材料和试剂

1.烧瓶，25 cm 2 （Falcon ，目录号：353108）
2. 6 孔板（Falcon ，目录号：353046）
3. 12孔板（Falcon ，目录号：353103）
4. 24 孔板（Falcon ，目录号：353047）
5. 96 孔板（Falcon ，目录号：353916）
6. 13 -毫米直径盖玻片（VWR，目录号：631-0149P）
7. 18 -毫米直径盖玻片（VWR，目录号：631-0153P）
8. 24 -毫米直径盖玻片（VWR，目录号：631-0161）
9. PBS （Sigma-Aldrich，目录号：D8537，储存 RT ）
10.胰蛋白酶-EDTA （GIBCO，目录号：25200-056，储存4°C ）
11. NaCl （Sigma-Aldrich，目录号：S9888，储存 RT ）
12. Trizma ® 碱（Sigma-Aldrich，目录号：T6066，储存 RT ）
13. EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E5134，储存 RT ）
14. Triton X-100（Sigma，目录号：9002-93-1，存储RT ）
15.甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516，储存RT ）
16. Pierce TM BCA 蛋白质测定（Thermo Scientific™，目录号：23225，储存 RT ）
17. MgCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：63068，储存 RT ）
18. ATP（Sigma- Aldrich ，目录号：A2383，储存-20°C）
19.葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270，储存RT ）
20.葡萄糖6-磷酸脱氢酶（Sigma- Aldrich ，目录号：SRP6505，储存-20°C ）
21. NADP（Sigma-Aldrich，目录号：93205，储存 -20°C ）
22. SPLICS s （基于split-GFP的接触位点传感器短）和SPLICS L （基于split-GFP的接触位点传感器长）质粒（Cieri等人，2018，可从a uthors获得）（存储-20°C )
23. OptiMEM （GIBCO，目录号：51985026，储存 4°C ）
24. TransIT-LT1（Mirus ，目录号：MIR 2304，储存 4°C ）
25. KCl （Sigma-Aldrich，目录号：P3911，储存 RT ）
26. KH 2 PO 4 （默克，目录号：1551139，储存 RT ）
27. CaCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：21097，储存 RT ）
28. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375，储存 RT ）
29. HK2pep：（化学合成，seq. MIASHLLAYFFTELN- bA -RRRRRRRRR-PLGLAG- Ahx -EEEEEEEE，储存 -20°C）
30. SCRpep :（化学合成，seq. VGAHAGEYGAEALER- bA -RRRRRRRRR-PLGLAG- Ahx -EEEEEEEE，储存 -20°C）
31. cl-HK2pep（化学合成，序列 MIASHLLAYFFTELN-βA-RRRRRRRRR-PLG ，储存 -20°C ）
32. CL- SCRpep （化学合成，SEQ。VGAHAGEYGAEALER-βA-RRRRRRRRR-PLG存储-20℃ ）。所有肽通过自动固合成-相程序（详情，参见Ciscato等人，2020 ）。建议纯度 ≥ 95% 通过分析型反d相 HPLC测量。肽不是市售的，但可以由专业公司按需合成。
33. PFA（Sigma- Aldrich ，目录号：P6148，储存4°C）
34. NH 4 Cl（Sigma- Aldrich ，目录号：A9434，储存 RT ）
35. BSA（Sigma- Aldrich，目录号：AG4503，储存 4°C ）
36.山羊血清（Sigma-Aldrich，目录号：G6767，储存-20°C ）
37.明胶（Sigma- Aldrich ，目录号：G2500，储存-20°C）
38.兔单克隆抗HK2抗体（Thermo Scientific，目录号：H.738.7 ，储存-20°C ）
39. AlexaFluor555驴抗兔IgG（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-31572 ，储存-20°C ）
40. Mowiol 4-88（Sigma- Aldrich，目录号：81381，储存 RT ）
41.编码线粒体靶向 GCAMP6f 的质粒（Filadi et al. , 2018 ，可从a uthors 获得，-20°C 储存）
42.环孢菌素H（Vinci- Biochem ，目录号：AG-CN2-0447-M005，储存-20°C）
43.四甲基-罗丹明甲酯（TMRM）（Invitrogen，MitoProbe ™，目录号：M20036，储存 -20°C ）
44.膜联蛋白V-FITC-膜联蛋白-V-FLUOS标记试剂（罗氏-现由MERCK出售，目录号：11828681001，储存-20°C ）
45. 7-一个minoactinomycin d（7-AAD; Sigma-Aldrich公司，目录号：A9400，存储-20℃）

