材料和试剂

1.标准组织培养用品（组织培养处理板，磷酸盐缓冲盐水（PBS），血清学吸管，等等）
2.瓶顶真空过滤瓶，孔径为 0.22 μm ，可容纳 >50 ml 或等效过滤系统（Corning，目录号：CLS430624）
3. 70 μm细胞过滤器（Falcon，目录号：352350 或等效物）
4. 5 ml FACS 管，带 35 μm滤网帽（Corning ，目录号：352235）或等效物
5.胶原酶II（Worthington Biochem ，目录号：CLS-2）
6.胶原酶IV（Worthington Biochem ，目录号：CLS-4）
7. Hyclone Dulbecco改良Eagle培养基/ F12（GE Healthcare，目录号：SH3002302）
8. L-谷氨酰胺（Gibco，目录号：25-030-149）
9.胎牛血清（FBS）（Corning公司，目录号：35-016-CV）
10.抗生素-抗真菌溶液（Gibco，目录号：15-240-062）
11.抗坏血酸（Sigma，目录号：A92902）或等效物
12.台盼蓝溶液 0.4%（Gibco，目录号：15250061）
13.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Hyclone ，目录号：SH30256）
14.牛血清白蛋白冻干粉（Sigma，目录号：A2153）
15.钠叠氮化物（Sigma公司，目录号：S2002）
16. （可选）如果通过 qPCR 进行样品质量控制：
RNA 提取试剂盒（Quick-RNA Microprep试剂盒，Zymo目录号：R1050）
cDNA合成试剂盒（Applied Biosystems，目录号4368814）
qPCR 耗材
Taq M an Gene Expression Assay (FAM)（ThermoFisher Scientific目录号：4331192）或同等产品。
Taq M是质量控制基因（或Sybr等价物）的探针。我们使用：MMP3 （Hs00233962_m1），MMP9 （Hs00957562_m1）和MMP13 （Hs00233992_m1），并计算COL2A1 / COL1A1使用的Ct比Hs01060358_m1和Hs00164004_m1和归一化到actin为从赛默飞世购买了持家基因（Hs01060665_g1）。
17. Cell-ID TM Cisplatin-194Pt（Fluidigm ，目录号：201194）或等效物
18. Cell-ID TM IdU （Fluidigm ，目录号：201127）或等效物
19.氯化钠（NaCl）（Sigma，目录号：S988）
20.氯化钾（KCl ）（Sigma，目录号：P9541）
21.磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Sigma，目录号：S7907）
22.磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma，目录号：P5655）
23.氢氧化钠（NaOH）（Sigma ，目录号：S8045）
24.无菌双蒸水（Hyclone ，目录号：SH3053801）
25. 0.25% 胰蛋白酶，0.02% EDTA（Sigma，目录号：59428C）或等效物
26. 16%多聚甲醛水溶液 EM 级（电子显微镜科学，目录号：15710）
27. （可选）Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit（Fluidigm ，目录号：201060）
28.甲醇（Sigma，目录号：34860）
29. Cell-ID Intercalator-Ir （Fluidigm ，目录号：201192A）
30. EQ 四元素校准珠（Fluidigm ，目录号：201078）
31. Maxpar细胞染色缓冲液（Fluidigm公司，目录号：201068）或homema d根据配方E，注意不要使用的容器用具有高钡含量皂，因为这将给予了很多的背景。
32.金属偶联抗体面板
这些将特定于您感兴趣的实验。一些可以购买由预缀合Fluidigm公司，或者可以使用被标记Maxpar X8多金属标记试剂盒（Fluidigm公司，目录号：201300）。请参阅格兰迪等人。（2020 年）获取我们的完整抗体列表。
33. （任选）˚F或软骨细胞的质量控制，包括在面板SOX9和CD44
SOX9 ( Abcam , 克隆 3C10)
CD44（生物传奇，克隆 IM7）
34.完整的软骨细胞培养基（见食谱）
35.胶原酶溶液（见食谱）
36.细胞染色培养基（CSM）（见食谱）
37.低钡PBS（1×磷酸盐缓冲盐水）（见食谱）
38.低钡 PBS 中的0.5 μ M顺铂（参见配方）
39.细胞固定液（见配方）
40.带有 Cell-ID嵌入器的CSM （参见食谱）
41.带有 Cell-ID嵌入剂和 4% PFA 的CSM （参见配方）

