材料和试剂

50 毫升猎鹰管
铝箔
精致的画笔
低温恒温器刀片（Leica Biosystems，目录号：3802106-TRI-FACET/LOPRO/CTD Blade-10PK）
用于储存冷冻切片的 12 孔板（BD Falcon，Corning，目录号：353043）
用于储存冷冻切片的 24 孔板（BD Falcon，Corning，目录号：353047）
盖玻片（25 × 50 mm）（VWR International，目录号：48393-059）
SuperFrost Plus 载玻片（带正电荷）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-550-15）
蜡笔（PAP Pen）（Abcam，目录号：ab2601）
PBS中的新鲜4％多聚甲醛（每只小鼠75毫升）（Millipore Sigma，目录号：158127-100G）
0.9％盐水（Millipore Sigma，目录号：S8776-100ML）
PBS pH 7.4（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：10010023）
PBS 中的 15% 和 30% 蔗糖（1 L PBS 中的300 g蔗糖可以在冰箱中储存长达一个月）（Millipore Sigma，目录号：S7903-1KG）
冷冻保护剂溶液（Millipore Sigma，目录号：G7893-500M）
组织包埋溶液（Tissue-Tek ® OCT 化合物）（Sakura ® Finetek，VWR，目录号：25608-930）
用于制备 PBS-T 的吐温 20（PBS 中的 0.06% Tween-20）（Millipore Sigma，目录号：P1379-500ML）
Triton X-100 用于制备 PBS-Triton-X100（PBS 中的 0.4% Triton-X100）（Millipore Sigma，目录号：X100-500ML）
用于制备封闭缓冲液的正常驴血清（PBS-Triton-X100 中的 5% 血清）（Abcam，目录号：ab7475）
用于制备抗体缓冲液的正常驴血清（PBS-Triton-X100 中的 2% 血清）（Abcam，目录号：ab7475）
核染色：TOPRO（TO-PRO-3 碘化物 642/661）（Life Technologies，目录号：T3605）
Pro-Long Gold 抗褪色封固剂（封固剂）（Thermo Fisher Scientific，目录号：P10144）
透明指甲油（或用于密封盖玻片的等效物）
一抗：
抗GFAP：Ç hicken衍生多克隆小鼠抗体针对GFAP（1:500稀释）（Abcam公司，目录号：ab4674）
抗TNF-α：ģ燕麦衍生的多克隆小鼠抗体对TNF-α（1:50稀释）（Santa Cruz公司，产品目录号：SC-1350）
二抗（针对获得一抗的物种的荧光标记二抗）：
驴抗鸡 IgY（H+L）二抗，FITC（将与 GFAP 鸡衍生的抗小鼠一抗相互作用）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：SA1-72000）
驴抗山羊 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568 （将与 TNF-α 山羊衍生的抗小鼠一抗相互作用）（Thermo Fishe r Scientific，Invitrogen，目录号：A-11057 )

设备

解剖刀
镊子
细剪刀
抹刀
-20°C 冰箱
成年小鼠脑切片机矩阵（Zivic Instruments，目录号：BSMAS001-1）
小鼠灌注仪（VWR，Leica Biosystems，目录号：10030-382）
低温恒温器（徕卡，型号：CM305 0S或类似）
共聚焦激光扫描显微镜（（蔡司，型号：LSM 510或类似）

软件

AxioVision 3.0 成像软件（Carl Zeiss GmbH，Jena，德国）
ImageJ 软件，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国（Schneider等，2012）
GraphPad Prism software, Inc., La Jolla, CA, USA

程序

用于免疫荧光的脑组织的分离和制备

小鼠灌注和脑提取

在灌注的早晨（或前一天），制作新鲜的 4% 多聚甲醛 (PFA)（Gage等人，2012 年）。
注意：该溶液新鲜制备或提前不超过 72 小时制备并储存在 4°C。

使用经心脏方法，用20 毫升冷的 0.9% 盐水（或 PBS）灌注，然后是 20 毫升冷的 4% PFA（通过缓慢灌注在 5-10 分钟内最多 25 毫升）。
鼠标被灌注后，提取大脑使用手术刀，镊子，剪刀细，并且刮刀（Papouin等人，轻轻2018）放置脑入一个50 -毫升˚F爱尔康管连接用4％PFA LLED（30- 40 毫升），并在 4°C 灌注后摇动至少 6-8 小时（但不能更多）。

