材料和试剂

Sigmacote （Sigma Aldrich，目录号：SL2）
鹘b acteriological的Petri d ISH盖子，尺寸35-60毫米中（Falcon，康宁，目录号：351008）
砂纸
散热器化合物（RS，RS Pro，目录号：554-311）
有机细玉米粉（HBC Trading Australia，TUN 编号：19339337303842）
糖蜜（w ^孔乙ODY ħ ealth Ç ompany ，目录号码：MOL 600）
B型酵母圆环（HJ Langdon Co.，目录号：45014）
琼脂 750 g（HJ Langdon Co.，目录号：44305）
多乐士Metalshield Flat Vivid 白色环氧搪瓷喷漆（或类似产品）（多乐士，目录号：32C04912）
饮食（见食谱）

设备

瓶子6盎司方底PP（Pathtech ，Genesee Scientific，目录号：076-32-130F）
果蝇v IALS，精细，PS（Pathtech ，杰纳西科学，目录号码：076-32-109）
Benchtop F lowbuddy Complete（Pathtech ，Genesee Scientific，目录号：076-59-122BC）
FitoClima 600/1200 PLH 昆虫研究室 ( Aralab )
Superfine Vannas Scissors，8 cm（World Precision Instruments，目录号：501778）
Viltrox LL-126VB LED 灯（Viltrox ，目录号：LL-126VB）
热/冷板NG（Ugo Basile，目录号：35150）
Testo 925 K 输入手持式数字温度计（RS，testo，0560 9250）
C920 HD pro 网络摄像头（罗技，目录号：960-000764）
铝板（200 × 200 × 3 mm），内部制造

软件

BORIS （Friard和岗巴，2016年，https://www.boris.unito.it/）
Ctrax （布兰森等人，2009，http://ctrax.sourceforge.net/）
any2ufmf （布兰森等人，2009 年，http: //ctrax.sourceforge.net/any2ufmf.html ）
R（R 基金会，https://www.r-project.org）
R Studio ( https://rstudio.com )
Github上ř epository（https://github.sydney.edu.au/jmas3890/Hot-Plate-Assay.git）

程序

飞准备和我njury
注意：除了物理腿截肢，对照苍蝇应与实验苍蝇完全一样对待。

在 2 5 的两天内以 20 只雌性和 5 只雄性苍蝇的标准密度准备飞交叉° Ç ，65％湿度，以及一个去除父母之前12小时光照/黑暗周期。
在最初的蛹羽化两天后，将 F1 后代放入容器中并允许交配两天。
上的光CO选择健康的，完整的雄蝇2 （升ESS大于5升/分的CO 2使用Flowbuddy ，通过一个递送Flypad ）在标准标准密度果蝇小瓶中并允许其老化直到苍蝇7-9天龄之间，每 2 天换一次新食物。
在轻度 CO 2 下，使用手术剪截断右中腿股骨，同时将对照未受伤动物暴露于 CO 2中（图 1 ）。
每瓶放一只苍蝇，并允许再恢复 7 天，每 2 天换一次新食物。

图片包含，动物，水，房间描述已自动生成

图1 。腿部受伤的模型显示了股骨截肢的位置

热板准备
得到铝方板与尺寸小号热板的直径相匹配（这确保板为1-5毫米厚之间，以确保有效的热传递）。
使用薄层，在铝板上涂上白色哑光漆。
注：小号祈祷涂料最适合这个。

画白色是为了确保良好的跟踪，因为白色背景上的黑色苍蝇效果最好；但是，如果这不是问题，请跳过此步骤。
油漆干燥后，将铝板放在Ugo Basil 热/冷板的顶部（图 2 ）。

图形用户界面描述已自动生成

图2 。的布置的设备所需的热板试验。一个。的排列的羽后巴西莱热/冷板，数字吨hermometer，铝板，竞技场，照相机，和外部风扇。乙。简化示出俯视图的位置的铝板的上方的羽后巴西莱热/冷板和舞台。

竞技场准备
取35-60 -毫米直径的Petri培养皿盖，并使用砂纸，除去大部分的壁直到它们之间1-2毫米高。
治疗与Sigmacote帮助制止了苍蝇从攀爬墙壁和天花板上。
注意：可能需要 1-2 层。