设备

细胞培养箱 (5% CO 2 , 37 °C)
生物安全柜
用于细胞监测的光学显微镜
细胞计数器或血细胞计数仪
Vortex Genie 2（或同等产品）
CyTOF TM版本 2 质谱流式细胞仪 ( Fluidigm ) 或同等产品
（可选）超级采样器（维多利亚时代飞艇和科学仪器）
带温度控制的离心机
校准移液器
（可选）实时荧光定量 PCR 仪

软件

Cytobank ( https://www.cytobank.org/ )用于数据可视化和质量控制
我们也将其用于tSNE嵌入和FlowSOM分析，尽管这可以使用 Python 或 R 包来完成。
如所描述的被用于可视化数据的自定义脚本之前（格兰迪等人，2020）。
此外，还有其他 R 包可用于cyTOF数据分析，包括用于簇生成的FlowSOM（Van Gassen等人，2015 年）和用于确定组间差异的Citrus（Bruggner等人，2014 年）。

程序

人类软骨组织的加工和培养
根据我们批准的 IRB 协议，从单侧或全膝关节置换术的手术丢弃物中收集整个软骨样本。
使用手术刀将c软骨从骨头上刮下来。如果需要的话，视觉评分可以在此时进行1级之间进行区分- 4软骨（用于分级的例子，请参见罗格斯等人，2010）。
地点1 - 2毫米软骨片在完全培养基标准组织培养处理板中，在37组织培养培养箱中过夜℃，用5％的CO 2 。当我们收到全膝关节置换样品并将样品放入 15 - 20 毫升培养基（或足以完全覆盖碎片）时，我们通常使用 15 cm 2培养皿。如果样品非常小，则可以将其缩放到 10 cm 2培养皿。
第二天，监测样品是否有任何细菌生长。这将在样品中显示为“沙质”颗粒，在光学显微镜下可观察到。向样品中加入 10 ml胶原酶溶液（胶原酶溶液与培养基的比例为 1:2），并在 37 °C的组织培养箱中过夜消化，含5% CO 2 。
菌株细胞通过70 μ米过滤到50ml管中并旋在300 ×克，在室温下（RT）5分钟以沉淀细胞。
使用软骨细胞完全培养基在标准组织培养处理板上以 30,000 - 35,000 个细胞/cm 2 的速度铺板细胞。将细胞保持在 37 °C，含5% CO 2 。
监测细胞生长。通道0（P0）细胞通常在汇合3 -电镀后4周。根据我们的经验，细胞在保持高密度并生长至 100% 汇合时保持最佳形态。细胞保持其性能为1 - 2次传代。维持软骨细胞完全生长培养基中的细胞，改变了媒体每隔3 - 4天是必要的。如果您想扩大细胞数量，我们建议以高密度传代。细胞可以通过用胶原酶溶液（1M处理它们传代升每4米升介质）过夜，用1纺丝下来，并洗出胶原酶× PBS ，并重新铺板的细胞以30,000 - 35,000个细胞每cm 2上的标准组织培养处理过的平板。

加入活/死筛查和增殖的标签
在开始之前：
将一瓶 PBS 冷却至 4 °C，并保持在冰上，然后将另一瓶置于 RT。
将新的 0.25% 胰蛋白酶等分解冻至 RT。
将离心机冷却至 4 °C 。
寒意低收入b arium PBS（见ř ecipes和Ñ OTES部小号）和细胞染色培养基（CSM）至4 ℃，并保持在冰上。

将Idu直接添加到现有细胞培养基中，最终浓度为 25 μ M。将细胞放入 37 °C培养箱中 15 分钟。
用冷的无菌 PBS清洗Idu ，至少进行两次洗涤。额外的细胞洗涤将有助于去除死细胞。
在 RT PBS 中制作 0.5 µ M 顺铂混合物（最终浓度）；˚F或10厘米2板，加-5 M升或足以覆盖板的底部。
将0.5 µ M 顺铂混合物直接添加到盘子上洗涤过的吸出细胞中，并在 RT 中孵育5 分钟。
用完全培养基洗涤细胞两次。