Cryopreserv荷兰国际集团的大脑

在 PBS 中制备 15% 和 30% 蔗糖（1 L PBS 中的 300 克蔗糖可以在冰箱中储存长达一个月）。
地方的大脑中，在50冷15％蔗糖溶液-毫升˚F在4℃爱尔康管振荡器上过夜，或直到它们下沉。
将大脑置于 50 - ml F alcon 管中的 30% 冷蔗糖溶液中，在 4°C 下在摇床上放置 2-3 天或直到它们下沉。大脑应在冷冻后一周内在低温恒温器上切割（如下所述）。

冷冻的大脑

一旦大脑已经安顿到管的底部，将它们在异戊烷浴中快速冷冻（如下所述）。
对于下丘脑的调查，冻结整个大脑之前，就把它冠前部和后部的下丘脑，S UCH该喙（前）切只是在视交叉和尾部（后）切只是在端部下丘脑（下丘脑和脑桥之间）。使用鼠标脑图谱（Paxinos等人，2001）和小鼠脑切片机矩阵到定向的大脑解剖和以准确地切割大脑。大脑的中间切割部分将包含下丘脑。
找一个小容器，用干冰装满一半。添加异戊烷以覆盖冰。将装有一些异戊烷的小烧杯放在浴缸中间。然后将每个大脑的三个切下的部分一个一个地放入烧杯中冷冻。它们应该在 10-15 秒内变白。
冷冻后，用铝箔将大脑包裹起来，贴上标签，然后在-80°C 下放置直至准备好切片。

大脑切片

Ñ OTE ：脑切片可在12或24孔板或直接在载玻片上进行任一收集，取决于感兴趣的区域，时间可用性，和抗体的成本。12 孔或 24 孔板中的切片可在 -20°C 下储存直至进一步使用，但载玻片上的切片需要在收集后立即处理。如果在处理很多路段，最好使用24孔板处理（但此将需要更多的抗体）。但是，如果只处理几个部分，请使用载玻片以减少抗体用量。

提前打开低温恒温器 (Leica CM-3050-S)。
Ñ OTE ：该机器需要大约两小时内冷却至-2 4 ℃。确保在继续之前达到此温度。在整个切片过程中，确保机柜温度保持在 -18°C 和 -2 4 °C 之间。的温度范围，可能需要，作为用于低温恒温器切片的最佳温度取决于组织的性质，无论是组织已经被新鲜冷冻或预先固定的，随后冷冻保护，所述的型低温恒温器，以及良好灌注是如何工作的，等。如果切割出现问题，可以升高/降低温度。特别地，如果存在与预先固定的脑切片的一个问题，尝试在切割一个较低的温度下，作为前固定大脑需要非常低的温度。

将大脑带到干冰上的低温恒温器。如果只需要下丘脑的部分，则只取出与下丘脑相对应的大脑的中间切口部分。
ñ OTE ：工作快速或大脑会变形。将一对钳子放在干冰上，并带有大脑。

用乙醇清洁低温恒温器的盖子和平台。
ñ OTE ：对平台的需求侧杠杆能够提升对你解开平台。

用嵌入溶液(OCT 化合物)从低温恒温器中取出组织嵌入平台 ( OCT 模具) 。用溶液覆盖平台顶部，以螺旋运动方式移动，然后将平台放在干冰上。
使用冷钳，快速将大脑转移到平台上，其尾端坐在上面，自由的喙端朝上。然后在大脑周围和顶部添加更多的嵌入解决方案以覆盖它。将它们放在干冰上，直到溶液开始冻结（会变成白色）。放置在平台上的孔的低温恒温器的内部的左侧（图3A，3B）。
注意：另一种常用方法是在切片前将组织在嵌入平台上的嵌入溶液中预冷冻（即 OCT 模具内的 OCT 化合物）并在 -80 ° C 下储存。但是，该方法尚未在我们实验室进行测试，所以我们无法预测预嵌入和储存在-80 ° C 对蛋白质染色的影响。

