设备
照明

白色 LED（Mightex ，目录号：BLSLCS-4000-03-22）
红外 LED（Mightex，目录号：BLS-LCS-4000-03-22）
LED 控制箱（Mightex，目录号：BLS-SA02-US）
激光器（Vortran Stradus ，目录号小号：405-100 [ 405纳米]; 488-150 [ 488纳米] ）; 637-180 [ 637 纳米])

光学元件

带通滤波器（Semrock，目录号：FF01-842/56-25）
二向色分光镜（Semrock，目录号：FF801-Di02-25x36 和 Chroma，目录号：ZT488/640rpc）
排放过滤器（Semrock ，目录号：Em01-R405/488/635-25）
二向色镜（Chroma ，目录号：ZT442rdc 和 ZT594rdc）
非球面Ç ondenser升ENS（Thorlabs公司，目录号：ACL25416U-B）
红外一个色d oublets透镜（Thorlabs公司，目录号：AC254-200-B-ML）
可见一个色d oublets透镜（Thorlabs公司，目录号小号：AC254-300-A-ML，AC254-200-A-ML，AC254-30-A-ML，AC254-50-A-ML）
偏振米aintaining ˚F IBER （Thorlabs公司，目录号：P3-405BPM-FC-2）
椭圆米irror（Thorlabs公司，目录号：BBE1-E03）
油浸物镜，100×Apo SR TIRF 物镜，数值孔径 (NA) = 1.49，工作距离 (WD) = 0.12（尼康）

机械部件

光纤端口（Thorlabs，目录号：PAF2-A7A）
光学p OST（Thorlabs公司，目录号小号：TR75 / M和TR50 / M）
光学p OST小号步行者（Thorlabs公司，产品目录号：RS4 / M，RS5 / M和RS10 / M ）
基座p OST ħ以上（Thorlabs公司，目录号：PH100E / M和PH50E / M）
笼一个ssembly ř OD（Thorlabs公司，目录号：ER025和ER4-P4）
笼XY吨ranslator（Thorlabs公司，目录号：CXY1）
椭圆米irror米'mount（Thorlabs公司，目录号：KCB1E / M）
镜米ounts（北极星-K25S4 / M）
压电镜（Thorlabs ，目录号：Polaris-K1S3P）
螺纹小号TANDARD Ç年龄p酸酯（Thorlabs公司，目录号：CP33 / M）
夹紧˚F兽人（Thorlabs公司，目录号：CF125C / M-P5）
M6 Ç AP小号船员和ħ ardware ķ它（Thorlabs公司，目录号：HW-KIT2 / M）
笼一个lignment p晚期（Thorlabs公司，目录号：CPA1）
适配器 C-Mount 至 SM1（Thorlabs，目录号：SM1A39 和 SM1A9）
透镜吨ubes（Thorlabs公司，目录NUM BER：SM1）
主动稳定光学平台（Newport，目录号：M-ST-46-8）
智能桌控制器（Newport，目录号：ST-300）
显微镜框架（Mad City Labs，目录号：RM21-M）
Cage- Ç ompatible ř ectangular ˚F ILTER ħ以上（Thorlabs公司，目录号：FFM1）
支持b球拍（定制设计，CAD：https : //github.com/spcoelho/Active-Stabilization.git）
Cage c ube（Thorlabs，目录号：C6W）
空白Ç超过p晚期（Thorlabs公司，目录号：B1C / M）
运动学Ç年龄Ç UBE p latform（Thorlabs公司，目录号：B 4 C / M）
XYZ吨ranslation小号塔格与小号TANDARD米icrometers（Thorlabs公司，目录号：PT3 / M）
右一ngle ķ inematic Ë lliptical米irror米'mount（Thorlabs公司，目录号：KCB1E / M）
相机底板（Manta，¼-20 三脚架适配器）
翻译阶段（Newport ，目录号：M-423-MIC）
螺纹˚F rosted克小姑娘一个lignment d ISK（Thorlabs公司，目录号：DG10-1500-H1-MD）