收获培养的软骨细胞
用 RT PBS 清洗细胞。
加入 10 毫升（或足以覆盖板表面）的 0.25% 胰蛋白酶，并在 37 °C细胞培养箱中孵育 10 - 15 分钟（监测板以查看细胞何时抬起）。
使用完全培养基以 1:1 的比例与胰蛋白酶中和酶。
通过转移到 50 ml 锥形管中从板上收集细胞，用 RT PBS洗掉任何剩余的细胞，并在 4 °C 下以 500 × g旋转5 分钟。
洗涤细胞两次用2毫升的冷PBS以除去过量的胰蛋白酶。每次洗涤之间，应变通过将细胞35 μ米的过滤器（例如，在FACS管中的那些），以使单个-细胞悬浮液。预计这里会有大量的细胞损失。我们通常在 10 cm 2培养皿中进行这些实验。过滤之前，我们预期收入3之间-软骨4万元。过滤后，这可以在 1 - 200 万个软骨细胞单线态之间变化。
使用血细胞计数器或等效设备对细胞进行计数。我们使用 4 平方平均法进行计数，其中总细胞数/ml = 4 平方中细胞计数的平均数×稀释因子× 10 4 。将细胞保持在冰上以进行固定协议。
（可选）取 10,000 - 50,000 个细胞进行 RNA 提取，以对样品进行质量控制。可以使用标准柱试剂盒分离 RNA。的cDNA代（以下制造之后- [R的规格）中，每个样品应检查其COL2A1 / COL1A1比，在的情况下OA软骨，对于MMP 3,9 ，和13的表达使用定量实时PCR（qPCR的）。可以使用标准的 de l ta delta CT 方法 ( Livak 2001)计算相对表达。为确保样品不被去分化，Col2a1/Col1a Ct 值的比率应 > 1，尽管每个样品的确切比率会有所不同。在我们手中，OA 软骨中的Mmp表达比健康软骨高10 - 10,000 倍（图 2A）。
图 2. 软骨样本和cyTOF数据的质量控制。A.来自 5 个健康（蓝色）和 20 个 OA 软骨样本（黑色）的MMP3、MMP9和MMP13表达的代表性值。绘制的值用肌动蛋白作为看家基因并相对于一个正常软骨样本进行标准化。COL2A1和COL1A1表达被示出为比。所有保持成软骨表型的样品应当具有COL2A1 / COL1A1比> 1。数据是从与Grandi等人相同的患者中重新分析的。（2020 年）。B.运行时间归一化前后的 EU 控制珠信号。这有助于在内部（在运行时间）和运行之间对样本进行标准化，如下所示。C.两个健康软骨样本的点图，显示 SOX9 和 CD44 的表达，如通过cyTOF测量的。在每个轴上表达反正弦变换，和一个代表栅极被示出，虽然这会随信号而改变-给-每次运行的信噪比。左边是在活细胞的> 74％（高品质的样品的一个例子即，顺铂负）事件染色两者SOX9和CD44。右侧是未包含在下游分析中的低质量样本示例，其中 <2% 的活细胞事件位于 SOX9/CD44 门内。D.对在两个不同的临时分离批次（橙色和蓝色）上分析的相同软骨样品绘制了SOX9细胞表达的直方图。左图描绘了归一化前的样本；请注意，虽然样本完全来自同一患者，但强度看起来不同。右边的图形示出了相同的一组样品的小号，但是归一化之后，当染色强度是相当的。

制备单-细胞悬浮液和固定软骨细胞样品
重悬0.5 - 1个百万细胞在1ml的细胞固定液（900 μ PBS的升和100 μ 16％PFA的升，对于最终1.6％浓度）在FACS管。始终为珍贵样品打开一个新安瓿，因为 PFA 会随时间迅速降解。确保均匀的单-细胞悬浮液是键; 否则，细胞团将固定在一起。如果您有更多或更少的细胞，可以按比例放大或缩小固定。
在 RT 中孵育细胞 10 分钟。
用 4 ml CSM 清洗两次。离心机在500 ×克在4 5分钟℃，并储存在沉淀<100 μ升CSM的在-80 ℃下。样品可以通过这种方式保存多年，质量损失最小。我们的实验室已对样品进行了长达三年的分析。为避免冻融循环，我们建议您小量分装样品。通常，0.5 -每个样品1百万细胞是必需的平均条形码cyTOF运行。