设备

细胞培养孵化器（热科学FORMA™免缝-CYCLE™CO 2孵化器）
配备细胞培养罩（Angelantoni Industries，目录号：VBH 48 C2）
微量移液器（吉尔森的Pipetman经典，P1 ，000，P200，P20，P10，P2）
Burker室（VWR，目录号：HECH40443703）
从200至2的离心机，000 ×克，固定桶，没有特定的转子需要（例如，MPW中号埃德仪器。目录号：MPW 251 ）
热振荡器（Biosan ，目录号：TS-100）
从 200 到 16 的离心机，000 × g，固定桶，不需要特定转子（例如，Eppendorf，目录号：5417 R ）
读板机分光光度计（TECAN，型号：Infinite M200 分光光度计）
共焦显微镜（Leica SP5-II配备有100 × /1.4 NA计划复消色差透镜物镜，WLL激光激发每个特定染料，和一个路政署检测器，用于信号采集）
倒置荧光显微镜（Zeiss Axiovert 100，Fluar 40 ×油镜，NA 1.30）
倒置荧光显微镜（徕卡，型号：DMI6000 B）
细胞荧光计（BD FACSCanto TM II）

软件

i -control™（用于TECAN、Infinite M200 分光光度计，https: //lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro? p =tab--3）
Excel 数据分析软件（Microsoft Office）
Leica Application Suite LAS-AF（用于Leica SP5-II https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp5-ii）
ImageJ（NIH，https: //imagej.nih.gov/ij/download.html ）
对于在Zeiss显微镜，清凉的相机与激发源的同步是通过一个特制的软件包进行（Roboscope -由开发克特林达恰安Ciubotaru在VIMM，帕多瓦，意大利）; 或者，特定制造商的显微镜软件适用于动态图像采集
徕卡应用套件LAS-AF为所述徕卡荧光显微镜（https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/）
BD FACSDIVA TM用于在BD的FACSCanto TM II cytoflurimeter （https://www.bdbiosciences.com/en-us/instruments/research-instruments/research-software/flow-cytometry-acquisition/facsdiva-software）

程序

细胞中的HK2活性
注意：Ť ö进行这些测量，我们用小鼠4T1乳癌细胞，小鼠CT26结肠直肠肿瘤细胞，和人HeLa宫颈癌细胞（Ciscato等人，2020）。可以在贴壁和悬浮细胞系以及原代细胞上执行此协议。

细胞培养和样品收集
在收获/处理前至少 24 小时，将1-4 × 10 6细胞（取决于细胞类型；例如，2 × 10 6 HeLa 细胞、2 × 10 6 4T1 和 CT26 细胞）置于 25 cm 2烧瓶中。
收获的细胞用洗涤的用PBS烧瓶中，用胰蛋白酶-EDTA分离它们，含有10个％FBS和阻断用新鲜培养基（对于4T1细胞的DMEM用于HeLa和CT26细胞，RPMI）中的反应。
沉淀的细胞（调整的根据你的细胞系离心力和时间来安全地沉淀它们;例如，5分钟× 400 ×克对于海拉，4T1 ，并且CT26细胞）。
拆下的上层清液。
在 100-200 µl裂解缓冲液中裂解细胞。
孔定量泰特的蛋白质含量（皮尔斯TM BCA蛋白质测定试剂盒）。
计算对应于20体积微克蛋白质，这足以（蛋白质的该量可以根据所分析的细胞系被修饰），以检测己糖激酶活性。
样品制备
为每个实验条件准备 2 个含有 20 μg蛋白质的小瓶。
将一个小瓶在 4°C 下孵育，另一个在 46°C 下孵育 30 分钟。加热在46℃下30分钟是足以除去HK2，唯一的热敏己糖激酶的催化活性，同时保留其它同工酶的活性; HK2 不会被这种处理降解。
孵育后，储存在冰样本。
用 cl-HK2pep（和/或您感兴趣的化合物）处理样品并测量 HKs/HK2 活性
在室温下制备新鲜的反应缓冲液。
最终反应体积为 100 μl 。准备缓冲器适量发现在96 -孔板中并加入10 μM CL-HK2pep（和/或你感兴趣的化合物-使用CL- SCRpep作为一个对照肽）。
使用板式搅拌器混合 5 秒（通常，我们使用板式读取器摇动，但任何板式搅拌器都适用）。
加入 20 - 100 μg细胞提取物（加热或不加热）并混合 10秒。
读的96 -在动力学模式孔板（具有最小30小号使用分光光度平板读数器（无限M200分光光度计在340nm间隔），在37 TECAN）15分钟℃。
数据分析
HK活性计算在纳摩尔/分钟/ mg：纳摩尔每分钟瓦特为通过计算的斜率（m）中获得的记录的第一分钟期间，在340nm处标绘吸光度和由NADH（ε的消光系数除以= 6.22 ）和比色皿的路径长度（L = 0 。4厘米为96 -孔平板）。然后，将值标准化为添加到反应中的总蛋白质毫克数（0.08 毫克 4T1 总裂解物）。
为了计算HK2活性，减去所获得的活动中的样品预温育在46℃下从该中在4℃下（图2）一起温育的样品。
应用适当的统计分析（例如，学生的牛逼-检验比较两组或Ø NE -w AY一个NOVA到两组以上的比较）。

