材料和试剂

实验室一次性用品：
吸管小号（É 。克。，热电飞世尔科技，产品目录号：FN-4641010N，FN-4641060N，FN-4641080，FN-4641100）
15 毫升管（例如，Greiner ，目录号：188261）
50 毫升管（例如，Greiner ，目录号：227261）
1.5 毫升管（例如，Watson ，目录号：9833）
PCR 管（例如，Greiner ，目录号：673210）
96 -孔板小号（康宁，目录号：3596）中
24 -孔板小号（康宁，目录号：3526）
6 -孔板小号（康宁，目录号：3516）
10厘米的培养皿ES （康宁，目录号：430167）
大肠杆菌（Dh5α）感受态细胞（Takara ，目录号：9057）
pX330 质粒（Addgene ，目录号：42230）
支付质粒小号
pAIDFA-EF1a-NmScarlet-mAID （Addgene ，目录号：140615 ）
pAIDFA -CMV- NmScarlet - mAID （Addgene ，目录号：140616 ）
pX330质粒小号FO的ř线性化的有偿质粒小号
pX330 中的 pAID -CMV线性化（Addgene ，目录号：140609）
pX330 中的 pAID-EF1a线性化（Addgene ，目录号：140610）
Eco RV （NEB ，目录号：R0195S）
PrimeStar GXL PCR聚合酶（Takara ，目录号：R050A）
吉布森甲ssembly Ç loning试剂盒（NEB ，目录号：E5510S）
InFusion HD C loning Plus（Takara ，目录号：Z8909N）
1× Tris-乙酸-EDTA (TAE) 缓冲液（0.04 M Tris-乙酸和 0.001 M EDTA）用于电泳
用于电泳的琼脂糖（SeaKem LE Agarose：50001）
Ë thidium b用于染色DNA的凝胶romide溶液（ナ，目录号：14631-51）
Gotaq Master Mix（Promega ，目录号：M7122）
宽范围 DNA 阶梯（Takara ，目录号：3415A）
用于质粒构建的Wizard SV 凝胶和 PCR 净化系统（Promega ，目录号：A9281）
NucleoBond Xtra Maxi 试剂盒（Macherey- Nagel ，目录号：740414.100）
Neon 转染系统 100 µl 试剂盒（Thermo Fisher Scientific ，目录号：MPK10096）
聚乙烯亚胺MW 25000，吨ransfection克RADE（Polysciences公司，目录号：23866-1）
DMEM（Nacalai ，目录号：09891-25）
PBS（Nacalai ，目录号：14249-95）
FBS（Gibco ，目录号：10270-106）
Ç hicken血清（Gibco公司，目录号：16110-082）
Ť rypsin溶液（Nacarai ，目录号：32777-15）
青霉素小号treptomycin（ナ，目录号：09357-34）
敲除小号erum ř eplacement（热飞世尔科技，产品目录号：10828010）
MEM n on-essential a mino a cid s （Nacalai ，目录号：06344-56）
L-谷氨酸（Nacalai ，目录号：16948-04）
2-巯基乙醇（Sigma ，目录号：M6250）
1 × PBS（Nacalai ，目录号：14249-95）
ģ elatin（Sigma公司，目录号：G1890-100G）
杀稻瘟素小号ħ ydrochloride（和光，目录号：029-18701）
L-谷氨酸（Wako ，目录号：072-00501）
5-一个damantyl-IAA（TCI ，目录号：A3390）
d imethyl亚砜（DMSO）（和光，目录号：043-07216）
1 M NaOH溶液（Wako ，目录号：193-02175）
过滤器（默克，目录号：S2HVU11RE）
LB培养基（Nacalai ，目录号：20068-75）
卡那霉素（Nacalai ，目录号：19860-31）
氨苄西林升中（ナ，目录号：02739-74）
鸡DT40细胞的培养基（见配方小号）
哺乳动物细胞培养基（见配方）
小鼠胚胎干细胞培养基（见配方）
0.1% 明胶溶液（见配方）
1 mg/ml聚乙烯亚胺溶液（见配方）
5-Ad-IAA 解决方案（见食谱）
20 mM谷氨酸溶液（pH 4.0）（见配方）