（可选）使用Fluidigm 的Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit对多个样品进行条形码
仅当您希望将多个样品作为单个批次运行并合并所有样品时，才需要此条形码步骤。我们建议这一点，如果看荷兰国际集团在多个条件，因为它最大限度地减少批量染色效果。
在冰上解冻冷冻细胞。
洗涤细胞两次用4ml的RT条形码透化缓冲液（包含在小区ID 20-PLEX条形码试剂盒）。
重悬800每个样品μ的升RT条形码透缓冲器。请确保您有细胞的数目相等的样品S ^您比较。对于软骨细胞，我们的目标是每个患者或每个病症0.5 - 100万个细胞。
每个条形码重悬d样品在100 μ的升RT条形码透缓冲器，并转移到合适的样品。通过上下移液五次立即混合。记录哪个条形码与哪个样本对应。
在 RT 中孵育样品 30 分钟。
在 4 °C 下以 500 × g离心样品 5 分钟。用 2 ml CSM 清洗两次。
将所有细胞合并到一个管中。

细胞外和细胞内染色
如果您有条形码单元格（来自 E 部分），请跳至步骤 3。
如果您没有条形码单元格：
在冰上解冻冷冻细胞。
用 2 ml CSM 清洗细胞两次。
过滤细胞通过35微米FACS管的过滤器帽和计数的细胞的总数。该值将用于计算要使用的抗体量。
沉淀细胞对在500 5分钟×克在4 ℃下右之前重悬在抗体混合物它们（见下文）。
制备在细胞表面抗体鸡尾酒根据细胞的总数染色培养基在管中和您的抗体的滴定浓度（见Ñ滴定考虑OTES）。尽量保持体积低于 500 μl 。Ç运行之间onsistency更重要; 因此，染色同一体积中的所有迭代。有关染色方案的更多详细信息，请参阅Leipold和Maecker (2015) 以及 Lin等人。(2015) 。
将细胞在冰上染色 30 分钟（根据您的条件，如有必要，可以更长时间）。
洗涤细胞三次，用1M升的CSM，纺纱下来，在500 5分钟×克于4 ℃。
通过将细胞重新悬浮在 100% 甲醇中来渗透细胞。对于软骨细胞，我们建议您在逐滴加入甲醇时轻轻涡旋细胞（在我们的 Vortex Genie 2 的最低设置上；这是设置 #1）；否则，细胞往往会沉淀成团块。让细胞在室温下通透 10 分钟，必要时轻轻涡旋以将它们保持在溶液中。
淬火用2ml透化反应的CSM和降速细胞在500 5分钟×克于4 ℃。
根据管中的细胞总数和抗体的滴定浓度，在细胞染色介质中制备细胞内抗体混合物。有关染色方案的更多详细信息，请参阅Leipold和Maecker ( 2015 )以及 Lin等人。（2015 年）。
在冰上染色细胞 30 分钟。
用 2 ml CSM洗涤 3 次，每次在 4 °C 下以 500 × g旋转 5 分钟。
重悬的细胞在1ml的CSM与小区ID嵌入剂。如果在 4°C 下储存，染色后的细胞可在染色后稳定长达1周。我们通常在运行cyTOF 前一晚染色，并将细胞置于 1 ×嵌入剂和 4% PFA 中，4°C 过夜。

数据采集
一上采集数据cyTOF根据机器的制造商对仪器。我们发现，对于软骨细胞，使用超级采样器比直接注射效果更好，因为细胞大而长，如果不持续搅拌，往往会沉淀在管道中。
根据您感兴趣的群体的估计丰度确定要获取的细胞数。
就在运行之前，用 1:10 稀释的 EQ 珠将细胞重新悬浮在d H 2 O 中。