图2 。中号odified从Ciscato等。，2020 HK1 + HK2，HK1 ，如以上CL-HK2pep治疗在4T1细胞提取物后和HK2酶活性来计算。CL- SCRpep被用作阴性对照。

HK2 与 MAMS 的共定位及其由 cl-HK2pep 的置换
细胞接种和培养
板0.5-1 × 10 5细胞在含有13 24孔板-毫米（直径）和盖玻片培养物（37℃，5％CO 2至少24小时，湿润气氛）。细胞可以生长 48 小时，但在转染（下一步）时必须达到 60-70% 的汇合度。
用 SPLICS 编码质粒转染细胞
转染细胞用编码SPLICS的两个亚基的质粒小号（评价ER-线粒体触点<10纳米）或所述SPLICS大号探针（联系人<40-50纳米）（Cieri等人，2018）。将 0.5 µg 每个质粒/孔与 2 µl TransIT-LT1 (MIR 2304 - Mirus )混合在 100 µl OptiMEM 中并孵育 15 分钟。
添加转染混合物滴逐到细胞中（在离开0.5毫升培养基），并培育为5小时。
去除含有转染混合物的培养基并用 0.5 ml 新鲜培养基代替。
将细胞留在培养箱中过夜。
使用 cl-HK2pep（和/或您感兴趣的化合物）进行细胞处理
制备含有溶液mKRB缓冲液和2 μM CL-HK2pep（和/或你感兴趣的化合物;使用CL- SCRpep作为一个对照肽）。氏小号的量以Cl - HK2pep是能够从在不到2分钟MAMS HK2的分离部分，所以请考虑预incubat荷兰国际集团使用CL-HK2pep如果他们需要更长的时间是有效的在完整细胞中之前的其它化合物。
用500替代细胞培养基微升含有1-2个溶液μM CL-HK2pep（和/或你感兴趣的化合物;使用CL- SCRpep作为一个对照肽）。考虑我们荷兰国际集团根据实验条件的不同媒体; cl-HK2pep 在多种生理溶液中均有效。
在室温下孵育 2分钟。的2 μM CL-HK2pep治疗可导致在线粒体去极化几分钟，凋亡性细胞死亡中15分钟（Ciscato等人，2020）。Ç onsider不超过荷兰国际集团5 -分钟处理; 否则，降低的CL-HK2pep浓度。根据该细胞类型，不同的媒体可以加速或延缓CL-HK2pep的活性。
取出介质，并添加500微升PBS使用移液管以洗涤该细胞。
除去PBS，加入500微升4％PFA（在PBS中制备）中10分钟，以固定的细胞的免疫荧光协议。
除去的PFA溶液和洗涤的细胞3 × 5分钟，用0.5毫升PBS中轻轻搅拌（100-120转定轨振荡器上）。
加入 0.5 毫升淬灭溶液 20分钟。
除去的骤冷溶液和洗涤的细胞3 × 5分钟，用0.5毫升PBS中轻轻搅拌（100-120转定轨振荡器上）。然后进行免疫荧光（下面的步骤B 4）。如果无法立即进行步骤B 4 ，则细胞可以在 PBS 中于 4°C下储存1 周。
HK2 免疫荧光实验方案和图像采集
除去的PBS中，并透化的与细胞0.5毫升的Triton X-100为3分钟。
除去所述的Triton X-100和洗涤的用0.5ml PBS的细胞。必须使用移液器添加和移除溶液。
用 0.5 ml 封闭液孵育细胞至少 30分钟。添加该解决方案使用吸管。避光。
稀释的第一抗体（兔单克隆抗HK2抗体，H.738.7，热在封闭溶液中孵育细胞，在室温下，保护90分钟150：Scientific）的1版从光。
除去抗体溶液和洗涤的细胞3 × 5分钟，用封闭溶液中轻轻搅动（100-120转定轨振荡器上）。
稀的第二抗体（AlexaFluor555驴抗-兔IgG，A-31572热Fisher Scientific公司）1：300在封闭溶液和离心机以13,000 ×克10分钟。
在室温下用该溶液孵育细胞 45 分钟。避光。
除去抗体溶液和洗涤的细胞3 × 5分钟，用封闭溶液中轻轻搅动（100-120转定轨振荡器上）。在温和搅拌期间用 PBS进行额外的洗涤（在轨道振荡器上以 100-120 rpm 的速度运行）。
用 H 2 O清洗盖玻片，并立即在物镜上安装Mowiol （或不同的安装解决方案）。允许在室温下避光干燥过夜，然后储存在 4°C 直到图像采集。
收集图像使用共焦显微镜（Leica SP5-II配备有100 × /1.4 NA计划复消色差透镜物镜，WLL激光激发每个特定染料，和一个路政署检测器，用于信号集合）。激光器的功率应在与解释第1条的样品被设置第一信号强度，以避免信号的饱和，并保持相同的所有样品/实验条件。以 TIFF 格式导出图像。
数据分析
绿色（SPLICS探针）和红色（HK2染色）信道的开放TIFF图像š我Ñ的ImageJ（版本1.47b或更高，NIH）。
减去的背景。跟踪背景区域中的感兴趣区域（ROI）；在Plugins 中，选择ROI，从 ROI 中减去 BG ，然后按 OK。对两个通道重复此操作。
计算的Pearson的共定位系数插件，共同locali ž通货膨胀的分析，曼德斯系数，选择红色和绿色通道的适当组合，选择排除零-零像素，然后按OK。的曼德的和Pearson的共同locali Ž通货膨胀系数将通过下式计算的软件（图3）。
重复所有图像并应用适当的统计人的测试。W¯¯ Ë建议analyz ING至少10个不同的细胞每个盖玻片并重复荷兰国际集团的实验至少三次ö Ñ不同的三天。