相机

CMOS 相机（Allied Vision、Manta 相机）
EMCCD（Andor，目录号：897）

软件

1.主动稳定软件和自定义B球拍：https : //github.com/spcoelho/Active-Stabilization.git

2. NicoLase：https : //github.com/PRNicovich/NicoLase

资源

如何对准激光：https : //www.youtube.com/watch?v=qzxILY6nOmA&t=311s
将激光耦合到光纤中：https : //www.youtube.com/watch?v=kQvhbJbDG0M
准直激光束：https : //www.youtube.com/watch?v= Z7Q17-ctQVQ
TIRF 显微镜：https : //www.youtube.com/watch?v= egmJIalDR48 & t = 1039s

程序

TIRF Assemb LY
该TIRF显微镜是我们描述是建立在一个疯狂的城市实验室RM21体。这种显微镜框架很方便，因为它可以轻松接触框架内的光学组件，便于对齐。RM21 框架特别稳定，矩形几何形状允许简单地添加支架。

第一步是将显微镜主体放在光学平台上。图 1 是 CAD 设计的俯视图，显示了显微镜框架相对于其余光学组件的位置。我们建议将主体放置在靠近光学平台中心的位置。这然后使得包围的在最后阶段的显微镜。

图1 。CAD 设计显示了光学组件的俯视图。A.随着出显微镜帧。B.带显微镜架。

接下来，将激光器放置在适当高度的散热器上。目前，我们使用Vortran激光器（中详细描述了可以与清理过滤器购买，以尽量减少外部元件的组件部分）。紧凑和简单的设计之前已经描述过，例如 Nicovich等人。( 20 17 )。论文中的链接提供了有关组装激光器（包括设计）和有用资源（包括触发和计时）的良好指南。如下图图2密切-向上的设计是我们实施。三个激光器（405纳米，488纳米，和640纳米）被放置在一个散热片，利用激光过滤器过滤，并组合成使用分光镜单行。在实践中，如果需要，可以通过扩展设计来组合更多的激光器（例如，561 nm）。然后将激光器对准成光纤。安装后，我们预计耦合效率约为 70%。

图2 。激光组装和光纤耦合。三个激光器（405纳米，488纳米，和640纳米）被放置在一个散热片上，使用二向色组合，以及耦合到一个激光纤维。

将光纤的输出放置在扩展光学器件的预期高度。确保该激光输出是直的，并且不偏离行进平行于该表。
设置的激光膨胀笼组件（笼杆，× 2右-角镜座，和× 3笼XY TR anslation坐骑）附接至自定义RM21托架框架（https://github.com/spcoelho/Active-Stabilization-设计），并在地方的需要的高度。我们建议使用钢底座以确保更高的稳定性。图 3 说明了该组件。

图 3. 激光扩展组件的组装

对准的激光，使其整个笼中心组件。
放置的透镜亲参见〜1的激光的0倍的扩增（例如，30个和300mm）。确保该这些被放置在彼此使用剪切干涉的正确距离。
组装的反射镜和透镜管（200毫米焦距）上的顶部的平移台。平移台将镜头和反射镜组件一起移动。确保该反射光束是直的并且平行于所述光学平台上。将镜子/镜头居中放置在显微镜框架内。
取的分色持有者（× 2）和彼此附接。放置在激光高度的成像目标位置下方。
附加的分光镜，通过笼杆，以在使用该RM21支架（显微镜帧https://github.com/spcoelho/Active-Stabilization-Design）（图4，左手侧和图5）。

图4.镜和管透镜是上位于最后的组装中所示的显微镜帧内的平移台的顶

图 5. 不带显微镜机身框架的内部组件

放置在分光镜其持有之内。一个二向色镜用于将激光反射到样品/目标；吨他第二分色用于为活性STA红外光分离bilization。有关如何组装和配置的更多详细信息，请参阅Coelho等人。（2020 年）。
对准激光，使其居中在成像物镜的背面。一种简单的方法包括更换磨砂玻璃校准盘的物镜并观察激光的位置。
为了确保管透镜是在正确的距离从所述物镜的后，激光输出应该离开物镜后是尽可能小。同时观察在一个大的距离（激光轮廓例如，天花板），调整管透镜的位置，以确保该高斯光束具有最小直径离开所述目标。未对准会导致光束轮廓失真（例如，散光）。