生成一个标准曲线
将热板设置为在3 分钟内从 25 °C升至 50° C 。
使用热-转印介质，放置所述的尖端一个数字热探针在板的中心（或大致其中蝇会）。
让板运行并冷却几次，并每 2 秒记录一次温度，持续 3 分钟和 15 秒。
注意小号：

这是最好的拍摄用相机，C920高清网络摄像头亲读出完成，或类似的。
这将在稍后用于将行为的时间与当时的温度相关联。

热p后期分析
将热板设置为在3 分钟内从 25°C 升温至 50° C 。
将一只苍蝇放在盘子上，然后用预制的舞台快速覆盖/捕获。
笔记：

这可以通过简单地将单个苍蝇从其小瓶翻转到板上并快速覆盖竞技场来完成（此方法需要不到 30 秒的恢复时间）。或者，可以使用抽吸器或轻度冰麻醉（在 1-2 分钟之间，然后让恢复时间加倍）。
CO 2不应在伤害感受实验当天用于麻醉苍蝇，因为这可能会影响行为。
同时启动相机（1080 p 和 30 fps）和热板，并在让板再次冷却之前记录 3 分 15 秒（195 秒）。
注意：可以使用多个外部风扇来帮助冷却。

开始前的下一个实验重复，保证了板已经返回至25℃使用一个热探针。
每个实验组重复5次（即，5只对照果蝇和5只人受伤苍蝇）为一个技术重复。
技术重复应在不同的日子进行，以避免同-天实验误差。

数据一nalysis

逃生使用响应（跳转）分析了BORIS行为跟踪软件。有关详细的用户手册中的BORIS软件可以在他们的网站上找到（https://www.boris.unito.it/）。
创建一个新项目并将时间格式设置为秒。
创建具有两种行为的 ethogram 。一个SSIGN这些任何ķ你想EY ; 然而，使用 1 和 2 等数字通常是最简单的。我们分配的行为是：
跳转行为（图 3 ）。
死亡（这也可用于评估热敏感性）。
注意：这里的死亡是由飞卷曲和停止进一步运动来定义的。

图片包含文字, 墙壁, 白色描述已自动生成

图3 。来自头顶视频的连续帧显示跳跃行为。每帧的左下角显示整个竞技场视图。

将此项目保存在与盲视频相同的位置。
创建一个新观察并将其命名为与您要评分的视频相同的名称。
注意：为了便于使用，我们随机为视频分配一个序列号。

将观察时间限制在 0.000 秒和 195.000 秒之间（行为al检测的长度），然后加载视频进行评分。
手动注释盲视频中的跳跃。影片可以暂停，放慢，或跳过向后，以帮助我ñ行为人的注释。
将所有视频作为自己的观察评分后，使用“观察”选项卡下的“导出事件”选项将事件导出为表格事件，并选择“.csv”作为文件选项。请务必将死亡事件和跳转事件分别导出到单独的文件夹中。

行为人的事件分析
一般情况下，这种分析的脚本有三个主要组件：小号TANDARD曲线创建，使用揭盲ķ EY ，和跳跃列表。在这里，我们提供了标准曲线和关键文件所需的格式的一般描述，以及如何在脚本中利用这些来执行分析。

为了进行分析，只需将所有文件（事件的.csv文件，标准曲线文件，以及ķ EY）到同一个文件夹，更改工作目录的路径，这是存储在哪里（在哪里做，这是在脚本中表示) ，然后执行脚本。需要的所有脚本都在GitHub的[R epository以及示例文件。

1.标准曲线。

该脚本将根据记录时的平均温度生成一条曲线。然后在脚本中稍后使用该曲线来将跳跃时间与当时的温度相关联。

将在生成标准曲线时记录的温度记录在 .csv 文件中，列标记为（时间、Rep1、Rep2、Rep3 ；参见GitHub 存储库中提供的示例）。

2.揭盲。

这一过程将花费BORIS导出的事件文件的名称，这应该对应于盲视频名称（即，1.csv，2.csv，等等。），以及对视频的原始名称中列出的归属关系钥匙。要使此过程正常工作，正确格式化密钥文件很重要。