设备

热Ç ycler（例如，赛飞世尔科技：MINIAMP ）
Mupid 2plus ( Mupid : AD110)
CO 2培养箱（在 5% CO 2和 37° C用于哺乳动物细胞，38.5 °C用于鸡 DT40 细胞）（例如，PHCBi : MCO-170AIC）
Countess II（赛默飞世尔科技：C10228）
Neon 转染系统（赛默飞世尔科技：MPK5000）

程序

DNA preparetion
pAID质粒构建
注意：p AID质粒包含 OsTIR1 F74A和mScarlet-mAID表达盒，受 CMV（Addgen e # 14061 5 ）或 EF-1α 启动子（Addgene # 14061 6 ）（图ure 1A）（Nishimura等人， 2020）。的CMV启动子是用于在鸡DT40细胞系，而所述EF1A启动子是哺乳动物细胞系小号。可以使用InFusion (Takara) 或 Gibson 组装 (NEB) 克隆系统将目标蛋白的cDNA 插入到mScarlet-mAID盒末端的EcoRV位点中（图 2B）。

图2. Ç的。施工支付质粒。一个。的地图的支付质粒。pAID质粒包含受CMV 或 EF-1α 启动子控制的 OsTIR1 F74A和mScarlet-mAID表达盒。乙。Ç的。施工的支付使用In-Fusion技术克隆质粒。纯化的PCR片段克隆到所述生态RV的网站的支付由IN-FUSION克隆质粒。

用Eco RV消化pAID质粒。
10 × NEB 缓冲液 2 3 µl
pAID质粒 3 µg
生态房车 1 µl
DW 高达 30 µl
在37 °C 下孵育2 小时
使用以下引物对通过 PCR 扩增目标蛋白 cDNA：
pAID-Ncloning1 : 5ʹ-CTGGAGCGGGTGCCGAT[目标cDNA的5ʹ末端]-3ʹ
pAID-Ncloning2 : 5ʹ-GTTAACAACAACAATTGGAT[3ʹ目标cDNA的末端]-3ʹ
5 × PrimeStar GXL 缓冲液 10 µl
dNTP混合物（每种2.5 mM ）4 µl
pAID-Ncloning 1 10 pmol
pAID-Ncloning 2 10 pmol
模板 (cDNA) 25 - 750 ng（质粒 DNA：10 0 pg - 10 ng）
PrimeStar GXL 聚合酶 1 µl
DW 高达 50 µl

PCR 步骤（30 个循环）
98 °C 10 秒
60 °C 16 秒
68 °C 1 分钟/kb

纯化线性化的有偿质粒和PCR产物使用向导SV PCR和所述凝胶P urification清理后系统1％琼脂糖凝胶electrophor ESIS 。注意：消化支付质粒和PCR片段可以通过后比较DNA梯标记物的荧光信号来估计Ë thidium b romide染色。
使用 Gibson 组装 (NEB) 或融合 (Takara) 克隆系统组装 PCR 片段和线性化的pAID质粒。请参阅的用户手册的详细IN-FUSION HD克隆试剂盒小号。
纯化的 PCR 片段10 - 200 ng
线性化pAID载体 50 - 200 ng
5 × In-Fusion HD 酶混合物 2 µl
DW 高达 10 µl
孵育反应混合物TURE在50 ℃下15分钟。
用组装的 DNA转化大肠杆菌(DH5 α ) 感受态细胞。请参阅用户手册的详细信息，IN-FUSION HD克隆试剂盒。
执行菌落PCR来收集转化的E.大肠杆菌菌落。
注意：我们用菌落PCR来收集E.由大肠杆菌菌落GoTaq （Promegega ）分离之前的相应的质粒。我们通常使用检查每个样品的菌落8的以下引物组：
pAID-Ncheck1 ：5ʹ-CAGGCGGTGGAAGCGGGTGCCG-3ʹ-CAGGCGGTGGAAGCGGGTGCCG-3
pAID-Ncheck2 ：5ʹ-ACAAGTTAACAACAACAATTGG-3ʹ
收集两个大肠杆菌菌落并分离相应的质粒。
通过桑格测序确认克隆质粒的序列。
对于转染步骤，需要转染级纯质粒 DNA。我们通常使用NucleoBond Xtra Maxi kit进行质粒分离，以获得转染级质粒；瓦特Ë typic烯丙基获得若干毫克/毫升p lasmid溶液。如果质粒 DNA的浓度低于 1 mg/ml，则应通过乙醇沉淀来浓缩 DNA 。