图3 。Pearson的共-定位系数计算，从改性Ciscato等。（2020 年）。（A）步骤-通过-步骤代表性共聚焦图像分析我ÑHeLa细胞进行使用ImageJ的（版本1.47b或更高，NIH）。（B）从共焦图像分析的代表性结果：从HeLa细胞MAMS HK2位移与CL-HK2pep处理后由示出的丢失的MERG ED HK2（红色）之间的信号和所述对ER-线粒体触点基于分裂-GFP-探针（ SPLICS L , 绿色); 合并的信号是白色的。CL- SCRpep被用作阴性对照，和Pearson的共定位系数被指示（CL- SCRpep N = 26个细胞; CL-HK2pep N = 24个细胞; P <0.001与学生吨-检验）。比例尺：10 μ m。

cl-HK2pep 对 MAMS 中 HK2 置换的功能评估
细胞接种和培养
注意：Ç onsider调整荷兰国际集团取决于所分析的特定细胞类型中接种的细胞的数目。必须对贴壁细胞进行以下分析。

对于实时线粒体基质的Ca 2+成像，板1 × 10 5细胞在含有18 12孔板-毫米直径的盖玻片转染前至少24小时。
对于实时TMRM（四甲基罗丹明甲酯）成像，板2.5 × 10 5细胞在含24 6孔板-毫米直径的盖玻片至少24 ħ之前的实验。
对于细胞死亡评估，在实验前一天，为每种条件在 25 mm 2烧瓶中加入1.5 × 10 6 个细胞。
活线粒体基质 Ca 2+ 成像和数据分析
用编码线粒体靶向 GCAMP6f 的质粒转染细胞（转染协议见 B.2 点；每个盖玻片使用 0.75 µg DNA 和 1.5 µl TransIT-LT1 试剂）。
转染24 小时后，用mKRB缓冲液替换培养基，辅以 1 μM环孢菌素H ，并将盖玻片放在适当的支架上进行实时显微镜成像。孵育为10-20分钟用500微升mKRB在室温下。特定的药物可以被添加，并温育30-60分钟之前的实验。
依次在475nm处（钙EXCITE GCAMP6f 2+敏感的波长）和410纳米（在等吸光在倒置荧光显微镜点）（蔡司的Axiovert 100，Fluar 40 ×油浸物镜，NA 1.30 ），产生的激发光从一个单色（polychrome V；TILL Photonics）并用 505 nm DRLP 过滤器（Chroma Technologies）过滤。收集的在500-530纳米范围内发射的荧光（使用带通滤波器，色度技术）和r EPEAT这个循环每5秒（图4A）。成像可以进行为至多90分钟。
在开始记录后 2-4 分钟添加 2 μM cl-HK2pep（和/或您感兴趣的化合物）。对于加入的化合物的均匀分布，收集100微升在保持器上的解决方案，溶解CL-HK2pep（和/或你感兴趣的化合物），并小心地添加已经-通过混合盖玻片上的顶部制成溶液使用移液管。ø n中的单个实验日，我们建议analyz ING对于每种条件至少3周不同的盖玻片，用4 - 10个细胞在所获取的字段。重复实验至少三次Ø ñ三个不同天。