一旦所有的大脑已经被移动到机器，盖上盖子，离开它了大约一个小时，因此大脑和低温切片机刀片达到相同的温度。
一旦大脑冻结，使用舞台侧面的黑色手柄放置刀片。
ñ OTE ：要格外小心周围的低温恒温器叶片，因为它们是危险的锐利。

标记 24 孔板的盖子和侧面（包括样品厚度、日期等）。使用较大的巴斯德吸管将冷冻保护剂溶液至少填充一半。每个小鼠大脑使用一个 24 孔板。
将带有样品的嵌入平台锁定到前支架中并调整到位。
ñ OTE ：您可以通过按下按钮在低温恒温器的前面，而不是仅仅转动拨盘移动整个设备靠近叶片。

确保使用低温恒温器上的刻度盘将机器设置为所需的厚度。
Ñ OTE ：20-30μM厚度通常用于免疫荧光。

继续对大脑进行切片（图 3C）。使用细漆刷将部分转移到 24 孔板（图 3D、3E）。
ñ OTE ：您可以放弃前几片，因为它们可能会由刚刚安装介质，而不是脑组织。

一旦大脑变得可见，将切片放置在含有冷冻保护剂的 24 孔板内的连续井中（图 3E、3F）。
ñ OTE小号：

使用鼠标脑图谱（Paxinos等人，定向的解剖2001年）的大脑（下丘脑）切片; 这需要实践。首先，两个侧脑室出现在切片开始处，随后出现第三个脑室，每侧都有下丘脑。
在成年小鼠，下丘脑是约5毫米长，这样将有大约250个切片用20μ米厚度和大约166个切片用30μ米的厚度。因此，如果在 24 孔板的每个孔中依次收集脑切片，则每个孔将包含来自整个下丘脑的 6-10 个切片。
或者，使用图谱，可以在 24 孔板的每个孔中依次收集一定数量的大脑切片（即大约 6-10 个切片）。必须注意如何收集切片以避免在处理免疫荧光时混淆。
尝试以从低温恒温器把它们转移时到所述板，以避免损坏最小化在电刷和部分之间的接触面积。另外，尽量以降低部分插入的舒服，所以中心，以避免出现与双方接触。
完成后，用保鲜膜盖住盘子并储存在 -20°C 的冰箱中。
ñ OTE ：一定要清洗的低温恒温器，使用后嵌入平台（最重要的卸下刀片，以保持其寿命）。

图 3. 将小鼠大脑切片并将切片转移到 24 孔板中的冷冻保护剂溶液的步骤。A.组织包埋平台（OCT霉菌）使用，该平台的顶小号覆盖有溶液以螺旋运动的方式移动，并且平台被放置在干冰。使用冷镊子，大脑被迅速转移到平台上，其尾端坐在上面，嘴端自由端朝上。在大脑周围和顶部添加更多的嵌入溶液以充分覆盖它；B.上面有大脑冻结的平台留在干冰上，直到溶液开始冻结（将变成白色）。将所有大脑移入低温恒温器后，关闭低温恒温器的盖子，将大脑留在里面一个小时，使大脑和冷冻切片机刀片达到相同的温度；C.在低温恒温器上使用所需的厚度（20-30 µM 厚度通常用于免疫荧光），对脑组织进行切片；D 和 E.使用细画笔，将切下的冷冻脑切片转移到装有冷冻保护剂溶液的 24 孔板中；F.一个 24 孔板的单个孔的放大图像，里面装满了冷冻保护剂溶液和内部漂浮的大脑切片。

脑切片标记：用一抗和二抗阻断和孵育
从 -20°C 冰箱中取出含有大脑切片的24 孔板（每个 24 孔板含有冷冻保护剂中的单个小鼠的脑切片）。取一个新的 24 孔板，用 PBS-T 填充所有孔（图 4A）。将大脑切片从单个小鼠的一口或两口井转移到装有PBS-T的新 24 孔板的一个单独的井中（图 4B）。使用精细的画笔将大脑部分从冷冻保护剂转移到 PBS-T。在从防冻剂PBS-T传输会造成的扩散冷冻保护剂和包埋剂，和大脑切片将蔓延。
Ñ OTE ：准备至少2个孔的第一抗体的阴性对照。这为成像提供了更多控制部分（这些部分在连续频繁洗涤过程中很容易损坏）（图 4B）。