组装的红外Ç相机/ LED路径
组装的笼SYS TEM（笼杆，直角镜支架，和200mm红外线透镜），并将它附加到所述二向色立方体（图6）。
使用n RM21 支架 ( https://github.com/spcoelho/Active-Stabilization-Design )固定到显微镜框架上。
附加的使用SM1适配器，并连接到红外摄像机一个PC。
组装的红外线LED，在地方的XYZ平移台，并对准到所述红外线摄像机[更多细节请访问科埃略等人。( 20 20 ) ] 。
打开的红外LED和检查照明居中和红外摄像机上是均匀的。
对地方聚苯乙烯珠的玻璃盖玻片，并记录他们的衍射环。

图6.大会的笼系统以固定的红外摄像机。显示的组件与没有支架/显微镜框架的红外 LED 相关。A.前视图。B. 45 °视图。

检测（发射相机和相机稳定路径）
本节介绍如何为发射路径引入光反馈回路（图 7）。这允许校正检测路径中的移动，促进长时间采集的高稳定性。

发射相机
要将样品中的荧光引导至相机，请将直角镜架连接到管道上，并将其连接到激光二向色支架的底部（图 7）。

的图7.装配的荧光发射路径。A.左：没有白色 LED。右：带有白色 LED。B.左：只有相机稳定路径。右图：与红外检测相关的检测组件。

调整的长度的管以匹配荧光照相机的预测高度。
在管内，插入的发射滤光片（EM01-R405 / 488 / 635-25; Semrock）。这将移除激光和/或红外 LED。
附加的管透镜（例如，400个毫米焦距）。
对于白色LED：附加的笼立方体直角镜支架的自由侧。

注意：如果需要在摄像机和管透镜之间额外的距离，加一对中继透镜的ES （例如，2 × 50mm）上。

使用笼杆和/或 SM1 管将组件固定到 RM21 显微镜框架上。
将相机安装到距镜头正确距离的光学平台上。
在相机前放置一面镜子（或压电镜）。
调整 Tube Lens 的焦距。获得正确距离的一种简单方法是翻转激光二向色镜，使其反射到相机。使用一个非常低的激光功率和多个中性密度过滤器，聚焦激光到照相机上。要获得正确的距离，还需卸下激光激发路径中的激光滤光片和最后一个透镜（安装在平移台上的 TIRF 透镜）。
放置一个均匀的荧光样品（在溶液中或荧光标记物的荧光分子），并检查所述到发射的相机。
使用物镜下方的椭圆镜将发射集中到相机上。在记录的视场中，发射应该是均匀的。
相机稳定
附着的白色LED到显微镜帧（图小号4和7乙左侧）。
组装包含针孔 (直径 = 50 µm) 和透镜 (例如, f = 400 毫米)的笼子/管系统。
CENTE r是针孔和调整所述的位置的透镜，以确保一个亮ģ aussian点聚焦照相机。
将白色 LED 光斑定位在成像视野的边缘（图 8）。

图 8. 相机的稳定性。A.显示 LED 向边缘芯片投影的完整相机图像。B.放大黄色方块中突出显示的区域。

致谢

我们都感谢了FUL从澳大利亚研究理事会（CE140100011到KG，FL150100060和CE140100036到JJG）和支持的国家卫生和澳大利亚的医学研究理事会（APP1059278到KG）。个是协议我S的基于以前的工作，主要是从科埃略等人。（2020 年）。