关键应格式化，使第1列是原来的名字和列2是盲名（w ^ E使用增加的数字）。

注意：解盲过程将在脚本中将盲名转换为数值。如果在盲法过程中未使用数字，则脚本的这一部分可能不再起作用，并且需要重新编写以进行分析。相关部分在 GitHub 存储库中包含的脚本中进行了标记。

跳跃的列表（图 4 ）。
制表是以 1 度的 bin 间隔完成的（尽管这可以更改并且在脚本中指示了在哪里这样做）。
制表开始于 27.5°C，结束于 49.5°C ；这些温度也可以在脚本中更改。此过程将包括 49.5°C 下的事件。
此脚本将导出一个文件，其中列显示单个果蝇，行显示该 bin 中的逃逸行为数量。bins 增加 1°C，并用较低的值而不是 bin 中心标记，后者将高 0.5°C（即，27.5-28.5°C 的 bin 将具有 27.5°C 的标签和 bin 中心28°C）。
还有一个功能可以将总跳跃量制成表格，而与温度无关。
注意：然后可以执行多种类型的分析，包括比较各个温度区间的性能或峰值分析，以了解跳跃的形状和分布。

图4 。跳跃控制和受伤的 Canton-S 飞行。7 - 9天-老雄广-S飞行右股骨截肢和他们逃跑反应热刺激被记录7天后最初的损伤。数据表示为在平均值±SEM。

速度一个nalysis （图5 ）
速度分析可识别的动物一个有用的工具是可能出现的，从健康状况不佳（除了预期损伤）电机的问题。在实验组内速度显著滴可用于确定是否这些动物应从所有analys去除ë秒。可以使用对整个测定的平均速度的异常值去除评估来识别此类动物。

将视频文件转换为 . ufmf格式（使用“any2ufmf”）。
轨道苍蝇使用Ctrax软件或其它适当的跟踪软件（详细的用户指南，Ctrax和any2ufmf可以Ø找到ñ他们的网站，http://ctrax.sourceforge.net/）。
注意：由于在高温下速度增加，跟踪容易出错。提高帧速率和分辨率将有助于但不能消除发生错误的可能性。Ctrax提供了一个 MATLAB 平台来手动注释跟踪错误。

跟踪后，导出为“.mat ”文件扩展名并使用 R 脚本估算速度（使用简单公式v = d/t估算速度）。要执行分析，请将所有相关文件放在同一文件夹中，将工作目录更改为该文件夹，然后执行 R 脚本。
这个 R 脚本的工作方式与转义响应脚本非常相似；^ h H但是，它不会进行揭盲，所以影片不能被蒙蔽。这也需要类似的输入（即，标准曲线文件和所有.MAT文件）。
在这一步可以使用简单的异常值去除测试来去除跟踪错误。
此脚本将输出两个 .csv 文件。一个文件将列显示为单独的苍蝇，行显示为在相应温度下发生的速度。另一个文件将显示每个单独飞行的平均速度。

图5 。控制和受伤的 Canton-S 苍蝇的速度 (pixels.s -1 )。7 - 9天-老雄广-S飞行右股骨截肢和他们逃跑反应热刺激被记录7天后最初的损伤。数据表示为在平均值±SEM。

笔记

该协议将具有基于个体实验者的大量可变性。每个项目的评分应由同一人盲进行。此外，在果蝇健康状况不佳的情况下，数据质量会很差，而食品质量将在很大程度上促成这一点。苍蝇应保持新鲜食物，并每 2-3 天转移到新食物。这个实验是表现最好的一式三份，具有三个独立的十字架和记录，以消除同三个独立的天-天实验误差。

食谱

饮食
玉米粉 (3.5% (w/v))

琼脂 (2% (w/v))

糖蜜 (8% (w/v))

酵母 (1.2% (w/v)) 和水

致谢

此方法是该方法的一个适配描述了ð通过Khuong等。，2019 年，DOI：10.1126/ sciadv.aaw 4099 。

这项工作得到了国家卫生和医学研究委员会 (NHMRC) 项目资助 APP1026310、APP1029672、APP1028887、APP1046090、APP1042416 和 APP1086851 的部分支持。GG Neely 得到了 NHMRC 职业发展奖学金 II CDF1111940 的支持。最后，我们感谢 John Chong 和 Anne Chong 对我们实验室工作的财政支持。

竞争我nterests

这项工作的作者没有要声明的利益冲突。

参考

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