以 TIFF 格式导出图像并在ImageJ 软件中打开。
减去所述（见点B5.b上文）背景，痕量的适当的ROI包括每个单细胞的线粒体网络，并测量在475nm处和410nm处激发后每帧发射的荧光强度。
计算之间的比率（R）的生成通过激发排放的细胞在475和410纳米。R与[Ca 2+ ]成正比。的变化在条件的R，其中的[Ca 2+ ]在线粒体基质中是相对低的（<100 nM的，静止条件下）和那些其中探针是饱和的（高的[Ca 2+ ]，>10μM）应大约 15-20 倍（图 4B）。

图4. 由Ciscato等人修改。，2020年（A）线粒体基质的Ca动力学分析的代表性图像2+变化（与评估一个在HeLa细胞中的cl-HK2pep处理后线粒体靶向GCAMP6f探针）。（B）孔定量吨线粒体靶向GCAMP6f信号作为的通货膨胀的的平均值±SEM的410分之475纳米比（左图）或所述具有增加的Ca细胞的百分比2+中的线粒体（右图-阈410分之475比对于阳性 > 3；基线平均比率 = 1.84 ± 0.54）。CL- SCRpep被用作阴性对照。

实时线粒体膜电位评估和数据分析
制备含有溶液mKRB （或溶液适应编到所述细胞/实验条件）加20 nM的TMRM 1 μM环孢菌素H（抑制探针挤出通过多药耐药泵）。
在另一个 6 孔板中用 PBS 清洗盖玻片。
（根据你的显微镜设置）并孵育放置盖玻片在活显微镜成像的适当支架为20-40分钟用500 μl的在室温下的含TMRM的溶液。孵育时间取决于细胞类型。TMRM 在线粒体基质中积累并需要时间来平衡；在实验开始时，TMRM积累必须是在稳定状态下（图小号5和6）。
孵育后，使用倒置荧光显微镜（Leica DMI6000 B ）每 30 秒 - 3 分钟（取决于细胞类型）以动力学模式记录 TMRM 荧光。在某些细胞类型中，TMRM 荧光可能具有光毒性，从而导致线粒体膜去极化。因此，在开始之前的实验中，监视动态模式TMRM的荧光1个小时：如果TMRM发射信号减小，增加之间的延迟时间采集和/或降低激发强度; 实验必须仅在细胞在整个记录小时内显示稳定信号的条件下进行。
添加2 μM CL-HK2pep（和/或你感兴趣的化合物;使用CL- SCRpep作为一个对照肽）2-4分钟开始记录之后。为了均匀分布添加的化合物，在支架上收集 100 μl溶液，溶解 cl-HK2pep（和/或您感兴趣的化合物），然后小心地将混合物添加到盖玻片上。ø n中的单个实验日，我们建议analyz ING对于每种条件至少3周不同的盖玻片，用5 -在所获取的场30层的细胞。重复实验至少三次Ø ñ三个不同天。
用于图像分析：ö笔TIFF图像我Ñ的ImageJ（1.47b，NIH）。
减去所述（见点B5.b上文）背景，痕量的适当的ROI包括每个单细胞的线粒体网络，并测量在动力学模式（图5）所发出的荧光强度。
重复所有动力学并应用适当的统计测试。