利益争夺

作者声明没有相互竞争的经济利益。

参考

Axelrod, D. (2001) 。细胞生物学中的全内反射荧光显微镜。交通2 (11) ：764-774 。
Aoki, K. 和 Matsuda, M. (2009)。使用基于荧光共振能量转移的生物传感器可视化小 GTPase 活性。纳特P rotoc 4（11）：1623。
Baek, J., Loua, J., Coelhoa, S., Lim, D., Seidlitz S., Nicovich, PR, Gaus, K. (2017)。用晶格光片显微镜对半乳糖凝集素 3 依赖性内吞作用进行成像。生物光子学国际会议 V 10340 ：SPIE。
Boutros, M.、Heigwer, F.和 Laufer 。C. （2015 年）。基于显微镜的高内涵筛选。单元格163(6)：1314-1325。
Burke, D.、Patton, B.、Huang, F.、Bewersdorf, J. 和 Booth MJ（2015 年）。单分子切换显微镜中样品引起的像差的自适应光学校正。光学2(2)：177-185。
科埃略，S 。，贝克，J 。，格劳斯，M 。小号。，霍尔斯特德，J 。米。，尼科维奇，P 。[R 。，费尔，K 。，甘地，H 。，古丁，J 。Ĵ 。和Gaus , K. (2020)。超精密单分子定位显微镜可以在完整细胞中进行原位距离测量。Sci Adv 6（16）：eaay8271。
科埃略，S 。，贝克，J 。，沃尔什，J 。，古丁，J 。Ĵ 。和Gaus , K. (2020)。用于单分子成像的 3D 主动稳定。国家议定书16(1): 497-515。
科埃略，S.，波兰，S 。，克尔斯塔季奇，N 。，李，d 。，莫尼彭尼，J 。，沃克，R 。，廷德尔，d 。，吴，T 。，亨德森，R 。和Ameer-Beg，S 。(2013)。具有自适应光学校正的多焦点多光子显微镜。进展生物医学光学和成像- SPIE论文集8588 ：17，2013：SPIE。
Coelho, S.、Coelho, S.、Poland、SP、Devauges, V. 和 Ameer-Beg, SM 。(2020)。用于时间分辨 Förster 共振能量转移 (FRET) 和体内荧光寿命成像显微镜 (FLIM) 的自适应光学器件。Opt Lett 45(10)：2732-2735。
Diekmann, R., Helle, Ø.I., Øie CI, McCourt, P., Huser, TR, Schüttpelz, M. 和 Ahluwalia , BS (2017)。基于芯片的宽视场纳米显微镜。国家光子11(5): 322-328。
Eggeling, C., Ringemann, C., Medda, R., Schwarzmann, G., Sandhoff, K., Polyakova, S., Belov, VN, Hein, B., von Middendorff, C., Schönle, A. 和地狱，SW 。(2009)。直接观察活细胞中膜脂的纳米级动力学。自然457(7233)：1159-1162。
Fish, K. N. (2009)。全内反射荧光 (TIRF) 显微镜。Curr Protoc Cytom第 12 章：Unit12.18。
Gao, L.、Shao, L.、Chen, BC 和 Betzig, E.（2014 年）。使用贝塞尔光束平面照明显微镜对细胞动力学进行 3D 实时荧光成像。Nat Protoc 9(5): 1083-1101。
Giessibl, FJ，原子力显微镜的进展。(2003)。转中号OD P HYS 75（3）：949。
Gustavsson, AK, Petrov, PN, Lee, MY, Shechtman, Y. 和 Moerner, WE 。(2018)。带有倾斜光片的 3D 单分子超分辨率显微镜。纳特Ç ommun 9（1）：1-8。
黄，乙。，王，W 。，贝茨，M 。和庄，X. (2008)。随机光学重建显微镜的三维超分辨率成像。科学319（5864）：810-813。
Huang, F., Sirinakis, G., Allgeyer, ES, Schroeder, LK, Duim, WC, Kromann, EB, Phan, T., Rivera-Molina, FE, Myers, JR, Irnov, I., Lessard, M. , Zhang, Y., Handel, MA, Jacobs-Wagner, C., Lusk, CP, Rothman, JE, Toomre, D., Booth, MJ 和 Bewersdorf, J. (2016)。全细胞的超高分辨率 3D 成像。单元格166(4)：1028-1040。
金，J 。，公园，B 。w ^ 。，贝克，J 。，云，J 。小号。，权，H 。w ^ 。，塞德尔，J 。, 最小, H 。，科埃略，S 。，林，S 。，黄，S 。，高斯，K 。，格林，M 。一个。，新，T 。J ., Ho-Baillie , A . w ^ 。是。，金，M 。格。和Seok ，S 。一（2020）。揭示钙钛矿前驱体溶液与由此产生的器件性能之间的关系。J Am Chem Soc 142(13): 6251-6260 。