图 4.将储存在 24 孔板中的冷冻保护剂溶液中的大脑切片转移到新的 24 孔板中，在 PBS 中含有 0.06% Tween-20（PBS-T）。A.准备好新的24孔板，内装PBS-T，并准备好细刷子和用清水清洗刷子的容器；B.取出所有含有浸入单个小鼠冷冻保护剂中的脑切片的24 孔板，并将来自单个小鼠的一个或两个孔的脑切片转移到新的 24 孔板的一个单独的孔中，其中填充有 PBS- T。精细画笔用于将大脑切片从冷冻保护剂转移到 PBS-T。使用 1 至 3 只小鼠的脑切片制备至少 2 个用于初级抗体阴性对照的孔。

洗涤4 ×用PBS-T，每次洗涤15分钟回转平台上。对于“洗涤”步骤，每次使用细画笔将大脑切片转移到充满 PBS-T 的新井中（参见视频 1）。对阴性对照大脑部分使用单独的刷子，并首先用这些部分开始清洗，以避免任何污染。

视频 1. 在“清洗”步骤中使用细刷将大脑切片转移到新孔中。

Ñ OTE ：适当地固定在板和监测速度-如果速度迅速增大，该板可以被如果没有适当的安全移位。

在洗涤之间È S：
解冻血清等分试样。血清应与二抗的宿主物种相同。
注意：如果两种二抗的宿主物种都是驴，则使用驴血清

使用PBS-T准备封闭缓冲液。
准备额外的封闭缓冲液，因为它可以进一步稀释以制备一抗。
为了封闭组织中的潜在背景，每孔使用 1 ml 封闭溶液，剩余的可以稀释并用于制备一抗。
转移的脑切片成用于最小的封闭缓冲液孵育在室温下2小时erature或最佳过夜，在4℃。
Ñ OTE ：10％小号在erum PBS-T也可用于阻断所述组织，但最少1个小时。

阻断后，将脑切片转移到抗体缓冲液中，并适当稀释一抗。
Ñ OTE ：稀释的p rimary抗体可以是混合在一起并同时温育。在 24 孔板的每个孔中加入 0.5 至 1.0 ml 抗体缓冲液。使用较少的抗体将降低成本。

在 4°C 下孵育 12-24小时。
洗涤4 × ，用PBS-T缓冲液，每次洗涤15分钟，在室温下在回转平台上。
Ñ OTE ：启动与第一抗体的阴性对照切片先与初级抗体避免污染。

用 5% 的阻塞缓冲液阻塞部分 1 小时以减少背景。
Ñ OTE ：它是可以接受的，如果需要跳过这一步，作为组织应该已经被充分阻断。

转印部与抗体缓冲的二次抗体和核染色的适当稀释。
ñ OTE小号：

通常情况下，1：500稀释，用于FITC二抗，和1：1 ，000稀释用于的Alexa Fluor二抗体和核染色（TOPRO）。
使用每组中的一些部分作为阴性二级抗体控制s 。用这些部分制作一个单独的 24 孔板，并使用单独的细画笔避免任何二次抗体的污染。
在室温下孵育 1 小时或在 4°C 下孵育过夜。
Ñ OTE ：盖与铝箔避免了荧光标记的漂白。

洗涤4 × ，用PBS-T以下次级抗体一个回转平台上温育，每次洗涤15分钟。
Ñ OTE ：盖与铝箔时，能够避免所述荧光团的漂白。

最后一次洗涤后，转移的部分，以PBS，慢慢地安装到切片用细刷子正电荷防滑梯。
Ñ OTE ：尽可能减少切片环境照明的曝光，并且在可能时保持箔盖过的章节。将幻灯片放在带盖子的幻灯片支架盒内, 以避免将大脑部分暴露在光线下。可以在载玻片上完成一抗和二抗偶联的整个过程。将切片放在载玻片上后，用蜡笔将其圈起来，然后按照上述程序染色载玻片。这将使用更少的试剂和削减成本substan牛逼ially只有几片。