图5. 由Ciscato等人修改。, 2020. cl-HK2pep 处理对 HeLa 细胞中用 TMRM 探针评估的线粒体膜电位的影响。

图6代表设置了一个盖玻片室LIV ë细胞成像。

细胞死亡评估和数据分析
收获细胞通过洗涤烧瓶一个在用PBS时间，分离用胰蛋白酶-EDTA细胞，和阻断用含有10个％FBS5毫升新鲜培养基的反应。收集的脱落的细胞。
使用Burker室计数细胞。
为每个实验条件收集 1.5 × 10 6 个细胞并将它们沉淀。
制备mKRB缓冲含1：100的膜联蛋白-V-FLUOS标记由Roche试剂预先制作（或者，也可以使用其它的膜联蛋白V-FITC探针以下的制造商的在梁支S）和1微克/毫升7-一个美浓一个克拉霉素 D (7-AAD)。
注意：如果需要某些特定细胞类型的存活，可以用其他培养基替代mRKB缓冲液（例如，我们使用不含酚红的 DMEM，并为新鲜分离的 B 细胞添加10 mM HEPES 和 0.1% FBS （pH 7.4）或新鲜分离的 B-CLL 癌细胞）。

重悬1.5 × 10 6细胞小号在900微升mKRB缓冲液+膜联蛋白V-FITC和7-AAD和等份样品中，以三种不同的荧光光度计-适用管（300微升含5样品× 10 5个细胞每管）。这三个管是技术复制品。
牛逼Ø记录染色下在所有管基础条件，分析了绿色和远红外荧光使用的荧光光度计设置。
取决于细胞类型，加入1 - 5 μM CL-HK2pep（和/或你感兴趣的化合物;使用CL- SCRpep作为一个对照肽），轻轻混匀每次加入后的样品。CL-HK2pep是没有效率在杀死的非癌性细胞系C2C12或RAW.241 ，如上述（Ciscato等人，2020）。然而，由于5 μM CL-HK2pep可以杀死75 - （在不到15分钟的癌细胞的96％Ciscato 。等人，2020），请考虑预incubat荷兰国际集团CL-HK2pep之前的其它化合物，如果他们需要更长的时间是有效的在完整的细胞中。
孵育为室温下15分钟，并重新分析以相同的顺序的所有管道。
重复的荧光光度计记录每15 - 30分钟内的动力学分析。
数据分析：é计价活细胞的百分比（双-阴性膜联蛋白V-FITC和7-AAD染色）在每个时间点和平均的技术复制。应用适当的统计检验。

数据分析

数据分析的方法针对每种技术方法进行了具体描述。

食谱

裂解缓冲液
150 mM NaCl 20 mM Tris 5 mM EDTA 1% Triton X-100 10% 甘油

反应缓冲液
50 mM Tris 10 mM MgCl 2 4 mM ATP 2 mM葡萄糖0.1 U/ml 葡萄糖 6-磷酸脱氢酶 (G6PDH) 1mM NADP，pH 7.4

mKRB缓冲液
135 mM NaCl 5 mM KCl 0.4 mM KH 2 PO 4 1 mM MgCl 2 1 mM CaCl 2 20 mM HEPES 10 mM葡萄糖，室温下 pH 7.4

PBS 中的
0.24% NH 4 Cl淬火溶液
透化溶液
0.1% Triton X-100 在 PBS 中
封闭液
2% BSA
10% 山羊血清
0.2%明胶的 PBS溶液

致谢

这个工作是由资金支持的大学帕多瓦，神经纤维瘤的治疗加速计划，ASSOCIAZIONE意大利Ricerca巨蟹座（AIRC补助IG20749分之2017到AR），钢琴生命ONLUS和莲花ODV 。协议源自Ciscato等人，2020 年。

利益争夺

甲专利申请（意大利专利IT102019000002321，优先权：18/02/2019; PCT：PCT / IB2020 / 051329 ）ħ作为被提交由所述大学的緌帕多瓦为使用在第描述的HK2靶向肽的是手稿作为体外和体内实验中的抗肿瘤工具。

参考

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