。
单击“确定” 。”两个额外的窗口将被生成：一（图7 ）中的的分析中使用的小区区域的显示轮廓阈值化的图像（左）和第二（右）是结果小号表窗口含MFI数据（‘平均数’列）。
将“结果”窗口中的数据复制到 Excel 文件中，然后仅关闭“结果”窗口。

图形用户界面，应用程序描述已自动生成

˚F igure 6.粒子（像素）分析设置。从控制栏中，选择分析，然后分析粒子，这将打开此框。选择显示的参数。

图形用户界面、应用程序、Word描述已自动生成

˚F igure 7.结果小号颗粒分析。中心图像显示了像素强度已被分析和编号的区域的轮廓。在吨能够在右侧示出了所得到的数据，其包括所分析的特征的数量和它的区域，其次是平均和最小和最大荧光强度。请注意，细胞将被单独、分组或作为片段进行分析，其中包含来自同一细胞的多个片段。

下一步将使用相同的掩码来分析反pTyr图像。确保蛋白质分析的“结果”框已关闭。单击“ Nef + Btk ”蛋白质框以激活它。

分析/设置测量：将“重定向到”框设置为相应的pTyr图像文件名（以前最小化且未修改），同时保持其他参数相同。单击“确定” 。” 为Btk蛋白质图像建立的选定（轮廓）字段现在直接转置到pTyr图像上，并将分析相对于Btk免疫染色提供的相同细胞位置（像素）的pTyr水平。
分析/分析粒子：使用之前的设置并单击“确定” 。” 全选并将结果窗口中的数据复制到 Excel 文件中。Btk蛋白和pTyr分析的结果窗口并排显示在下方（图 8 ）。请注意，每个区域的行数相同（54；未显示），用于分析每个区域的区域也相同。然而，MFI 值与预期不同（平均列），因为强度不同。

˚F igure 8.结果小号的的颗粒分析的Btk的pTyr图像。从结果表格的Btk蛋白（从图7中，左）和的pTyr （右）的分析显示侧-通过-侧进行比较。请注意，每个图像中的特征区域是相同的，a s 是特征的数量（每种情况下为 54，未显示）。这两个条件都必须为真，后续计算才有效。

使用 Excel，计算pTyr与Btk平均像素密度（“平均”列）的比率。
每个条件至少分析 100 个细胞，这可能需要多个细胞区域，具体取决于使用的细胞密度、大小和放大倍数。组之间的差异显著可以使用分析的非配对吨-试验（的GraphPad Prism v.8.0）。为了更加严格，对每个实验进行三个生物学重复。
可以使用 Prism 以多种不同方式呈现数据。我们更喜欢将单个“细胞”的结果（实际上来自 ImageJ 识别的单个细胞或细胞片段的掩码）显示为一系列条形图，这给出了细胞群中比率分布的视图。或者，可以使用盒须图或小提琴图。FIGUR ë 9小号怎么样了使用上述方法按照图1所示的结果的ImageJ的分析而获得的比率的分布。

图9.慢病毒Nef蛋白存在和不存在时Btk自磷酸化的图像分析。Btk激活环自磷酸化(pY551) 和Btk蛋白表达信号的平均荧光强度是使用 ImageJ 和图 1 中显示的数据确定每个条件下≥100 个细胞的。每个细胞的荧光强度比（pY551：Btk表达）（或由 ImageJ 确定的细胞片段）显示为水平条，红色条表示中间值。学生吨-test显示小号显著增加的Btk的活化环磷酸化在两种HIV-1和SIV的存在的Nef （P <0.0001在每种情况下）。当Btk单独表达时，观察到广泛的pY 551 :Btk比率，因为随着蛋白质量的增加，Btk活性的程度以非线性方式增加。当用 HIV-1 Nef表达时，请注意大多数黑条移到堆栈的顶部，这与几乎所有成像细胞中Nef对Btk的最大激活一致。共用SIV表达Nef的产生更细微的，尽管统计学显著，在移位的pY 551：Btk的比率。在Btk激酶抑制剂依鲁替尼存在的情况下，所有三个群体的比率都会下降。

笔记

不要让菜肴在成像前变干。干燥会严重影响染色并产生假阳性伪影。
用铝箔包裹盘子，保护荧光团免受光照，以避免漂白。
始终包括阳性和阴性BiFC对作为对照，尤其是在开发新蛋白质-蛋白质相互作用的测定时。
293T细胞应保持在一个低的通道编号，以确保细胞的完整性（即，小于10代）。
在整个实验中保持所有共焦图像采集和 ImageJ 分析设置相同。当所有条件保持恒定时，结果应该是可重现的。
在测试新的磷酸化特异性抗体时，在染色过程中滴定一系列抗体浓度以确定最佳浓度。
染色后，细胞以后可以成像2天，并且只要一个星期某些情况下。储存板时，避光并保持在 4°C。
在成像过程中，调整激光功率以避免图像中的信号过饱和，因为这可能会影响后续的图像分析。

致谢

这项工作由美国国立卫生研究院向 TES 提供 AI152677 和 AI057083 资助。这些协议最初由 Li等人报告。(2020) ( doi : 10.1074/jbc.RA120.012536 ) 。以下试剂通过 NIH HIV Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Anti-Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) Nef Monoclonal (6.2), ARP-1539，由 Drs. 凯·克罗恩和弗拉基米尔·奥沃德。

利益争夺

作者没有竞争利益。

参考

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