等到载玻片上的所有部分都变干。
在 4°C 的离心机中，以 1200 rpm 的速度旋转抗褪色封固剂 10 分钟，使任何固体颗粒沉淀在试管底部，不会产生任何背景信号。
免除了微量UM量的抗褪色安装媒体和安装盖玻片。
在室温或 4°C 下在黑暗中干燥 24 小时，并用透明指甲油密封边缘。
从配备彩色数码相机和 AxioVision 3.0 成像软件的蔡司 LSM 510 共焦直立显微镜上从免疫染色切片中捕获图像。使用相同的曝光时间捕获荧光图像，而不会使像素强度饱和（图 1A、1B、2A、2B）。

数据分析

使用的ImageJ软件（施耐德等人，2012）来测量免疫荧光（光密度）的一种方式，使得样品没有识别到评估器的强度（盲法）。
为了测量荧光强度，背景是基于在几个方面的平均强度而没有任何可检测的免疫反应性，首先确定，然后强度被确定为信号-到-使用背景强度比的ImageJ软件。
在每组控制或治疗动物中，使用来自单个动物的所有部分的强度测量值的平均值进行统计分析。
表达结果作为所述神经胶质或神经元细胞的标记的下丘脑中的每组小鼠的或相对强度，如果两种抗体被使用时，炎症和内质网应激的标记物的共表达中下丘脑弓状核为每个组的老鼠。
分析了使用GraphPad Prism软件数据。使用双尾学生t检验比较两组。对于两个以上的组，即使用单向或方差分析（ANOVA）的双向分析，适当进行统计分析，并确定一统计显着性事后使用Bonferroni方法，Holm的-Sidak方法分析，或学生的吨-test与P < 0.05（图小号1C，2C）。

笔记

备择方案
如果无法使用 4% PFA 进行灌注，或者灌注不成功，则大脑应在 4% PFA 中于 4°C 下固定过夜。
脑切片可以在室温下孵育 2-24 小时，具体取决于感兴趣的蛋白质表达的突出程度。
对于双标记免疫荧光，推荐使用远红荧光核染色，但对于单标记免疫荧光，应使用TOPRO 。或者，根据所使用的其他抗体的波长，可以使用其他核染色剂，例如 DAPI 或 Hoechst。

故障排除
如果大脑不能正常冷冻保护，有一个越来越冻结人为效应的几率较高。
如果该抗体稀释是不正确的，有一种可能性，即抗体信号将会丢失，将会有准确的分析太多的背景。您可能需要调整一抗和二抗的稀释度，以确定所需的最佳浓度。
建议熟悉所研究器官的完整地形解剖学，尤其是大脑。有可用于此任务的参考书。使用小鼠脑图谱（Paxinos等，2001）。
为了获得更好的分辨率，请勿使用旋转圆盘成像显微镜。

致谢

我们感谢加拿大卫生研究院研究（CIHR），加拿大糖尿病协会（CDA），和加拿大研究主席（CRC）计划资助这项研究（DDB）。非常感谢班廷和最佳糖尿病中心 (BBDC)、国家科学与工程研究委员会 (NSERC) 和安大略研究生奖学金 (OGS) 计划（PSD）提供的奖学金支持。该协议改编自 Dalvi等人。(2017)。

利益争夺

该作者声明没有竞争利益。

伦理

所有的动物实验都进行批准从加拿大多伦多大学的动物护理委员会。标准核定住房条件包括的12小时光暗周期和住房食物和水的广告libidum ，与建议的环境富集。

参考

Dalvi, PS , Chalmers, JA , Luo, V. , Han, DY , Wellhauser, L. , Liu, Y. , Tran, DQ , Castel, J. , Luquet, S. , Wheeler, MB和Belsham, DD (2017) ）。高脂肪诱导下丘脑的急性和慢性炎症：高脂肪饮食、棕榈酸酯和 TNF-α 对调节食欲的 NPY 神经元的影响。Int J Obes（伦敦）41（1）：149-158。
Gage, GJ, Kipke, DR 和 Shain, W. (2012)。啮齿动物的全动物灌注固定。J V是E xp (65): 3564。
Papouin, T. 和 Haydon PG (2018) 。获得急性脑切片。生物协议8(2)：e2699。
Paxinos, G. 和 Franklin, K. (2001) 。立体坐标中的小鼠大脑。国际标准书号：0125476361、9780125476362 。学术出版社。
施耐德，加利福尼亚州，拉斯班德，WS和 Eliceiri，KW （2012 年）。NIH Image to ImageJ：25 年的图像分析。Nat 方法9(7): 671-675。