Krstajić, N.、Poland, S.、Tyndall, D.、Walker, R.、Coelho, S.、Li、DDU、Richardson, J.、Ameer-Beg, S. 和 Henderson, R. (2013)。在欧洲生物医学光学会议上改进来自 CMOS SPAD 阵列的 TCSPC 数据采集。美国光学学会论文：879709。
容曼，R 。，AVENDAÑO ，中号。小号。，沃尔斯坦，J 。乙。，戴，M 。，施，W 。米。和尹，P. （2014）。使用 DNA-PAINT 和 Exchange-PAINT 进行多重 3D 细胞超分辨率成像。纳特中号编制方法11（3）：313-318。
Nicovich, PR、Walsh, J.、Böcking, T. 和 Gaus, K.（2017 年）。NicoLase -用于荧光显微镜的开源二极管激光组合器、光纤发射和测序控制器。PLoS 一12(3)：e0173879。
帕瓦尼，S 。[R 。，汤普森，M 。一个。，比廷，J 。小号。，主，S 。Ĵ 。，刘，N 。，特维格，R 。Ĵ 。，皮埃斯顿，R 。和莫尔纳，W 。E. (2009)使用双螺旋点扩散函数进行超出衍射极限的三维单分子荧光成像。Proc Natl Acad Sci USA 106(9): 2995-2999。
波兰, SP, Krstajić, N., Monypenny, J., Coelho, S., Tyndall, D., Walker, RJ, Devauges, V., Richardson, J., Dutton, N., Barber, P., Li, DD, Suhling, K., Ng, T., Henderson, RK 和 Ameer-Beg, SM (2015)。用于活细胞 FRET 成像的高速多焦点多光子荧光寿命成像显微镜。生物医学ø角é随心6（2）：277-296。
波兰, SP, Krstajić, N,, Coelho, S., Tyndall, D., Walker, RJ, Devauges, V., Morton, PE, Nicholas, NS, Richardson, J., Li, DD, Suhling, K., Wells, CM, Parsons, M., Henderson, RK 和 Ameer-Beg, SM (2014)。用于体内高速 FRET 成像的时间分辨多焦点多光子显微镜。选择大号ETT 39（20）：6013-6016。
Suhling, K., Hirvonen, LM, Levitt, JA, Chung, PH, Tregidgo, C., Marois, AL, Rusakov, DA, Zheng, K., Ameer-Beg, S., 波兰, S., Coelho, S ., Henderson, R. 和 Nikola Krstajic 。(2015)荧光寿命成像 (FLIM)：基本概念和一些最新进展。MedPhoton 27：3-40。
Suhling, K.,等。(2017) 。荧光寿命成像。我ñ ：光子学手册生物医学工程。施普林格：353-405。
Suhling, K., Hirvonen, L. M., Levitt, JA, Chung, PH, Tregido, C., Marois, A., Rusakov, DA, Zheng, K., Ameer-Beg, S., 波兰, S. , Coelho, S. 和Dimble, R. (2015)。荧光寿命成像 (Flim)：高级时间相关单光子计数应用中的基本概念和最新应用。Springer 系列化学物理111 ：119-188 。
施密特，PD，赖克特，BH，拉茹瓦，JG和Sivasankar，S 。(2018)。单分子荧光显微镜中高频跟踪和亚纳米样品稳定的方法。科学报告8(1)：13912。
谢赫特曼，Y 。，萨尔，S 。Ĵ 。，支持者，A 。小号。和莫尔纳，W 。E. （2014 年）。3D 成像的最佳点扩散函数设计。Phys Rev Lett 113(13): 133902。
施滕格尔，G 。，加尔布雷思，J 。一个。，加尔布雷思，C 。格。，利平科特-施瓦茨，J 。，吉列，J 。米。，曼利，S 。，苏格拉特，R 。，沃特曼，C 。M. ，Kanchanawong ，P 。，戴维森，M 。w ^ 。，脚镣，R 。d 。和赫斯，H 。F. （2009 年）。干涉荧光超分辨率显微镜解析 3D 细胞超微结构。Proc Natl Acad Sci USA 106(9): 3125-3130。
史罗夫，H 。，加尔布雷思，C 。格。，加尔布雷思，J 。一个。和贝齐格，E 。(2008)。纳米级粘附动力学的活细胞光活化定位显微镜。纳特中号编制方法5（5）：417。
德永，M 。，今本，N 。和Sakata-Sogawa , K. (2008)。高度倾斜的薄照明可在细胞中实现清晰的单分子成像。Nat 方法5(2): 159-161。