pX330 构建和设计用于目标序列的sgRNA
注意：我们通常在内含子-外显子边界处设计sgRNA ，以避免消化pAID质粒中的 cDNA （图 3）。pX330 质粒的构建如先前发表的研究（Pyzocha 等，2014）中所述。请参阅步骤A9关于p lasmid准备。

图 3.目标基因的sgRNA设计。用于基因靶向的SgRNA设计在内含子-外显子边界处。这里有三个例子来设计一个在为CRISPR / Cas9目标站点的鸡，鼠CENP-A基因，和人类细胞。该框编辑区域显示CENP-A的外显子1序列。以红色显示的序列n 是CRISPR/Cas9 的目标位点。所述d ouble -链BR EAK现场引入由CRISPR / Cas9被标记为DSB的网站CRISPR。

转染
单步骤方法使得吨他发电机密封的离子基于AID-条件性敲除小号各种脊椎动物细胞系。在该方法中，我们使用CRISPR / Cas9 -基于基因并靶向结合的一个AID质粒，其含有表达盒的整合为OsTIR1和靶蛋白用AID-标记（图4）。
注意：虽然我们使用聚乙烯亚胺或 Neon 转染系统转染ed细胞，但其他方法（如脂质转染）也可用于哺乳动物细胞系的转染。重要的是使用低毒性的转染方法，转染后不会抑制细胞生长。

图 4. 快速生成基于 AID 的条件敲除细胞系的单步方法。CRISPR / Cas9 -基于基因靶向被耦合到支付-plasmid整合到表达两种OsTIR1和AID-标记的目标蛋白质。使用三种不同的质粒同时转染亲本细胞：pAID 、用于pAID线性化的pX330和用于靶基因破坏的 pX330 。

转染后，Cas9 蛋白在目标基因座和pAID 中诱导 DNA 双链断裂。靶基因被pAID质粒整合和/或内部缺失/插入破坏。
共转染诱导pAID质粒整合到基因组中并破坏靶基因。OsTIR1 F74A和 AID 标记的靶蛋白由整合到基因组中的pAID质粒表达。

霓虹灯转染的鸡DT40细胞
DNA制备（一）
准备 5 µg pAID质粒、5 µg pX330 质粒用于pAID质粒线性化，以及 10 µg pX330 质粒包含用于基因靶向的sgRNA序列。将所有质粒添加到 130 µl R 缓冲液中以进行 Neon 转染。
注意：质粒 DNA 溶液的体积不应超过 10 µl。如果超过 10 µl，则应通过乙醇沉淀来浓缩 DNA 。