数据分析

质量控制和数据清洗（图2中的代表性数据）：
归一化在运行时被使用利用正规化V0.3（欧盟珠执行https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases）与默认参数（图2B）。
使用带有默认参数的单细胞去条码器( https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder ) 对样品进行去条码。
如果在运行之间比较数据，则应使用两次运行中都存在的样本对通道值进行反正弦变换和归一化。我们使用分位数归一化（图 2C）。
通过对顺铂阴性、DNA (Ir195) 阳性细胞进行门控来选择活细胞。如果使用软骨细胞，我们建议将 SOX9 和 CD99 抗体添加到您的面板中，以便您可以在最终分析中选择 SOX9/CD44 高细胞（图 2D）。可以使用Cytobank (premium.cytobank.org)进行门控。
数据分析超出了本协议的范围。如需更深入的分析指南，请参阅以下评论：Kimball等人。( 2018 )或Nowicka等人。( 2017. )软件部分列出了一些推荐的软件包。

笔记

设计cyTOF面板对于规划此实验至关重要。在某些情况下，单细胞 RNA 测序数据集可用于确定用于识别您感兴趣的细胞的标记物。但是，我们发现相关性通常不是 1:1，尤其是在疾病背景下。作为一般规则，我们建议在分析分化的软骨细胞时加入 SOX9 和 CD44 进行质量控制，尽管一些罕见的干/祖细胞群可能对这些标记物呈阴性。
该协议不涉及结合您自己的抗体的细节。我们遵循制造商的建议，使用 100 μg或更多抗体作为我们的起始量。在没有甘油或BSA载剂没有出售的抗体，我们建议清洗它们，例如，通过使用热凝胶甜瓜IgG的纯化试剂盒（Thermo Scientific的，＃45206），按照与制造商的建议。当选择抗体，我们一般发现antibod IES是在FACS工作做好也是在正常工作cyTOF 。
抗体染色浓度应滴定，既为商购共轭和自结合的抗体，使用类似于意图用于主要实验的细胞混合物。我们使用以制造商推荐量为中心的三种稀释液，上调 10 倍和下调 10 倍。选择染色浓度，使您在通道上看到的“雪”量最小化；Ø therwise，这将是很难的cyTOF程序来调用单个细胞。
如果执行多次运行，我们建议在每批 20 个带条形码的样品之间重复一个或两个样品（普通样品），因为染色强度或机器采集灵敏度可能会出现细微差异。
确保在PBS不含重金属污染物，并在曾与肥皂或具有高溶液接触的瓶子不是由各级钡，因为这将导致一个高的背景信号。

食谱

完整的软骨细胞培养基
DMEM / F12
10% 胎牛血清
2mM L-谷氨酰胺
1 ×抗生素抗真菌剂
12.5 μ g /ml 抗坏血酸
通过 0.22 μ m过滤器进行过滤灭菌
储存在 4 °C。准备一个月内使用。
胶原酶溶液
在完全软骨细胞培养基中：
d issolve 2.5毫克/毫升胶原酶每II和IV的
重悬后通过 0.22 μ m过滤
储存在 4 °C。一个星期内prepar使用通货膨胀。为获得最佳效果，我们建议在使用当天新鲜制备，因为溶液中的胶原酶会随着时间的推移而失去活性。
细胞染色培养基 (CSM)
1 ×低钡 PBS（不含重金属污染物，使用MilliQ水制成）
2 mM EDTA
0.05%叠氮化钠
0.1% BSA
储存在 4 °C。稳定几个月。
低钡 PBS（1 ×磷酸盐缓冲盐水）
137 毫米氯化钠
2.7毫米氯化钾
10 mM Na 2 HPO 4
1.8 mM KH 2 PO 4
ddH 2 O
用于 pH 值的 NaOH
将所有成分混合在 3 L 的 ddH 2 O 中。
使用 NaOH 将溶液的 pH 值调至 7.4。
B使最终体积达到 4 L。
我们将低钡 PBS 保存在玻璃瓶中，这些玻璃瓶从未用于其他用途，也未用可能含有高浓度钡残留的洗涤剂清洗。
0.5 μ M顺铂在低钡 PBS 中
1 ×低钡 PBS
1 mM Cell-ID 顺铂
稀小区ID顺铂为0.5的终浓度μ中号。使用前在 RT 低钡 PBS 中制备。
细胞固定液
16% 煤灰
1 ×低钡PBS
每0.5 -百万细胞样品，制备1米升（900 μ l的低钡PBS和100 μ 16％PFA的升，对于最终1.6％浓度）。始终为珍贵样品打开一个新安瓿，因为 PFA 会随时间迅速降解。体积可以根据样本大小放大或缩小。
带有 Cell-ID嵌入器的CSM
CSM
Cell-ID Intercalator-Ir （Fluidigm ，目录号：201192A）
每个样品，使1米升CSM的与小区ID嵌入-IR稀释1：1 ，000
（如果将染色的细胞储存过夜，则可选）带有 Cell-ID嵌入剂和 4% PFA 的CSM
CSM
16% 煤灰
Cell-ID嵌入剂-Ir
每个样品，用 Cell-ID嵌入剂-Ir以 1:1稀释，000 和 PFA 稀释到 4%制备 1 ml CSM 。