细胞制备 (bk)
将细胞转移到 15 毫升管中。
在室温 (RT) 下以 200 × g离心细胞 5 分钟。
通过抽吸去除介质。在室温下将细胞重悬在 1 ml 1× PBS 中。
将 2 × 10 5细胞转移到 15 - ml 管中。
以 200 × g离心细胞 5 分钟。在含有质粒的 130 µl R 缓冲液中重悬细胞。
转染的细胞通过使用氖转染系统（1电穿孔，400 V，5毫秒，6个脉冲）。
电穿孔后，立即重悬在10毫升细胞预温DT40培养MEDI嗯在38.5 ℃下（参见食谱）。
在 38.5 °C的 CO 2培养箱中，在 10 厘米培养皿中培养细胞 48 小时。
进行单-通过有限稀释克隆细胞。取 3 毫升、0.6 毫升和 120 微升细胞培养悬液，分别在含有 25 微克/毫升杀稻瘟素S 的40 毫升 DT40 培养基中稀释。将细胞分成两个 96 孔板（200 微升/孔），并在 CO 中培养2培养箱在 38.5 °C 下培养 1-2 周。
在 24 孔板中从每个孔和板中收获存活的细胞。

氖转染的人HeLa，将HeLa-S3，HT1080，和RPE1细胞
DNA制备（一）
准备 5 µg pAID质粒、5 µg pX330 质粒用于pAID质粒线性化，以及 10 µg pX330 质粒包含用于基因靶向的sgRNA序列。将所有质粒添加到 130 µl R 缓冲液中以进行 Neon 转染。
注意：质粒 DNA 溶液的体积不应超过 10 µl。如果超过 10 µl，则应通过乙醇沉淀来浓缩 DNA 。

细胞制备 (b- i )
用 PBS洗涤培养细胞并加入 1 ml 胰蛋白酶溶液。收获和收集细胞成15 -温育2分钟后毫升管中，在3 7 ℃下。
以 200 × g离心细胞 5 分钟。
通过抽吸去除介质。将细胞重悬在1 ml 1× PBS 中。
将 2 × 10 5细胞转移到 15 - ml 管中。
以 200 × g离心细胞 5 分钟。吸出 PBS 并在含有质粒的 130 µl R 缓冲液中重悬细胞。
转染的细胞通过使用氖转染系统（1电穿孔，400伏，20毫秒，1个脉冲）。
电穿孔后立即将细胞重悬在 10 ml 预热的哺乳动物细胞培养基中（参见食谱）。
在 CO 2培养箱中在 37 °C 下培养细胞 48 小时。
吸出介质，并添加10毫升新鲜的含培养基4微克/毫升（对于海拉-S3），8微克/毫升（对于HeLa细胞），或10μg/ ml的（对于HT1080和RPE1）杀稻瘟菌素S到细胞。
注意：Blasticidin S的有效浓度取决于细胞类型。最好确定每个细胞系的杀稻瘟素S的有效浓度。
在 37 °C的 CO 2培养箱中培养细胞 1-2 周。
注意：细胞有时在平板中生长良好，这使得很难分离单个菌落（细胞克隆）。在这种情况下，我们通常使用有限稀释为每次转染制作 1:3 和 1:9 稀释培养物。
分离单-细胞克隆，并将它们转移到24孔板中。

聚乙烯亚胺的转染的小鼠ES（馈线-免费E14tg2a）细胞
DNA制备（一）
准备 1 µg pAID质粒、1 µg pX330 质粒用于pAID质粒线性化，以及 2 µg pX330 质粒包含用于基因靶向的sgRNA序列。所有质粒添加到含有50微升20试管毫谷氨酸（pH为4.0，见配方小号）。

细胞制备（bu）
将 18 µl 1 mg/ml聚乙烯亚胺添加到另一个含有 50 µl 20 mM谷氨酸 (pH 4.0) 的试管中。
涡旋两个管。
再次混合并涡旋两个管子。
在室温下孵育 DNA 和聚乙烯亚胺混合物 10 分钟。
注意：在孵化期间，执行步骤 fk。
用 PBS洗涤培养的细胞并加入 1 ml 胰蛋白酶溶液。收获和收集细胞成15 -在37温育2分钟后ml管℃下。
以 200 × g离心细胞 5 分钟。
通过抽吸去除介质。将细胞重悬在 1 ml 1× PBS 中。
传送1×10 6细胞到15 -毫升管。
以 200 × g离心细胞 5 分钟。
吸出 PBS 并将细胞重悬在 300 µl 无血清 DMEM 培养基中。
将 DNA 和聚乙烯亚胺混合物添加到细胞悬浮液中。
涡旋样品。
在室温下孵育样品 30 分钟。
加入1ml 0.1％明胶溶液（见ř ecipe小号）到6孔板的所有孔中。
5 分钟后，吸出明胶溶液。
进行单-通过有限稀释克隆细胞。板用2ml小鼠ES培养基中的细胞在明胶包被的6孔板中，在不同的稀释度（例如，1：5，1:25，1：125，1：625 ，或更高）。
在没有Blastcidin S的情况下培养细胞24 小时。
吸出培养基并加入含有 10 µg/ml Blastcidin S 的新鲜小鼠 ES 培养基。
在 37 °C的 CO 2培养箱中培养细胞 5-7 天。
分离单-细胞克隆，并将它们转移到24孔板中。

故障排除
ñ Ø菌落后发现灭瘟素选择。
对杀稻瘟素的敏感性取决于细胞类型和物种。建议优化杀稻瘟素S的浓度，以选择所需的细胞系。
当没有的AID-标记的靶蛋白的表达被发现后杀稻瘟菌素选择，我们的建议是吨ö确认了支付的质粒序列没有移码和/或所述支付质粒稳定地整合在到基因组中。
当AID标记的蛋白的表达不用于目标基因的破坏补偿，我们的建议是吨ö保险丝一个在靶蛋白（C-末端或N-末端）的相反末端AID-标签。AID 标签融合偶尔会抑制目标蛋白的功能。

数据分析

每个菌落都应在 5 µM 5-Ad-IAA 或 DMSO（对照）存在的情况下进行培养。最好使用亲本细胞作为生长对照。在 5 µM 5-Ad-IAA 存在的情况下，基于 AID 的必要基因条件性敲除细胞表现出细胞死亡或生长缓慢。检查5-AD-IAA灵敏度之后，靶基因破坏必须通过DNA测序和免疫印迹来确认亭与针对各个目标蛋白的抗体分析，如所描述的（西村等人，2020）。

食谱

鸡DT40细胞培养基
DMEM 500 毫升
胎牛血清 50 毫升
鸡血清 5 毫升
青霉素小号treptomycin5毫升
10 mM 2-巯基乙醇 500 µl
哺乳动物细胞培养基
DMEM 500 毫升
胎牛血清 50 毫升
青霉素小号treptomycin 5毫升
小鼠胚胎干细胞培养基
DMEM 500 毫升
胎牛血清 50 毫升
L-谷氨酸 5 毫升
MEM NEAA 5 毫升
青霉素小号treptomycin5毫升
10 mM 2-巯基乙醇 500 µl
LIF 蛋白-含培养基 1 ml
0.1%明胶溶液
0.1% 明胶用 PBS 稀释。该溶液在 120 °C 下灭菌20 分钟。
1 毫克/毫升聚乙烯亚胺溶液
注意：聚乙烯亚胺溶液是根据PolyScience Inc. 中的协议使用的。
5-Ad-IAA 解决方案
5-AD-IAA我š溶解于DMSO中。我们通常使0.5 M或5毫米原液小号。这些解决方案一重新保存在-30 ℃下在黑暗中。储备溶液至少稳定一年。
20毫克lutamic一个CID溶液（pH 4.0）
谷氨酸以 20 mM的浓度在水中稀释。用NaOH将 pH 值调节到 4.0 。溶液通过过滤器纯化进行纯化。

致谢

这项工作是由日本学术振兴会KAKENHI授权号码，支持JP17K15041，JP 19K06611 ，并JP20K21423以KN; JP17H06167、JP16H06279 和 JP15H05972来自日本学术振兴会 (JSPS) 的TF ；和堀科学一个次艺术协会KN

利益争夺

没有利益冲突。

参考

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