致谢

NB 由 NIH/NIAMS 拨款 R01 AR070865 和 R01 AR070864 支持。FCG 得到 NSF GRFP 奖的支持。这项工作还得到了 K. Thiery和 D. O'Leary给骨科外科的一份礼物的支持。这项工作报告cyTOF染色方案在我们的上一个使用人软骨细胞我的OU纸（格兰迪等，2020）。格兰迪等人的一些数据。(2020) 已在本报告中进行了改编，以展示数据清理和质量控制。

利益争夺

作者没有要披露的竞争利益。

伦理

根据斯坦福大学批准的 IRB 协议，从接受全关节置换的放射影像 OA 患者的废弃组织中获取 OA 样本。

参考

Bendall, SC, Simonds, EF, Qiu , P., Amir el, AD, Krutzik , PO, Finck , R., Bruggner , RV, Melamed, R., Trejo, A., Ornatsky , OI, Balderas, RS, Plevritis , SK, Sachs, K., Pe'er , D., Tanner, SD 和 Nolan, GP (2011)。人类造血连续体中差异免疫和药物反应的单细胞质量细胞计数。科学332(6030)：687-696。
Bruggner , R. V., Bodenmiller , B., Dill , D. L., Tibshirani , R. J.和Nolan , G. P. (2014)。自动识别细胞亚群中的分层特征。Proc Natl Acad Sci USA 111(26) E2770-E2777。
Grandi , FC, Baskar, R., Smeriglio , P., Murkherjee , S., Indelli , PF, Amanatullah , DF, Goodman, S., Chu, C., Bendall, S. 和Bhutani , N. (2020)。单细胞质量流式细胞术揭示了骨关节炎软骨中炎症抑制细胞和炎症放大细胞之间的串扰。Sci Adv 6（11）：eaay5352。
Kimball , A. K., Oko , L. M., Bullock , B. L., Nemenoff , R. A., van Dyk , L. F. and Clambey , E. T. (2018) 分析初学者指南和可视化质谱数据。J Immunol 200(1): 3-22。
Leipold , MD 和Maecker , HT (2015)。使用CyTOF TM Mass Cytometry 对活人PBMC 进行表型分析。Bio - protoc ol 5(2) ：e1382。
Lin, D.、Gupta, S. 和Maecker , HT (2015)。使用CyTOF TM质谱流式细胞仪对 PBMC 进行细胞内细胞因子染色。生物方案5(1) ：e1370。
利瓦克，K 。J.和施密特根，T 。D.（2001 年）。使用实时定量 PCR 和 2 -ΔΔCT方法分析相关基因表达数据。方法24(4)：402-8。
Nowicka , M., Krieg , C., Crowell , H. L., Weber , L. M., Hartmann , F. J., Guglietta , S., Becher , B., Levesque , M. P.和Robinsion ,医学博士（2017）。CyTOF 工作流程：高通量高维细胞计数数据集中的差异发现。F1000Res。6：748。
罗格斯大学，M.，范佩尔特，M . Ĵ 。P.，德特，W 。Ĵ 。A.，克里默斯，L 。B.和赛尔斯，D 。乙。˚F 。(2010)。评估组织工程、修复和骨关节炎软骨的组织学评分系统。骨关节炎软骨18（1）：12-23。
范合战，S.，乐嘉利宝，B.，面包车赫尔登，M. J.，Lambercht ，B. N.，Demeester ，P 。, Dhaene , T.和Saeys , Y. (2015) 。FlowSOM：使用自组织图进行细胞计数数据的可视化和解释。细胞计数法 A 87(7)：636-45。